聚合物蛋白微粒的制作方法
【专利说明】聚合物蛋白微粒
[00011本申请是申请号为201280056324.6的中国专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及延长释放的蛋白治疗剂的制备、组合物和用途。特别地，本发明涉及多 种聚合物包被的蛋白微球体的制备、组合物和用途，其用于蛋白质在基于水的或生理的环 境中随时间的延长和均匀的释放。
[0003] 发明背景
[0004] 施用给生物学目标(例如视网膜或肿瘤）或胃肠外施用的治疗性蛋白的延长释放 对于许多不同病况包括癌症、心血管疾病、血管病况、骨科疾病、牙科疾病、创伤、自身免疫 性疾病、肠胃失调和眼科疾病的治疗是期望的。用于受控地和延长地递送药物的生物相容 的和生物可降解的聚合物已使用了数十年。随着聚合物随时间的降解，治疗性药物缓慢释 放。
[0005] 对于眼内治疗剂，存在着对于延长释放的制剂的显著的、未被满足的医学需求，所 述制剂用于通过尽可能少的眼内注射来随时间有效地递送蛋白治疗剂。对于其他疾病，例 如癌症、炎性疾病和其他疾病，存在着对于包含蛋白治疗剂的改良的可植入的延长释放的 制剂的需求。
[0006] 本申请人已发现并于本文中公开和要求保护，制备和使用包含生物可降解聚合物 和治疗性蛋白的微粒的方法，所述微粒能够在延长的时间段内均匀地释放治疗有效量的治 疗性蛋白。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面，本发明提供了包含聚合物包被的蛋白的微粒。在一个实施方案中，所 述微粒具有约2微米至约70微米的直径。在一个实施方案中，所述微粒具有约15微米的直 径。
[0009] 在一个实施方案中，蛋白是抗原结合蛋白。在一个实施方案中，蛋白包含Fc结构 域。在一个实施方案中，蛋白包含受体结构域。在一个实施方案中，蛋白是抗体。在另一个实 施方案中，蛋白是受体-Fc融合蛋白。在另一个实施方案中，蛋白是陷讲型（trap-type)蛋 白，其包含同源受体片段和Fc结构域。在一个具体实施方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一 个实施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列。
[0010] 在一个实施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些实施方案中，聚合物选自 聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯 (卩1^^)、？1^^-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的？11^-€[-生育酚琥珀酸酯(？11^-TGPS)(PLGA-alpha-tocopheryI succinate esterified to polyethylene glycol 1000)、聚酐聚[I，6-二(对-羧基苯氧基）己烷KpCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸）（PHB-PVA)、 聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、 聚（乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羟丙基）甲基丙烯酰胺(聚 (HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β-R-苹果酸、磷脂-胆 固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DOPC/ PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖 水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊 精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚 丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚 物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚（乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇 酯)共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε_己内酯(PCL)或其衍生 物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中， 聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚原酸酯或其衍 生物或共聚物。
[0011] 在一个实施方案中，微粒包含小于10微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮层。在一 个实施方案中，微粒化蛋白核心用聚合物包被至少50%，也即，暴露不多于50%的微粒化蛋 白核心的表面。在一个实施方案中，用聚合物包被至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%、至少95%、至少99%或100%的微粒化蛋白核心的表面。
[0012] 在一个实施方案中，粒度大于10微米的微粒包含(a)小于10微米的微粒化蛋白核 心，其中所述蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性 MHC片段、受体-Fc融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种;和(b)聚合物 涂层，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:生物相容的聚合物、生物可降解聚合物、 生物可蚀解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D， L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α-生 育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_二(对-羧基苯氧基）己烷KpCPH)、聚(羟丁酸-共 羟基戊酸）（PHB-PVA)、聚乙二醇-聚（乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚（乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羟 丙基）甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、 聚β-R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂 酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐 或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝 素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮 氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸 酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚（乙二醇)/ 聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。
[0013] 在一个实施方案中，具有约15微米至约30微米的平均直径的微粒包含(a)约10微 米至约12微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物涂层，其中 所述聚合物是下述中的任一种或多种:PCL、PLGA、乙基纤维素和聚原酸酯，以及其共聚物和 衍生物。
[0014] 在一个方面，本发明提供多个微粒，其具有约2微米至约70微米的粒度，并且包含 约2微米至约30微米的微粒化蛋白核心和聚合物皮层。
[0015] 在一个实施方案中，蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗 体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fc融合 蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的任一种或多种。在一个实施方案中，蛋白包含Fe结 构域。在一个实施方案中，蛋白是抗体。在另一个实施方案中，蛋白是受体-Fe融合蛋白。在 另一个实施方案中，蛋白是陷阱型蛋白，其包含同源受体片段和Fe结构域。在一个具体实施 方案中，蛋白是VEGF-Trap蛋白。在一个具体实施方案中，VEGF-Trap蛋白包含SEQ ID NO: 1 中所示的氨基酸序列。
[0016] 在一个实施方案中，聚合物是生物相容的聚合物。在一个实施方案中，聚合物是生 物可蚀解聚合物。在一个实施方案中，聚合物是生物可降解聚合物。在一些实施方案中，聚 合物选自聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至聚乙二醇1000的PLGA-α-生育酚琥珀酸 酯(PLGA-TGPS)、聚酐聚[1，6_二(对-羧基苯氧基）己烷](pCPH)、聚（羟丁酸-共羟基戊酸） (PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯 酸酯(PAC)、聚（乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基氰基丙烯酸酯、聚-Ν-(2-羟丙基）甲基 丙烯酰胺(聚(HPM))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β-R-苹果 酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚 糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质 酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨 酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸 酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的聚原酸酯、聚（乙二醇)/聚(对苯二 甲酸丁二醇酯）共聚物，及其组合和共聚物。在一个实施方案中，聚合物是聚-ε_己内酯 (PCL)或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是PLGA或其衍生物或共聚物。在一 个实施方案中，聚合物是乙基纤维素或其衍生物或共聚物。在一个实施方案中，聚合物是掺 入潜在性酸的聚原酸酯。
[0017] 在一个实施方案中，多个微粒中的大多数微粒的微粒化蛋白核心用聚合物包被至 少50%，也即，暴露不多于50 %的微粒化蛋白核心的表面。在一个实施方案中，用聚合物包 被至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或100 %的微粒化蛋白核 心的表面。
[0018]在一个实施方案中，具有约2微米至约70微米的粒度的多个微粒包含(a)约2微米 至约30微米的微粒化蛋白核心，其中所述蛋白是抗体或抗体片段、受体或其可溶性片段、可 溶性T细胞受体片段、可溶性MHC片段、受体-Fe融合蛋白、陷阱型蛋白和VEGF-Trap蛋白中的 任一种或多种;和(b)聚合物皮层，其中所述聚合物是下列中的任一种或多种:生物相容的 聚合物、生物可降解聚合物、生物可蚀解聚合物、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚 乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-环氧乙烷延胡索酸、酯化至 聚乙二醇1000的PLGA-α-生育酚琥珀酸酯(PLGA-TGPS)、聚-ε-己内酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚酐聚[1，6_二(对-羧基苯氧基）己烷](pCPH)、聚(羟丁酸-共羟基戊酸） (PHB-PVA)、聚乙二醇-聚（乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚（乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、聚异丁基 氰基丙烯酸酯、聚-N_(2-羟丙基）甲基丙烯酰胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羟基丁酸酯(PHB)!-β-R-羟基链烷酸酯(PHA)、聚β-R-苹果酸、磷脂-胆固醇聚合物、2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂 酰胆碱/聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(D0PC/PEG-DSPE)/胆固醇、多糖、纤维素、乙基纤 维素、甲基纤维素、藻酸盐或酯、葡聚糖和葡聚糖水凝胶聚合物、直链淀粉、菊粉、果胶和瓜 尔胶、壳聚糖、壳多糖、肝素、透明质酸、基于环糊精(CD)的聚轮烷和聚类轮烷、聚天冬氨酸、 聚谷氨酸、聚亮氨酸、亮氨酸-谷氨酸共聚物、聚丁烯琥珀酸盐或酯(PBS)、明胶、胶原、纤维 蛋白、丝心蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚脒共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、掺入潜在性酸的 聚原酸酯、聚（乙二醇)/聚(对苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其组合和共聚物。
[0019] 在一个实施方案中，具有约2微米至约70微米粒度、具有约15微米至约30微米粒度 中值的多个微粒包含(a)具有约10微米至约12微米粒度中值的约2微米至约30微米的微粒 化蛋白核心，其中所述蛋白是VEGF-Trap蛋白；和(b)聚合物皮层，其中所述聚合物是下述中 的任一种或多种:？1^、？(^、？11^、乙基纤维素和聚原酸酯及其共聚物和衍生物。
[0020] 在一个方面，本发明提供了制备微粒的方法，所述微粒包含蛋白核心和聚合物皮 层。在一个实施方案中，制备的微粒具有约2微米至约70微米的直径，或约15微米至约30微 米的直径中值。在一个实施方案中，制备微粒的方法包括(1)获得蛋白颗粒；（2)在包含聚合 物和溶剂的溶液中悬浮蛋白颗粒;和(3)去除溶剂，其中形成了包含由聚合物皮层包被的蛋 白核心的微粒。
[0021 ]在一个实施方案中，步骤(1)的蛋白颗粒是微粒化的蛋白颗粒，其通过喷雾干燥包 含所述蛋白的溶液来获得。在一些实施方案中，蛋白溶液通过双喷嘴超声法、单喷嘴超声法 或电喷射来喷雾干燥。在一些实施方案中，产生的微粒化蛋白颗粒(其形成制备的微粒的核 心)具有约2微米至约30微米的直径、约10微米至约12微米的直径中值。
[0022] 在一些实施方案中，形成核心的蛋白是抗原结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结 合蛋白是抗体(例如IgG)或抗体片段、受体或其可溶性片段、可溶性T细胞受体片段、可溶性 M