在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征（prrs）病毒的有效疫苗接种的制作方法
【专利说明】在断奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)病毒的有效 疫苗接种
[0001] 本申请是申请日为2013年5月15日、申请号为201380025700. X、发明名称"在断 奶之前对抗猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)病毒的有效疫苗接种"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明是在动物健康领域中并且针对正极性RNA病毒、新颖RNA病毒以及其经修 饰的活的形式的感染性cDNA克隆，并且使用所述cDNA克隆构造疫苗，具体来说，猪疫苗。 更具体地说，本发明还提供了猪崽在断奶之前的安全并且早期疫苗接种，包括从出生之后 即刻（即仅1日龄或更小）到两周龄，在所有时间任选地与多价组合猪疫苗组合，例如二价 PRRSV/猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae ;M.hyo)疫苗、二价PRRSV/2型猪圆环病 毒（PCV2)疫苗以及三价PRRSV/M.hyo/PCV2疫苗，或简单地单价PRRSV疫苗。在所述条件 下对抗PRRS的早期疫苗接种提供保护性免疫的早发，所述保护性免疫在接种疫苗之后不 迟于约14天，即在生命第1天接种疫苗之后在第15天、在生命第7天接种疫苗之后在第21 天以及在生命第14天接种疫苗之后在不迟于约第28天出现。虽然本发明说明书提供了北 美PRRS病毒的"P129病毒株"的许多构造体（参见PCT/IB2011/055003和US 6, 500, 662)， 它们可作为高效疫苗，包括用于所述早期和安全使用，但是已经确定，所述保护性免疫的早 发（即在早在出生之后第1天给予的接种疫苗免疫之后约2周）也适用于其它北美和欧洲 卩1??病毒株的使用，例如在1]5 5,476,778、1]3 5,846,805、1]3 6,380,376、1]5 6,982，160以 及US 6, 197, 310中所述的那些。
【背景技术】
[0003] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)的特征在于大母猪和小母猪中的流产、死产以及其 它繁殖问题，以及幼猪中的呼吸道疾病。病原体是PRRS病毒（PRRSV)，动脉炎病毒科和巢 状病毒目的一个成员。巢状病毒是具有由单股正极性RNA组成的基因组的包膜病毒。正链 RNA病毒的基因组RNA实现了在遗传信息的储存和表达两方面的双重作用。没有DNA参与 巢状病毒的复制或转录。非结构蛋白从巢状病毒的基因组RNA直接转译为大多蛋白并且 随后被病毒蛋白酶裂解成朴素的功能蛋白。从所述基因组合成3' -同末端成套次基因组 RNA(SgRNA)并将其用作用于结构蛋白的转译的信使RNA。因此，巢状病毒基因组RNA的复 制是基因组复制与sgRNA合成的一个组合过程。
[0004] 在1980年代后期，几乎同时出现了所述病毒的两种不同基因型，一种在北美洲而 另一种在欧洲。PRRS病毒现在是几乎所有产猪国家的地方性病毒，并且被认为是影响全球 猪肉行业的经济上最重要疾病之一。另外，已经在中国和周边国家分离出毒性极强的基因 型，并且所述基因型一般与北美基因型相关。
[0005] 尽管在了解PRRSV的生物学方面取得了显著进展，但是所述病毒的控制仍然困 难。已证实本领域中动物的疫苗接种基本无效。PRRS通常在经免疫的畜群中重新出现，并 且大部分农场上PRRSV疫苗接种运动最终未能控制所述疾病。
[0006] 不受理论限制，使猪感染野生型PRRSV或用这种病原体的活减毒形式对其进行疫 苗接种不幸地仅仅引发非中和抗体的大量产生。在这个时间间隔期间，举例来说，产生了 仅有限数量的干扰素（IFN)-y分泌细胞。因此，PRRSV似乎本能地刺激以一贯丰富的体液 (基于抗体）免疫和可变并且有限但潜在保护性T辅助细胞（Th)I样IFN-Y反应为特征的 不平衡的免疫反应。最可能有助于适应性免疫的不平衡发展的PRRSV感染的一个特征是缺 乏足够的先天性免疫反应。通常，病毒感染的细胞分泌I型干扰素"IFN"（包括IFN-α和 IFN- β )，它保护邻近细胞不被感染。另外，所释放的I型IFN与一子组初始T细胞相互作 用以促进其转化成病毒特异性II型IFN(IFN- 丫）分泌细胞。相比之下，猪对PRRSV暴露的 IFN-α反应几乎不存在。病原体对IFN-α产生的如此低效的刺激预计将对宿主的适应性 免疫反应的性质具有显著影响，因为IFN-α上调IFN-γ基因表达。因此，前一种细胞因子 控制促进适应性免疫（即，T细胞介导的IFN-γ反应和峰值抗病毒免疫防御）的发展的主 要路径。
[0007] 就此而言，显然病毒感染中的先天性与适应性免疫之间的可能联系通过一种特殊 类型的树突状细胞发生，这种细胞具有产生大量I型干扰素的能力，并且它在T细胞功能 的极化中起关键作用。具体来说，一种罕见但显著类型的树突状细胞浆细胞样树突状细胞 (PDC)，也称为天然的IFN- α / β产生细胞，借助于其引起初始T细胞分化成IFN- γ分泌细 胞的能力而在抗病毒免疫中起关键作用。虽然稀有，但是PDC是IFN- α的强有力生产者，每 一个细胞都能够响应于病毒产生3-10 pgIFN-α。相比之下，单核细胞每一个细胞产生1/10 至Ij 1/5的IFN-α。已经描述了猪PDC的表现型和一些生物特性（萨默菲尔德（Summerfield) 等人，2003,免疫学（Immunology) 110:440)。最新的研究已经确定，PRRSV不刺激猪H)C 分泌IFN-α (卡尔扎达（Calzada)等人，2010,兽医免疫学与免疫病理学（Veterinary Immunology and Immunopathology)135:20)〇
[0008] 这个事实与在接种疫苗时外源地添加 IFN-α的观察结果的结合已被发现可以改 良PRRSV特异性IFN-γ反应的强度（W. Α.迈耶（W. A. Meier)等人，兽医免疫学与免疫病 理学（Vet. Immunol. Immunopath.) 102，第 299 页-第 314 页，2004)，突出了 IFN- α 在猪感 染这种病毒期间所起的关键作用。鉴于IFN-α对保护性免疫的发展的明显关键作用，确定 不同PRRS病毒储备液刺激和/或抑制IFN-α的产生的能力是重要的。因此，存在对用于 保护对抗PRRS的新的并且改良的经修饰活疫苗的迫切需要。如下所述，显然来源于新颖感 染性cDNA克隆、pCMV-S-P129-PK等的病毒的表现型不同于野生型Ρ129病毒或两种市售经 修饰活PRRS疫苗。不受理论限制，本发明提供促进对抗病毒的基于细胞的免疫反应并且定 义PRRS疫苗的新的并且有效的产生的疫苗。
【发明内容】
[0009] 在第一实施例中，本发明提供一种包括编码感染性RNA分子的DNA序列的经分离 多核苷酸分子，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，所述病毒经遗传修饰以使得作为一种 疫苗，它在猪科动物中引发对抗PRRS病毒的有效免疫保护性反应。在某些方面，本发明提 供一种如本文中所述的 DNA 序列，包括 SEQ ID NO. : 1、SEQ IDN0. :2、SEQ ID NO. :3、SEQ ID NO. :4或SEQ ID:NO:6,或与其至少70%-致，优选地与其80%-致，并且更优选地与其 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%-致的序列。
[0010] 在某些实施例中，本发明提供一种质粒，它包括如本文中所述的经分离多核苷酸 分子和能够在合适的宿主细胞中转录所述多核苷酸分子的启动子。在另一个实施例中，质 粒的北美或中国PRRS编码序列在本文中进一步编码一或多种可检测的异源抗原表位。本 发明提供一种包括本文中所述的质粒的经转染宿主细胞。
[0011] 在另一方面，本发明提供一种用于保护猪科动物不被PRRS病毒感染的疫苗。所述 疫苗可以包括由感染性RNA分子编码的北美或中国PRRS病毒、所述感染性RNA分子或质 粒，其中每一者都由本文中所述的经分离多核苷酸分子编码。在又另一方面，所述疫苗包括 含有本文中的多核苷酸的病毒载体。本文中所述的疫苗可以任选地包括兽用可接受的疫苗 载剂。在一个重要方面，所述疫苗具有相比于野生型P129PRRS病毒有所降低的干扰素 -α 抑制作用（参见ATCC 203488、203489、美国专利第6,500,662号）。
[0012] 在一个实施例中，本发明提供包括多核苷酸分子的诊断试剂盒，它区分（所谓的 DIVA测试）自然感染有PRRS病毒的野外病毒株的猪科动物与接种本文中所述的经修饰活 疫苗的猪科动物。
[0013] 在其它实施例中，本发明提供一种保护猪科动物不感染PRRS病毒的病毒株的方 法，包括向所述动物投与免疫保护量的本文中所述权利要求书的疫苗。
[0014] 本发明的其它并且优选的实施例包括一种经分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRS)或一种编码所述病毒的多核苷酸序列，其中由ORFla编码的蛋白质选自由含有以 下氨基酸序列中的任一者的蛋白质组成的群组，其中带下划线的残基被认为是新颖的： AMANVYD(SEQ ID NO:9) ；IGHNAVM(SEQ ID NO:12) ；TVPDGNC(SEQ ID NO:15) ；CffffYLFD(SEQ ID NO:18) ；HGVHGKY(SEQ ID N0:21) ；AAKVDQY(SEQ ID N0:24) ；PSATDTS(SEQ ID N0:27)； LNSLLSK(SEQ ID NO:30) ；APMCQDE(SEQ ID NO:33) ；CAPTGMD(SEQ ID NO:36) ；PKVAKVS(SEQ IDN0:39);AGEIVGV(SEQIDN0:42);ADFMPEK(SEQIDN0:45);W&QTPILGR(SEQID NO: 48)。在本发明的另一优选实施例中，本发明提供一种经分离的北美或中国PRRS，它含有 从ORFla编码的蛋白质内的以上所鉴别序列中的任一者，包括这些所鉴别序列的任何组合 (2、3、4......直到 17)。
[0015] 本发明进一步提供一种经分离猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS)，其中其由ORFla 编码的蛋白质选自由含有以下中的任一者的那些氨基酸序列组成的群组：AMV(参见SEQ ID NO:9) ；HNA(#BSEQ ID NO: 12) ；PDG(#BSEQ ID NO: 15) ；WYL(#BSEQ ID NO: 18)； VHG (参见 SEQ ID NO:21) ;KYD (参见 SEQ ID NO:24) ;AJ：D (参见 SEQ ID NO:27) ;SLL (参 见 SEQ ID N0:30) ;M￡Q(参见 SEQ ID N0:33) ;PJ：G(参见 SEQ ID N0:36) ;VAK(参见 SEQ ID NO :39) ;EIV (参见 SEQ ID NO :42) ;FMP (参见 SEQ ID NO :45);以及 PIL (参见 SEQ ID N0:48)，包括这些所鉴别序列的任何组合（2、3、4……直到17)。
[0016] 在另一优选实施例中，本发明提供一种经分离北美或中国PRRS，其中不考虑编码 病毒的多核苷酸或自其编码的蛋白质中在任何指向的任何其它特定的核苷酸或氨基酸序 列位置的一致性，ORFla病毒蛋白含有：
[0017] (a)在指定序列中的以下特定氨基酸中的任一者，
[0018] 在氨基酸序列AP(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0019] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0020] 在氨基酸序列PSG(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0021] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0022] 在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ;
[0023] 在氨基酸序列KYD (参见SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0024] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;
[0025] 在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0026] 在氨基酸序列M￡Q(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ;
[0027] 在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0028] 在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;
[0029] 在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0030] 在氨基酸序列FNP (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;以及
[0031] 在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I，包括这些所鉴别序列的任 何组合（2、3、4……直到17)，或
[0032] (b)含有在任何其它北美或中国PRRS病毒的对应于如上所指定的3-残基序列的 指定3-残基ORFla肽序列中的所述特定带下划线的单一氨基酸，这是考虑到所述其它特定 的3-残基氨基酸序列可以显示一个或两个附加氨基序列改变，但是仍然认为对应于以上 所指定的序列。为了本发明的这个实施例，"对应"意指可以使用如在赫尼霍夫（Henikoff) 等人美国国家科学院院刊（Proc Natl. Acad. Sci.，USA)，89,第10915页-第10919页，1992 中所述的BLOSUM算法最佳地比对相对序列。
[0033] 在本发明的另一个优选实施例中，提供一种经分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRS)，其中其由ORFla编码的蛋白质具有含有变异（a)、（b)、（c)以及（d)中的一或多者 的氨基酸序列，其中每一种所述变异定义如下：
[0034] 变异（a)，
[0035] 在氨基酸序列AP(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0036] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0037] 在氨基酸序列PQG(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0038] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0039] 在氨基酸序列VHG(参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H ;或变异（a)的任何子组； [0040]变异（b)，
[0041] 在氨基酸序列KYD (参见SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0042] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;
[0043] 在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0044] 在氨基酸序列M￡Q(参见SEQ ID NO:33)内的氨基酸C ;或变异（b)的任何子组；
[0045] 变异（c)，
[0046] 在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0047] 在氨基酸序列VAK(参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A ;或变异（c)的任何子组； 以及
[0048] 变异（d)，
[0049] 在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0050] 在氨基酸序列FM3 (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;
[0051] 以及在氨基酸序列PIL (参见SEQ ID NO :20)内的氨基酸I ;或其变异（d)的任何 子组。
[0052] 所述PRRS病毒可以进一步含有在变异（a)中所鉴别的五个氨基酸序列中的两个 或更多个，和/或在变异（b)中所鉴别的四个氨基酸序列中的两个或更多个，和/或在变异 (c)中所鉴别的两个氨基酸序列，和/或在变异（d)中所鉴别的三个氨基酸序列中的两个或 更多个。
[0053] 本发明还提供了一种能够直接转染合适的宿主细胞并且从如此转染的合适的宿 主细胞表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS)的质粒，所述质粒包含：(a)编码感染性RNA 分子的DNA序列，所述感染性RNA分子编码PRRS病毒，和（b)能够转录所述感染性RNA分 子的启动子，其中由所述病毒的ORFla编码的蛋白质具有含有以下的氨基酸序列：
[0054] (1)在氨基酸序列MV(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0055] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0056] 在氨基酸序列P2G(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0057] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0058] 在氨基酸序列VHG (参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或其任何子组；和/或
[0059] (2)在氨基酸序列KYD(参见SEQ ID NO:24)内的氨基酸V ;
[0060] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;
[0061] 在氨基酸序列SLL(参见SEQ ID NO:30)内的氨基酸L ;
[0062] 在氨基酸序列M￡Q (参见SEQ ID NO: 33)内的氨基酸C，或其任何子组；和/或
[0063] (3)在氨基酸序列PIG(参见SEQ ID NO:36)内的氨基酸T ;
[0064] 在氨基酸序列VAK (参见SEQ ID NO: 39)内的氨基酸A，或其任何子组；和/或
[0065] (4)在氨基酸序列EIV(参见SEQ ID NO:42)内的氨基酸I ;
[0066] 在氨基酸序列FM3 (参见SEQ ID NO:45)内的氨基酸N ;
[0067] 在氨基酸序列PIL(参见SEQ ID NO:48)内的氨基酸I ;或其任何子组。
[0068] 应了解，ORFla编码包含蛋白酶功能的多蛋白，并且ORFlb编码包含复制酶（RNA聚 合酶）和解螺旋酶功能的多蛋白。关于从PRRS的各种ORF(开放阅读框）编码的蛋白质的 功能的附加信息可见于例如美国专利第7, 132, 106号中。关于0RF7和其它开放阅读框的 功能，还参见美国专利第7, 544, 362号。如在本领域中应了解，预计ORFl编码的蛋白质具 有已知和未知的附加功能，并且适用于本发明实践中的新颖氨基酸改变通过其对ORFl编 码的蛋白质的任何一种特定功能的作用而不受限制。
[0069] 在其它优选实施例中，所述质粒含有一种启动子，它是能够允许目标真核细胞中 的DNA发射的真核启动子，或能够指导质粒的体外转录的原核或噬菌体启动子。本发明类 似地提供一种产生PRRS病毒的方法，所述方法包含用适当的质粒转染合适的宿主细胞并 且获得由转染细胞产生的PRRS病毒。
[0070] 因此，在特定并且优选的实施例中，本发明提供一种包含编码感染性RNA分子的 DNA序列的经分离多核苷酸分子，所述感染性RNA分子编码北美PRRS病毒，其中所述DNA序 列选自由以下组成的群组：
[0071] (a) SEQ ID NO: 6 ;
[0072] (b)与（a)的DNA序列至少85%-致的序列，其中其由ORFla编码的蛋白质具有 含有以下的氨基酸序列：
[0073] 来自组（b)(1)
[0074] 在氨基酸序列AP(参见SEQ ID NO:9)内的氨基酸N ;
[0075] 在氨基酸序列HM(参见SEQ ID NO: 12)内的氨基酸N ;
[0076] 在氨基酸序列P2G(参见SEQ ID NO: 15)内的氨基酸D ;
[0077] 在氨基酸序列WIL(参见SEQ ID NO: 18)内的氨基酸Y ;
[0078] 在氨基酸序列VHG (参见SEQ ID NO: 21)内的氨基酸H，或其任何子组；和/或
[0079] 来自组（b)(2)
[0080] 在氨基酸序列KYD (参见SEQ ID NO: 24)内的氨基酸V ;
[0081] 在氨基酸序列AID(参见SEQ ID NO:27)内的氨基酸T ;