猪红斑丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、副猪 嗜血杆菌（Haemophilus parasuis)、钩端螺旋体属（Leptospira spp·)、猪肺炎支原 体（Mycoplasma hyopneumoniae)、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis)、猪滑液支原体 (Mycoplasma hyosynovia)、出血败血性巴斯德氏菌（Pasteurella multocida)、猪霍乱沙 门氏菌（Salmonella choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium)、类马链 球菌（Streptococcus equismilis)以及猪链球菌（Streptococcus suis)。编码来自上述 猪病原体的抗原表位的核苷酸序列是本领域中已知的并且可以在万维网上从公共基因数 据库获得，例如（美国）国家生物技术信息中心的基因库。
[0250] 本领域的普通技术人员将从本申请的全部内容（包括详细描述）清楚本发明的其 它特征和变化形式，并且所有所述特征打算作为本发明的方面。类似地，本文中所述的本发 明特征可以重新组合成附加实施例，这些附加实施例也打算作为本发明的方面，这与上文 是否具体提到特征组合作为本发明的方面或实施例无关。此外，只有本文中描述为对本发 明至关重要的所述限制才应该如此看待；缺乏本文中尚未描述为至关重要的限制的本发明 变化形式打算作为本发明的方面。应该清楚，本发明可以与以上说明和实例中具体描述的 不同的方式来实践。
[0251] 鉴于以上传授内容，本发明的许多修改和变化形式是可能的并且因此，在本发明 的范围内。
[0252] 以下实例旨在说明但不限制本发明。
[0253] 实例 I
[0254] PRRSV分离株P129对PK-9细朐的话应和减毒
[0255] 在1995年在印地安那州普渡大学（Purdue University)的动物疾病诊断实验室， 从病猪中分离出了毒性PRRS分离株P129。使来自此猪的血清样品在高健康状态的猪中传 代一次以扩大血清和肺匀浆储备液。从血清和肺匀浆中提取病毒RNA并将其用于测定P129 第〇代病毒的全基因组共同序列。RNA先用无规六聚物预致敏并用于合成cDNA。使用高保 真度（校正）PCR，在三个重叠碎片中扩增基因组。来自三个单独的PCR反应（每一个基因 组区段）的PCR产物被T/A克隆并且用于DNA测序以产生全长基因组共同序列（参见SEQ ID N0:1)〇
[0256] 使用用于DNA测序的含有P129第0代的相同猪血清的等分试样来感染原代猪肺 泡巨噬细胞（PAM)细胞。通过0. 1微米针筒过滤器过滤来自PAM感染的子代病毒（第1代） 并将其用于感染PK-9细胞。
[0257] PK-9细胞是通过用编码猪⑶163基因和新霉素抗性基因的缺失版本的质粒稳定 地转染PK0809猪肾细胞系得到的转基因细胞系。先前已经描述了 PK-9细胞系的构造和特 征的细节。
[0258] 使来自PAM细胞的第1代病毒适应在PK-9细胞上生长是困难的，并且需要用 多个平行谱系尝试若干次。通过具有复孔的免疫荧光法，使用对病毒核衣壳蛋白具有特 异性的FITC结合的单克隆抗体SD0W17(南达科他州布鲁金斯的农村技术公司（Rural Technologies Inc, Brookings South Dakota))来监测感染。早期传代产生了一些小焦点， 但是未产生足以起始新鲜单层的感染的无细胞病毒粒子。这些传代是通过用Accutase (胰 蛋白酶替代物）处理被感染的单层并且再播种于含新鲜培养基的多个孔中的细胞中来实 现的，所述培养基添加或未添加未感染的PK-9细胞。在若干次所述传代之后，一些谱系显 示出荧光焦点的频率和大小清楚增加。这些当中的一些已经获得了使用无细胞病毒体液 传代的能力。通过传代17次（1次在PAM细胞上，16次在PK-9上），可以使用来自先前传 代的无细胞体液的稀释液可靠地维持一个谱系，并且所述谱系在几天内引起整个单层的感 染。所述病毒在任何传代水平都不引起对PK-9细胞的细胞病变效应。在病毒第17代，从 被感染的PK-9细胞提取RNA并将其用于构造感染性cDNA克隆。
[0259] 实例 2
[0260] P129-PK第17代的感染件cDNA克降的构诰
[0261] 使用如先前所述的骨架质粒构造 P129-PK第17代病毒的感染性cDNA克隆。通过 在重叠区中含天然存在的独特限制性核酸内切酶位点的三个重叠区段中逆转录和PCR来 扩增病毒基因组。对来自三个单独的PCR反应的产物进行克隆和测序，并且比对以产生每 个基因组区段的共同序列。如果指定区段的三个克隆产物中没有一个匹配关于那个区段所 预测的共同氨基酸序列，那么通过亚克隆和/或定点诱变来修饰这些克隆中的一个直到它 匹配所预测的共同氨基酸序列为止。使用标准克隆技术和限制性核酸内切酶位点连接三个 基因组区段和质粒骨架。命名为PCMV-S-P129-PK17-FL的所得全长克隆当被转染到PK-9 细胞中时是感染性的。这种感染性cDNA克隆的序列给出在SEQ ID N0:2中。所述基因组 基本上与构造它的第17代病毒一致，具有可靠末端，并且相对于第17代的共同序列缺乏任 何插入或缺失。在这种感染性cDNA克隆的病毒基因组内不存在工程改造限制性位点或其 它目标改变。
[0262] P129第0代的全基因组共同序列与感染性克隆pCMV-S-P129-PK17-FL的基因组 序列之间的核苷酸和氨基酸差异单独地列在表6中。表6包括由于基因组位置所造成的 所有核苷酸差异和所得氨基酸差异。这些突变的子组导致从IFN抑制性（第0代）到IFN 非抑制性（来源于第17代感染性cDNA克隆的所有病毒）的表现型改变。表7概述了由于 PRRSV开放阅读框（ORF)或非结构蛋白（nsp)所造成的核苷酸、氨基酸以及非保守氨基酸差 异。为了表7,以下各组氨基酸是在被认为保守的那些当中：[K、R]、[D、E]、[L、I、V、A]以 及[S、T]。
[0263] 实例 3
[0264] P129-PK第17代中的缺失突夺体
[0265] 将基因组的两个区域中的缺失工程改造到感染性cDNA克隆 PCMV-S-P129-PK17-FL中，从而产生五个遗传修饰感染性克隆。
[0266] 经历修饰的基因组的一个区域是位于核衣壳蛋白（由PRRSV ORF 7编码）的氨基 酸位置41-47的核定位序列（NLS)。制作了两种类型的缺失。先前已经在另一种PRRSV感 染性克隆的情况下描述了这些缺失。氨基酸残基41-49的野生型序列是PG……KN。在突 变体"d43/44"（也称为"PG-KS"）中，赖氨酸残基43和44缺失并且天冬酰胺残基49变 成了丝氨酸。在突变体"(143/44/46"（也称为"PG-S-KS"）中，赖氨酸残基43、44和46缺 失并且天冬酰胺残基49变成了丝氨酸。来源于并有这些缺失的pCMV-S-P129-PK17-FL的 感染性克隆分别是 pCMV-S-P129-PK17-d43/44 和 pCMV-S-P129-PK17-d43/44/46。参见美国 专利第7, 544, 362号。
[0267] 经历修饰的基因组的第二区域是在ORFla内的nsp2的高变区中。131个氨基酸 (393个核苷酸）的缺失先前已经在另一种PRRSV感染性克隆的情况下有所描述。来源于并 有这种缺失的 PCMV-S-P129-PK17-FL 的感染性克隆是 pCMV-S-P129-PK17-nsp2。
[0268] 在pCMV-S-P129-PK17-FL骨架内还产生了组合了 NLS和nsp2缺失的感染性克隆， 并且这些感染性克隆被命名为 pCMV-S-P129-PK17-nsp2-d43/44 和 pCMV-S-P129-PK17-nsp 2-d43/44/46〇
[0269] 实例 4
[0270] 病毒在PK-9细朐h.的产牛和牛长
[0271] 将实例3中所述的六种感染性克隆转染到PK-9细胞中以产生如表1中所示的 六种病毒。通过使用脂染胺2000将环状质粒直接转染到PK-9细胞中从这些感染性克隆 产生病毒。在转染之后，使回收的病毒在PK-9细胞上再次连续传代以便进一步增加滴度 并且减弱毒性。制作储备液作为候选疫苗进行体外测试和体内评估。在来源于非修饰的 PCMV-S-P129-PK17-FL感染性克隆的P129-PK17-FL病毒的情况下，培养所述病毒直到达到 总共52次从猪传代为止。在第24代（SEQ ID NO: 3)和第52代（SEQ ID NO:6)，对这种病 毒的全基因组进行测序。
[0272] 实例 5
[0273] 来源于抑制IFN-α诱导的能力有所降低的P129-PK第17代感染件CDNA克降的 病毒
[0274] 病毒和细胞.使MARC-145和ST细胞在补充有5 %胎牛血清（FBS)和抗生素 (50 μ g/ml庆大霉素、100 UI青霉素以及100 μ g/ml链霉素）的改良伊格尔培养基（modified Eagle's medium ;MEM)中生长。使猪肺泡巨噬细胞ZMAC-I细胞在补充有10 % FBS的 RPMI-1640中生长。通过在改良伊格尔培养基中以多个0. 01感染汇合ST细胞单层来制备 TGE病毒株Purdue。Ih后去除病毒接种物并且在补充有2. 5% FBS的MEM中在37°C下在 5% 0)2氛围中培育细胞。在观察到80%细胞病变效应之后，通过冷冻和解冻细胞单层释放 病毒。使TGE病毒储备液在4°C下在3, 500rpm下离心15分钟并且储存在-80°C下直到使 用为止。病毒储备液（来自PK-9细胞）如下：P129-PK-FL和P129-PK-dnsp2-d43/44/46 是在第8/25代（8来自感染性克隆，25来自猪）。其它四种病毒（P129-PK-d43/44、 P129-PK-d43/44/46、P129-PK-dnsp2 以及 P129-PK-dnsp2-d43/44)是在第 21/38 代。各 种PRRS病毒的操作储备液通过在ZMAC-I细胞上进行单次传代来制备，除了市售疫苗 Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP根据制造商的说明书复原并且直接用于感染。
[0275] 猪PBMC的分离.用汉克氏（Hank's)稀释新鲜肝素化静脉血并且通过菲科尔-泛 影钠（Fi C〇ll-Hypaque) 1077(西格玛）梯度密度离心来分离PBMC。在汉克氏中洗涤两次之 后，将细胞悬浮于含L-谷氨酰胺（美的泰克（Mediatech))的RPMI培养基中，所述培养基 补充有5%胎牛血清（吉毕科（6让〇〇))、1001]/1111青霉素、0.11^/1111链霉素、11111丙酮酸钠、 I X非必需氨基酸（美的泰克）lOOU/ml庆大霉素以及250mM 2-巯基乙醇（西格玛）。
[0276] 猪浆细胞样树突状细胞的纯化.猪浆细胞样树突状细胞的纯化如先前所述（卡尔 扎达?诺瓦（Calzada-Nova)，已提交）进行，并且是基于这些细胞对⑶4和⑶172的特征 表达（萨默菲尔德等人，2003)。简单来说，将新鲜猪PBMC悬浮于含0. 5% BSA的PBS中并 且用最佳量的识别猪CD172 (74-22-15, VMRD)的mAb标记。在洗涤一次之后，然后使细胞与 结合到PE(南方生物技术（Southern Biotech))的第二山羊抗小鼠抗体一起培育并且在洗 涤之后，与FITC标记的抗⑶4 (74-12-4, VMRD) -起培育。在反射细胞分类器（iCyt)上对 PDC进行分类，在⑶47⑶172?群体上设置分类门（sort gate)。在分类之后，通过再分析证 实细胞纯度。在所有情况下，纯度是>95%。
[0277] 细胞因子分泌测量结果的分析.用不同刺激物刺激PBMC或H)C 16小时（37°C， 5%C02)或模拟刺激。在培育之后，使用用可商购的单克隆抗体（抗猪IFN-α mAb K9和F17) 制备的夹心ELISA分析上覆刺激细胞的培养基中IFN-a的存在。简单来说，通过在4°C下 培育过夜，接着用补充有5%胎牛血清的RPMI培养基封闭，用抗猪IFN-a mAb F17(PBL实 验室）涂布Immulon II板（戴雷泰克公司（Dynatech Inc·))。1小时后，丢弃培养基并且 将五十微升有待测试的上清液一式两份地添加到分析孔中。在1小时培育之后，分析孔洗 涤4次并且然后依次用生物素标记的抗猪IFN- a mAb K9 (PBL实验室）、HRP结合的链霉亲 和素（扎美德实验室（Zymed Laboratories))以及TMB底物（KPL)培育。用ELISA读板仪 测定光密度。
[0278] 来源于P129-PK第17代感染性⑶NA克隆的病毒缺乏抑制IFN- α诱导的能力。使 用猪肺泡巨噬细胞细胞系ZMAC-1，从一组四种不同PRRS野生型病毒分离株（Ρ3412、Ρ129、 IND5、NADC20)制备操作病毒储备液。其它储备液也从前两种野生型病毒的衍生物制备，这 些衍生物通过在PK-9、FK. D4或MARC-145细胞中反复传代已经适应于在细胞培养液中生 长。四种野生型分离株中的三种（P129、IND5、NADC20)容易地并且有效地在ZMAC-I细胞中 生长到约l〇 7TCIDM/ml的滴度，而P3412野生型分离株到达仅仅IO5TCID mAiI的滴度。值得 注意地，在ZMAC-I细胞系中制备的P129病毒的储备液的滴度达到了在PK-9或MARC-145 细胞（病毒已适应这些细胞）中获得的滴度的10倍。这些病毒刺激PBMC分泌IFN-α的 能力的检查揭示了有一个例外（分离株Ρ3412克隆C)，这些细胞响应于其暴露于所测试的 PRRS病毒储备液中的任一者分泌出极少量（<50pg)的IFN-α，相比于相同细胞由于其暴露 于猪冠状病毒传染性胃肠炎病毒（TGEv)所产生的IFN-a的大量分泌（17, 540pg)，这是可 忽略的。
[0279] PRRSV不仅不能够刺激猪PBMC产生IFN- a，而且主动地抑制其产生。通过测量在 存在或不存在PRRSV的情况下，PBMC响应于暴露于TGEv所分泌的IFN- a的量来测定PRRSV 储备液的抑制作用。如表2中所示，经测试的所有4种野生型PRRS病毒分离株以及所有细 胞培养液适应的衍生物都展现出对PBMC对TGEv的IFN-a反应的强烈抑制作用（>80% )。 进行了对来源于感染性cDNA克隆（pCMV-S-P129-PK17-FL)，包括全长P129-PK-FL病毒和 若干基因工程改造的缺失突变体的一组病毒储备液的分析。如表3中所示，当与亲本野生 型分离株P129(第1代）的强烈抑制作用（95% )相比时，P129-PK-FL病毒和所有缺失突 变体展现出在PBMC中抑制TGEv诱导IFN-a的能力明显有所降低。为了进一步评估这些 病毒的IFN-a表现型，随后的实验集中于进行P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒、亲本 P129野生型病毒株和/或由勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim)生产的两种市售经 修饰活PRRSV疫苗（Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP)之间的直接比较。还测 试了附加低传代参考分离株NVSL-14。如表4中所示，在四个独立实验中，P129-PK-FL和 P129-PK-d43/44展现出明显低于亲本P129病毒、两种Ingelvac减毒病毒株或参考病毒株 的IFN-α抑制作用。在一个例子中，与P129-PK-FL或P129-PK-d43/44病毒的协同感染促 使TGEv的IFN-a反应明显增强。
[0280] 表2中所示的结果显示适于在细胞培养液中生长的野生型PRRS病毒和衍生物的 干扰素- a抑制作用。所指定的PRRS病毒储备液在ZMAC-I细胞中生长并且使用ZMAC-I 细胞测定这些新产生的储备液的滴度。通过ELISA测定在存在或不存在TGE病毒的情况 下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞的培养物上清液中所存在 的IFN- a的量。*仅对TGEv起反应。
[0281] 表3中所示的结果证明了适于在表达⑶163的PK-9细胞中生长的野生型PRRS病 毒P129和其基因工程改造衍生物的干扰素-a抑制作用。通过ELISA测定在存在或不存 在TGE病毒的情况下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞（PBMC) 的培养物上清液中所存在的IFN-a的量。 na=不适用；*仅对TGEv起反应。
[0282] 表4示出了 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒相比于野生型P129病毒和 PRRSIngelvac疫苗有所降低的干扰素-α抑制作用。通过ELISA测定在存在或不存在TGE 病毒的情况下，暴露于指定PRRS病毒储备液18小时的猪外周血单个核细胞（PBMC)的培养 物上清液中所存在的IFN-α的量。 na=不适用；*仅对TGEv起反应。
[0283] 由PBMC响应于其暴露于TGEV分泌的大量IFN-α主要来源于包含小于0.3% PBMC群体的细胞子组。这种罕见的但是重要的细胞子组由浆细胞样树突状细胞（PDC) 构成，它们由于特征性浆细胞样形态而接受这种名称。为了进一步检查P129-PK-FL和 P129-PK-d43/44病毒的IFN-a表现型，进行了一系列实验，这些实验类似于上文所述的那 些实验，除了采用从PBMC中新鲜分离到>95%纯度的H)C。如图1所示，这一系列的实验证 实了 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44病毒引起的对TGEV诱导IFN-α的抑制可忽略不计。 此外，在一个实验中，观察到了对PDC响应于P129-PK-FL和P129-PK-d43/44 PRRS病毒的 TGEV介导的IFN-α诱导的明显强化作用。相比之下，Ingelvac PRRS MLV病毒展现出对 IFN-α反应的强烈抑制作用，如图1所示。
[0284] 实验部分中所述的结果揭示了 P129-PK-FL和P129-PK-d43/44 PRRS病毒以及 PCMV-S-P129-PK17-FL感染性cDNA克隆的其它衍生物在被感染的PBMC或PDC细胞中抑制 TGEV诱导IFN-α的能力大大降低。这与野生型（低传代）PRRS病毒和两种市售经修饰活 病毒疫苗（Ingelvac PRRS MLV和Ingelvac PRRS ATP)所观察到的IFN抑制作用形成了鲜 明的对比。假设这些细胞在介导抗病毒感染的先天性免疫中所起的主要作用，P129-PK-FL 和P129-PK-d43/44最低限度地抑制H)C的这种重要功能这一观察结果是潜在地显著的。
[0285] 还应该指出，本发明提供适于在重组地表达⑶163受体的受纳细胞上生长的临床 上有效的市售疫苗病毒，并且所述病毒和疫苗不取决于历史"猿猴细胞"培养技术，也不在 任何时候用历史"猿猴细胞"培养技术发展。具体参见美国专利7, 754, 464。
[0286] 实例 6
[0287] 候诜痔苗的安全件和功效
[0288] 为了评估其作为对抗PRRS的疫苗的安全性和功效，在幼猪呼吸道疾病模型 中评估来源于 PCMV-S-P129-PK17-FL 感染性 cDNA 克隆、P129-PK-FL(第 7/24 代）、 P129-PK-d43/44(第 17/34 代）以及 P129-PK-d43/44/46(第 17/34 代）的病毒中的三种。 这些病毒的来源示出在图8中，并且实验设计（处理组）列在表5中。使用低传代毒性PRRSV 分离株NADC20在7周龄（疫苗接种之后四周）进行异源攻击。对照处理组包括模拟疫苗 和市售 PRRS 疫苗 Ingelvac MLV。
[0289] 非处理（NT)组如下：NT1猪是用于监测来源猪的健康状态的哨兵。将它们分开圈 养并且在PRRSV攻击之前进行尸体剖检。NT2猪是分开圈养在两圈接种疫苗的猪之间的猪 圈中的接触对照组，对于T02到T05中的每一个，每个处理组总共两个接触对照组。NT3猪 是每个猪圈与接种疫苗的猪一起圈养的接触对照组，每个处理组（T01到T05)总共两个接 触对照组。只有NT3猪被分配到TOl组。