结合MAP激酶p38的化合物的制作方法
【专利说明】结合MAP激酶P38的化合物
[0001] 本发明涉及化合物及其用途。具体地，其涉及肽及其在抑制分裂素激活蛋白激酶 ρ38α (简称MP激酶ρ38α)和治疗炎性病症中的用途。
[0002] 为免生疑问，多数情况下，本说明书全文将使用术语MAP激酶ρ38α。然而，所述酶还 已知为以下习惯名称和术语:分裂素激活蛋白激酶14(简称MAP激酶14和MAPK 14)和IUB分 类EC 2.2.11.24。其还有其他名称:细胞因子抑制性抗炎药物结合蛋白（简称CSAID-结合蛋 白和CSBP )，MAP激酶MXI2，MAX-相互作用蛋白2，及应激激活蛋白激酶2a (简称SAPK2a)。所述 酶还具有Uniprot标识符Q16539。本说明书中有时还将该酶称为ρ38α。
[0003] 本说明书中，明显地出版前的文件的列表或讨论不应必然视为承认所述文件是现 有技术的一部分或是公知常识。
[0004] MAP激酶ρ38α在炎症中起重要作用，其一直是基础研究和药物发现中大量工作的 主题。Schieven(2009)Curr · Top .Med · Chem. 9，1038-1048概述了集中于 ρ38 激酶在炎症中的 作用的生物学。Ρ38激酶通过先天免疫系统的细胞调控关键炎症介质的产生，包括TNFcuIL-1β和C0X-2。另外，ρ38还充当细胞因子例如TNFa的下游，介导它们的部分效果。近来，已发现 ρ38在响应T细胞包括Thl7和调节性T细胞中起作用。与其在炎症中的重要作用一致，最近的 证据表明，细胞可利用各种反馈机制来调控和维持P38信号传导。由p38激酶调控的生物过 程表明了对抑制剂的各种潜在迹象和复杂性程度，这已证明是对围绕该目标的药物发现工 作的挑战。
[0005] Karcher & Laufer(2009)Curr.Top.Med.Chem.9,655-676说明，自 1993年以来，已 对大量的P38MAP激酶抑制剂进行了表征。除了众所周知的吡啶基咪唑以外，已鉴定了多种 新的支架，但可能是由于高毒性或选择性差，只有少数进入了 II期临床研究。根据Karcher & Laufer，为了获得安全的药物特性，高效能、边缘性的(marginal)CYP450(细胞色素 P450) 相互作用和毒性，以及高水平的选择性将是可取的。
[0006] 与MAP激酶ρ38α的核底物MEF2A和激活剂MKK3b上的对接位点（docking site)复合 的MAP激酶ρ38α的晶体结构是已知的（Chang et al(2002)Cell 9,1241-1249)。
[0007] 以前的小分子抑制剂对MAP激酶ρ38α缺乏选择性，并在人类临床试验中有一系列 毒性，包括明显的肝毒性。据本发明人所知，没有MAP激酶ρ38α化合物成功进入市场，大多数 在IIb期人类临床试验中失败。
[0008] MAP激酶ρ38α在炎症信号级联（signalling cascade)中起重要作用，因此认为它 的抑制在一些人类疾病适应症特别是炎性病症中具有有益作用。这些包括但不限于皮肤炎 性疾病例如特应性皮炎、牛皮癣、寻常痤疮、皮肤疤痕。MAP激酶ρ38α的激活也可在其他疾病 中发挥基础作用，涉及炎症包括紧缩性阻塞性肺疾病（constrictive obstructive pulmonary disease)、哮喘、炎性肠病、动脉粥样硬化、癌症和类风湿性关节炎。
[0009] 本文所描述的发明提供化合物，其用于结合并抑制MAP激酶ρ38α，并且其作为研究 工具用于药物发现和人类医学和兽医学中，特别是用于治疗炎性病症。这样的炎性病症可 存在于一些哺乳动物中，包括人类和犬。有利地，提供对MAP激酶ρ38α具有选择性并基本上 不结合或抑制其它蛋白激酶的化合物。
[0010] WO 2009/021137涉及各种激酶抑制肽。WO 2011/126882涉及抗炎D3肽。
[0011] 本发明的第一个方面提供一种化合物，其包括氨基酸序列HKSRALLIFQKI丽LRRQ (SEQ ID No: 1)或包括所述氨基酸序列的7个或更多个氨基酸的部分或包括1-5个氨基酸改 变的所述氨基酸序列或其所述部分的变体，其中所述化合物结合MP激酶ρ38α。
[0012] 除非另有说明，本说明书全文使用IUB/IUPAC的氨基酸的单字母码，并以传统的N-至C-端方向提供氨基酸序列。通常，所述氨基酸是L-氨基酸，但如下所示，在本发明的一些 实施方案中，其中的一些氨基酸可以是D-氨基酸。变体中改变的氨基酸通常是天然氨基酸， 其包括由遗传密码编码的20个氨基酸，还包括其他天然氨基酸例如羟基脯氨酸、硒代蛋氨 酸和卡尼汀。然而，一些实施方案中，一个或多个改变的氨基酸可以是非天然氨基酸，例如 稀丙基丙氨酸(allyIalanine)和二苯基丙氨酸(diphenylalanine)。
[0013] 通常，当SEQ ID N〇:l或其部分中的氨基酸改变时，氨基酸变为保守氨基酸。例如， 认为在以下氨基酸组中的氨基酸是保守的变化：（10)，（1(，1〇，（5，1')，（1，1^，），卬，￥)。因 此，方便地，化合物中I氨基酸残基可改变为L氨基酸残基，或者N氨基酸残基可改变为Q氨基 酸残基，和/或化合物中K氨基酸残基可改变为R氨基酸残基等。
[0014] 本发明第一个方面的化合物方便地可包括来自SEQ ID No:l的7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16或17个连续氨基酸，或可包括1-5个氨基酸改变的SEQ ID No: 1的所述7-17个 或所有18个连续氨基酸的变体。通常，可改变化合物中存在的氨基酸序列SEQ ID No: 1中或 其7-17个氨基酸部分中的1、2、3、4或5个氨基酸。优选地，如果其部分包括15个或更少(例如 11、12、13、14或15个氨基酸)的连续氨基酸，可改变不超过4个氨基酸(例如3个、2个、1个或0 个）。优选地，如果其部分包括10个或更少(例如9或10个氨基酸)的连续氨基酸，可改变不超 过3个氨基酸(例如2个、1个或0个）。优选地，如果其部分包括7个或8个连续氨基酸，可改变 不超过2个氨基酸(例如1个或0个）。优选地可改变不超过约25%数量的SEQ ID No: 1或其部 分的氨基酸残基。进一步优选地，可改变不超过约20%或15%数量的SEQ ID No: 1或其部分 的氨基酸残基可通过以下步骤计算:确定与SEQ ID No: 1或其适当部分相比改变的氨基 酸残基的数量，除以对应于SEQ ID No: 1的部分中的氨基酸残基的数量，再乘以100。例如， 肽gAL·在JFQIQMW有两个不同于SEQ ID No: 1的部分的氨基酸残基（下划线标出，粗体），使 用其可以制备1^1^正01(1丽。因此，改变的残基的％计算为2/11\100% = 18.2%。
[0015]优选地，本发明第一个方面的化合物包括氨基酸序列RXXXXFQ，其中X是任何氨基 酸。更优选地，本发明第一个方面的化合物包括氨基酸序列RALLIFQ。更优选地，本发明第一 个方面的化合物包括氨基酸序列RALLIFQIQM。
[0016] 在一个实施方案中，本发明第一个方面的化合物可表不为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X1Q-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18。优选地，X 4可以是R、K、Q或H，X9可以是F、Y或H，X10 可以是Q、N、K或R。优选地，该化合物是其中X4是R、X9是F或Xiq是Q的化合物。更优选地，该化 合物是其中X 4是R、X9是F和Xiq是Q的化合物。
[0017] 优选地，该化合物中存在以下中的至少3种情况:Χ^Η，Χ2是K，X3是S，X5是A，X 6是L， X"?是L，X8是I，Xii是K，Xi2是I，Xi3是M，Xi4是W，Xi5是L，Xi6是R，Xn是R和Xi8是Q。优选地该化合物 存在至少4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14个前述氨基酸位置。
[0018]特别优选地，该化合物是其中X2是K、X8是I 或Xlf^R的化合物。特别优选地， 该化合物是其中X2是Κ、χ8是1、乂13是1和乂16是1?的化合物。
[0019] 本发明的化合物还包括其中乂1是六、￥、1或L，X2是A、R、I或L，X 3是A、V、S、T、N或Q，X4 是R、K、Q或H，X5是A、V、I或UX6是L、I、A或V，X7是A、V、I或UX 8是A、V、I或L，X9是F、Y或!1，父10是 Q、N、K或R，Xn是K、Q或1?，父 12是1^或△，父13是]?、1^1、(：，父14是W、A、V、I、L、M或？，父 15是1^、1、八或 V，Xi6是4、￥、1丄、1?、1(、〇或!^17是4、￥、1或1^和/或乂 18是〇^、￥、1或1^的那些化合物。
[0020] 还应当认识到，在化合物包括少于SEQ ID No: 1的18个氨基酸残基的实施方案中， 特定位置X可以是"空的（null)"（即不包括氨基酸残基）。因此，例如，当化合物包括17个连 续氨基酸残基的部分SEQ ID No: 1时，或者X1是空的或者X18是空的。同样地，当化合物包括 16个连续氨基酸残基的部分SEQ ID No: 1时，XjPX2,或者XjPX18或者X17和Xis是空的，对于 连续氨基酸残基的部分SEQ ID No: 1，以此类推。
[0021] 优选地本发明第一个或第二个方面的化合物的氨基酸序列具有7-18个氨基酸。例 如，氨基酸序列可具有8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸。优选地化合物具有8-18 个氨基酸。还优选地化合物具有11-18个氨基酸。通常，当本发明第一个或第二个方面的化 合物由肽组成时，其分子量小于30000道尔顿，优选地小于25000道尔顿，更优选地小于 20000道尔顿。通常，当本发明第一个或第二个方面的化合物包括连接如下所讨论的另一部 分(meoity)的肽部分(peptide portion)时，本发明的化合物的分子量通常为10000道尔顿 和100000道尔顿之间，例如20000道尔顿和80000道尔顿之间，例如20000道尔顿和50000道 尔顿之间。
[0022] 本发明的化合物包括那些包含或组成为以下氨基酸序列的化合物，（R，K，Q，H)A L (L，A，V，I，L)I(F，Y，H)(Q，N，K，R)K I 1(￥，厶^，1丄），其中来自括号内的每组的一个氨基酸 在该位置上使用，其中所述化合物结合MAP激酶ρ38α。因此，本发明包括包含氨基酸序列X 4-X5-X6-X7-X8-X9-X1Q-X11-X12-X13-X14 的化合物，其中X4是R、K、Q或H，X5是 A，X6是 L，X7是L、A、V、I 或L，X8是I，X9是F、Y或H，X1()是Q、N、K或R，Xn是1(4 12是1413是]\1，以及父14是胃^、￥、1或1^，其中 所述化合物结合MAP激酶ρ38α。在该实施方案中，每个都是"空 的"（即，该位置不存在氨基酸残基）。
[0023]本发明的化合物包括：
[0024] HKSRALLIFQKBWLRRQ(SEQ ID No:l)、
[0025] HKSRALLIFQKIMWLRR(SEQ ID No:2)^
[0026] HKSRALLIFQKIMWLR(SEQ ID No:3)^
[0027] HKSRALLIFQKIMWL(SEQ ID No :4)^
[0028] HKSRALLIFQKIMff(SEQ ID No:5)^
[0029] KSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:6)^
[0030] SRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:7)^
[0031] SRALLIFQKIM(SEQ ID No:8)、
[0032] SRALLIFQ(SEQ ID No:9)、
[0033] HALAIFQKBW(SEQ ID No:10)、
[0034] HKSRALAIFQKIMALRRQ(SEQ ID No:11)^
[0035] AKSRALLIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:12)^
[0036] HKSRAALIFQKIMWLRRQ(SEQ ID No:13)^
[0037] HKSRALLIFQKIMWARRQ(SEQ ID No:14)^
[0038] HKSRALLIFQKIMWLRAQ(SEQ ID No:15)^
[0039] HKSRALLIFQKBWLRRA(SEQIDNo:16WP
[0040] SRALLIFQKI(SEQ ID No:17)。
[0041] 本发明化合物的氨基酸序列是肽，该术语包括具有氨基酸残基(H-Ca-[侧链])但 可由如下所讨论的肽键(-C0-NH-)或非肽键连接的化合物。
[0042] 通过以引用的方式并入本文并在此引用的Lu et al(1981)J.0rg.Chem.46,3433 公开的固相多肽合成(solid-phase peptide synthesis)的Fmoc-聚酰胺模式(mode Fmoc-polyamide mode)可合成肽。用于肽合成的试剂容易商购获得。
[0043]本发明化合物的纯化可通过技术例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和（主要 地)反相高效液相色谱法中的任何一种或组合实现。肽的分析可使用薄层色谱法、反相高效 液相色谱法、酸解后的氨基酸分析，以及通过快速原子轰击(