间充质干细胞来源的外泌体的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体的用途，尤其涉及间充质干细胞来源的外 泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 强直性脊柱炎（简称AS)是一种常见的自身免疫性疾病，其患病率较高，在我国约 为0 · 2~0 · 54% (可参见：Rong J, Jieruo G. Spondyloarthritis in China. Current opinion in rheumatology.2013;25(4) :460-7. hAS好发于青年男性，常累及中轴骨关节， 主要临床与病理特征是慢性进行性炎症与病理性成骨（可参见：Braun J ,Sieper J.Ankylosing spondylitis ·Lancet · 2007;369(9570): 1379-90 ·)。然而，AS的发病机制目 前尚不明确，其两大病理特征一炎症与成骨之间的关系也不明确，发病机制不清导致目前 AS治疗手段局限性大、有效性低。随着疾病的进展，AS患者将逐渐丧失生活和劳动能力，给 患者带来了沉重的心理压力和经济负担，对社会的发展造成了巨大的影响和阻碍。因此，探 索既能缓解AS患者体内炎症又能阻止病理性成骨的治疗方法尤为重要。
[0003] 目前AS的治疗手段包括非药物治疗、药物治疗和手术治疗三种[15,16]。非药物治 疗主要包括患者教育、康复锻炼、物理治疗等。药物治疗包括非留体类抗炎药(如双氯芬酸 钠、塞来昔布、洛索洛芬等）、缓解病情抗风湿药(如柳氮磺吡啶、甲氨蝶呤等）、糖皮质激素 (如皮质类固醇等）、镇痛药(如布洛芬等)和生物制剂(如肿瘤坏死因子拮抗剂等)等。手术 治疗包括全髋关节置换术、脊柱截骨矫形术等。
[0004] 在AS的治疗方面，非药物治疗主要用于辅助治疗，无法改变AS患者的最终病情转 归。药物治疗方面，非留体类抗炎药、镇痛药虽能缓解患者的疼痛症状与炎症水平，但却无 法改善患者的病理性骨形成，还具有胃肠道反应、心血管反应等副作用（可参见:Miceli-Richard C,Dougados M.NSAIDs in ankylosing spondylitis.Clinical and experimental rheumatology · 2002; 20(6SuppI 28): S65-6 ·);缓解病情抗风湿药仅能治疗 AS患者的外周关节炎症状，无法改善中轴骨炎症与病理性成骨（可参见:van der Heijde D1Sieper J1Maksymowych WPjDougados M1Burgos-Vargas R1Landewe R,et al.2010 Update of the international ASAS recommendations for the use of anti-TNF agents in patients with axial spondyloarthritis.Annals of the rheumatic diseases.2011;70(6) :905-8.);皮质类固醇仅能用于局部注射缓解疼痛症状，对于全身炎 症水平和病理性骨化也没有作用;生物制剂治疗，特别是肿瘤坏死因子拮抗剂治疗，是目前 AS的最主要治疗方法之一，但有研究发现其虽能抑制AS患者体内炎症，但却无法阻止甚至 还会加速脊柱病理性骨形成，此外生物制剂治疗费用昂贵，部分病人难以承担，还具有感 染、肿瘤、肝肾功能异常等副作用（可参见：van der Heijde D，Landewe R，Einstein S，0ry P1Vosse D,Ni L,et al.Radiographic progression of ankylosing spondylitis after up to two years of treatment with etanercept.Arthritis and rheumatism.2008；58
[5] : 1324-31.)。手术治疗方面，主要是用于晚期AS患者脊柱畸形、髋关节病变等治疗，无法 达到治愈AS的目标D
[0005] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系 统多能干细胞，现已证实MSCs除具有自我更新和多向分化潜能外，还具有很强的抗炎和抑 制多种免疫细胞的能力，并能够诱导外周免疫耐受。研究表明MSCs通过分泌多种免疫调节 因子，如IFN_y、PGE2等（可参见：Polchert D，Sobinsky J，Douglas G，Kidd M，Moadsiri AjReina E,et al.IFN-gamma activation of mesenchymal stem cells for treatment and prevent ion of graft versus host disease. European journal of immunology · 2008 ; 38(6): 1745-55 ·以及Spaggiari GM,Abdelrazik H，Becchetti F， Moretta L.MSCs inhibit monocyte-derived DC maturation and function by selectively interfering with the generation of immature DCs:central role of MSC-derived prostaglandin E2.Blood. 2009; 113(26) :6576-83.),从而抑制免疫细胞（如 T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞等）的功能（可参见：Corcione A，Benvenuto F， Ferretti EjGiunti DjCappiello VjCazzanti F，et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions.Blood.2006;107(l):367_72·以及 Di Nicola M，Carl〇-Stella CjMagni MjMilanesi MjLongoni PDjMatteucci P，et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-Iymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli.Blood.2002;99(10):3838_43.)〇
[0006] 外泌体是一种由细胞分泌的直径约30~lOOnm，密度范围在1.13~1.19g/ml之间 的膜性微囊泡。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细 胞通讯、细胞迀移、血管新生等过程（可参见：Yanez-Mo M，Siljander PR，Andreu Z，Zavec ABjBorras FEjBuzas EI,et al.Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions . Journal of extracellular vesicles.2015；4: 27066.)丄ai等发现MSCs来源的外泌体可减少心肌缺血再灌注损伤，并且证实外泌体的 miRNA可以促进血管新生，因此外泌体可能成为治疗心血管疾病的一个新方向（可参见:Lai RC,Arslan F, Lee MMj Sze NS ,Choo A, Chen TS，et al.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem cell research.2010；4(3): 214-22.) Jin等发现MSCs来源的外泌体通过转移miR-133b到神经细胞，可促进神经轴突的 生长（可参见：Xin H，Li Y，Buller B，Katakowski M，Zhang Y，Wang X，et al.Exosome-mediated transfer of miR_133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth. Stem celIs .2012；30(7):1556-64.) filipazzi等发现肿瘤细胞来源的外泌体可通过NK细胞激活型受体疆620(1^丨1^^1-killer group 2，member D)抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性，从而影响宿主的免疫系统(可 参见：Filipazzi PjBurdek MjVilla AjRivoltini LjHuber V.Recent advances on the role of tumor exosomes in immunosuppression and disease progression. Seminars in cancer biology.2012；22(4):342-9.)〇
[0007] 在利用MSCs来源的外泌体治疗疾病方面，有两项专利，Kiang LS等采用MSCs来源 的外泌体治疗小鼠的肺纤维化，可明显提高小鼠成活率，减轻博来霉素(ble〇my Cin，BLM)导 致的肺纤维化肺部病变(可参见:Kiang LS，Wei YMS，Sheng CT，Chai LR.USE OF EXOSOMES TO PROMOTE OR ENHANCE HAIR GROWTH patent US2015024011.2015-01-22·)。刘明等将 MSCs来源的外泌体用于促进创伤修复和毛发生长，取得良好效果（可参见：刘明，徐军， inventor s间充质干细胞外泌体在制备治疗肺纤维化的药物制剂中的应用patent CN104666344A.2015-06-03.)〇
[0008]但到目前为止，国内外尚未有利用MSCs来源的外泌体治疗AS的报道及专利。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了间充质干细胞来源的 外泌体在制备治疗强直性脊柱炎的药物中的应用。MSCs来源的外泌体对慢性炎症与病理性 成骨均有抑制作用，而且具有副作用低、成本低、效果更持久的优点。
[0010] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。
[0011] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述骨髓间充质干细胞由以下方法制备得 到:从骨髓中分离提取间充质干细胞，然后经原代培养和传代培养得到。
[0012] 作为对上述技术方案的更进一步改进，所述外泌体的提取方法为:培养足量的骨 髓间充质干细胞，在提取干细胞外泌体前48h，用PBS清洗细胞，更换无血清培养基，继续培 养 48h;
[0013] 收集无血清培养基，300 X g离心10min，取上清；2000 X g离心10min，取上清；10000 X g离心30min，取上清；100000 X g离心70min，取沉淀;PBS重悬沉淀，100000 X g离心70min， 收集沉淀即得所述外泌体。
[0014] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物中的外泌体的浓度为1.3 X IO9~ 3.5X IO9粒/毫升。
[0015]