用于预防和/或治疗人中的hiv疾病的药物组合物的制作方法

文档序号:9926411阅读:535来源:国知局
用于预防和/或治疗人中的hiv疾病的药物组合物的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是申请号为201280026590.4,申请日为2012年4月6日,发明名称为"用于预 防和/或治疗人中的HIV疾病的药物组合物"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及含有特异性HIV抗原和非致病细菌的混合物的药物组合物。所述特异 性HIV抗原包括一个或多个来自Gag和/或Pol蛋白的表位,且优选其在颗粒(particulate) 的形式下。所述细菌优选是植物乳杆菌(Lactobaci Ilus plantarum)。这些组合物对预防 和/或治疗人中的HIV疾病是有用的。
【背景技术】
[0003] 在发现人免疫缺陷病毒(HIV)后超过25年,来自世界卫生组织和HIV/AIDS的联合 国联合计划的最新预测(projection)表明,如果大流行以目前的速度进展,到2011年将有 超过3千万人感染。
[0004] 但是,尽管为了发现对预防HIV感染有效的治疗作出大量的研究努力,目前两种测 试的预防性疫苗或者失败(Me Elrath等人,2008)或者产生中度效果(Rerks-Ngarm等人, 2009) 〇
[0005] Jae-Sung Yu 等人(Clinical and Vaccine Immunology ,2006 十一月,13 卷, No. 11,1204-1211)描述了重组包皮垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)载体,其构建 用于表达作为表面、细胞内或分泌蛋白的M组HI V-1共有env基因⑶N6。作者能证明在小鼠 中,重组包皮垢分枝杆菌(M. smegmatis)对在粘膜表面诱导HIV-I T细胞反应是免疫原性 的。
[0006] Ke-Qin Xin等人(Blood,2003六月1,102卷,No. 1,223-228)描述了在其细胞表面 表达HIV-I Env V2-V4环的重组乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)载体。用该载体口服免 疫小鼠诱导:
[0007] -粘膜和体液免疫反应,如通过检测到高水平的HIV特异性血清IgG和排泄物IgA抗 体所表明的;和
[0008] -细胞免疫反应,如通过HIV特异性IFN γ分泌细胞的数量增加所表明的。
[0009] 为了在乳酸乳球菌(L. Iactis)细胞表面正确表达,可以使用Ikb或小于Ikb的基因 片段(segment)。
[0010] 大多数参与HIV发病机理和预防的科学家感觉在测试用于预防或治疗人类HIV感 染的HIV预防性疫苗或其它生物组合物之前,在非人的灵长目中测试其对应物将更有建设 性意义(Morgan C,等人,2008)。选择的非人灵长目是恒河猴(macaques rhesus),在猕猴 (macaques)中,现在已经确凿地表明感染猴免疫缺陷病毒(SIV)239的中国来源的猕猴是模 拟多数人中HIV感染演化的临床、病毒学和免疫方面最好的模型(Marcondes MC等人,2006; Stahl-Hennig C等人,2007;Chen S等人,2008)。
[0011]最后,现在科学界认同,一旦在猕猴中发现抗SIV239有效的预防性生物组合物或 疫苗,其应当完全可能成功地适用于人来保护其免受AIDS。
[0012] 尽管科学界持久的研究努力,仍然期待预防性和治疗性有效的策略战胜全世界的 AIDS流行。
[0013] 已经描述了各种细菌具有施用于受试者时的令人感兴趣的佐剂性和免疫调节性 的特性。尤其是,报道了乳酸细菌促进对免疫系统的耐受作用。
[0014] 例如,公布于2006年 11 月23 日,在Stallergenes S.A名下的W02006/123230,描述 了选自双歧杆菌(Bifidobacteria)和乳酸细菌的细菌作为免疫原性组合物中的佐剂的用 途,其能够在舌下、经舌、或口服施用于受试者时诱导抗原特异性耐受。建议免疫原性组合 物用于治疗过敏、自体免疫性疾病、或用于预防移植排斥。
[0015] 然而,例如公布于2009年7月30日,在食品和营养高级研究所(Stichting Top Institute Food and Nutrition)名下的W02009/093900,描述了含有大量对数中期乳酸细 菌的致耐受性组合物。当施用于受试者时,该组合物诱导非抗原特异性免疫耐受。建议该组 合物用于预防、延缓和/或治疗与导致组织损伤的炎症反应相关的病症或疾病,例如,过敏、 自体免疫性疾病、以及肠的炎症疾病。

【发明内容】

[0016] 令人惊奇地,发明人能够表明如以下实施例中描述的原始药物组合物在猕猴中诱 导有效的对SIV的抗原特异性免疫保护。而且,当所述SIV特异性免疫保护被诱导时,发明人 表明其预防了 SIV复制/传播以及随后的体内感染的建立。
[0017] 实际上,发明人惊奇地表明将文中公开的药物组合物粘膜地或由皮内或上皮内途 径施用时,显著地抑制或甚至消除或防止病毒复制。
[0018] 实际上,发明人第一次观察到在猕猴中非细胞毒CD8+T细胞反应抑制SIV抗原提呈 的CD4+T细胞的早期激活。因而,不希望束缚于理论,当粘膜或皮内或上皮内施用于受试者 时,根据本发明的药物组合物诱导意想不到的新型病毒特异性免疫耐受。该免疫耐受看起 来是HIV Gag和/或Pol抗原特异性抑制性CD8+T细胞诱导的免疫耐受(文中也命名为";制 性"免疫耐受的"Ts"免疫耐受),其是MHC(为"主要组织相容性复合物")-lb/E限制的和非细 胞毒的。
[0019] 鉴于文中所报道的结果,本发明提供了一种能够实现如上所定义的"Ts"免疫耐受 的新型药物组合物,其用于预防和/或治疗人的HIV疾病。
[0020] 因而,本发明的一个目的是提供含有抗原和非致病活细菌的混合物的药物组合 物,其中,优选所述抗原是颗粒的和/或其具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表 位,且其中所述细菌优选是植物乳杆菌。
[0021] 本发明的另一个目的是提供文中所述的药物组合物,用作疫苗。
[0022] 本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人的HIV疾病的方法,其 包括至少粘膜地(优选口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述 人的步骤。
[0023]本发明的又一个目的是提供用于保护人免受HIV的方法,其包括至少粘膜地(优选 口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述人的步骤。
[0024]本发明的又一个目的是提供用于保护人免受HIV血清转化的方法,其包括至少粘 膜地(优选口服)或皮内地或上皮内地将有效量的上述药物组合物施用于所述人的步骤。
[0025] 本发明的又一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人的HIV疾病的药物试 剂盒,其包含
[0026] -在第一容器中的抗原;和 [0027]-在第二容器中的非致病细菌,
[0028] 其中所述抗原和所述细菌在用于粘膜或皮内或上皮内施用的药学上可接受的载 体中,其中优选所述抗原是颗粒的和/或其具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表 位,且其中所述细菌优选植物乳杆菌。
【附图说明】
[0029] 通过以下的【附图说明】本发明,其可参照以下非限制的实施例。
[0030] 图1:用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的静脉内(i · V ·)SIVmac239挑战。
[0031]图2:用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的直肠内(i .r. )SIVmac239挑战。
[0032] 图3:用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴的重复SIVmac239挑战(3次由i.v.和2次 由 i .r ·) 〇
[0033]图4:用阴道内iSIV/BCG加皮内加强预处理的恒河猴的静脉内SIVmac239挑战。 [0034]图5:用阴道内iSIV/BCG加皮内加强预处理的恒河猴的直肠内SIVmac239挑战。 [0035] 图6:用口服iSIV/BCG预处理的恒河猴的直肠内SIVmac239挑战。
[0036]图7:从用阴道内iSIV/BCG预处理的恒河猴获得的⑶8+T细胞体外抗病毒活性。 [0037]图8:从用口服iSIV/BCG预处理的4只恒河猴获得的CD8+T细胞体外抗病毒活性。 [0038]图9:通过从用口服iSIV/BCG预处理的4只恒河猴获得的自体同源(autologous) ⑶8+T细胞的⑶4+T细胞激活的SIV特异性抑制。
[0039]图IOa:取自用iSIV/LP、iSIV或LP预处理的恒河猴的血浆样品中的抗SIV IgG抗体 滴度。
[0040] 图IOb:取自用iSIV/LP、iSIV或LP预处理的恒河猴的PBMC样品中的SIV特异性T细 胞增殖。
[0041 ] 图IOc:在存在或不存在⑶8或⑶25T细胞时在体外刺激下SIV特异性IFN γ分泌T细 胞。
[0042] 图IOd:与用口服LP(n = 4)或iSIV(n = 3)预处理的动物相比,通过用口服iSIV/LP 预处理的8只恒河猴获得的自体同源CD8+T细胞的CD4+T细胞激活的SIV特异性抑制。
[0043] 图IOe:胃内施用iSIV/LP制剂后60天的SIV特异性CD8+T细胞:在CD8+T细胞或存在 人自然杀伤细胞(hNK)(对照)的K562存在时,在具有或不具有SEB和抗CD3/CD28刺激时,AT-2SIV脉冲的⑶4+T细胞的细胞毒性。
[0044] 图Ila:与用口服LP(n = 4)或iSIV(n = 3)预处理的动物相比,通过用口服iSIV/LP 预处理的8只恒河猴获得的自体同源CD8+T细胞的体外抗病毒活性(在CD4细胞中)。
[0045]图lib:从口服iSIV/LP处理后80天的8只恒河猴中的4只获得的异种 (heterologous)或同种异体(allogenic)Q)8+T细胞的体外抗病毒活性(在⑶4细胞中)。 [0046]图Ilc-1 Ig: 口服免疫后60天⑶8+T细胞的抗SIV活性,在延缓的(图IIc)、插入(图 I Id)、同种异体(图11e)的培养系统中,在抗MHC-la/ABC或抗MHC-lb/E抗体(图11f)存在时、 以及在去除TCR γ δ+或νβ8+亚群的CD8+T细胞中(图Ilg)。
[0047]图12a:与用口服LP或iSIV预处理的动物相比,用口服iSIV/LP预处理的恒河猴中 直肠内和静脉内SIVmac239挑战后,血浆的病毒载量水平(每ml血浆的SIV RNA拷贝)。
[0048]图12b:与用口服LP或iSIV预处理的动物相比,用口服iSIV/LP预处理的恒河猴中 直肠内和静脉内SIVmac239挑战后,细胞的病毒载量水平(每100万PBMC的SIV DNA拷贝)。 [0049] 图13a-13e:通过输注抗CD8抗体CMT807,去除8只iSIV/LP处理的猕猴的外周血和 淋巴结⑶8+T细胞。图13a,在接受三次CMT807注射之前和之后的外周血⑶8+T细胞计数;图 13b,在接受三次CMT807注射之前和之后的淋巴结CD8+T细胞% ;图13c,在接受三次CMT807 注射之前和之后的血浆病毒载量;图13d,在接受三次CMT807注射之前之后的PMBC DNA SIV 载量;图13e,在接受三次CMT807注射之前和之后的淋巴结SIV DNA载量。
[0050]图14a-14b:在8只用由iSIV和LP制成的口服制剂免疫的恒河猴和2只另外的未处 理(na'ive)的猴子中用SIVB670直肠内进行第三次直肠内挑战后,血浆(图14a)和PBMC (图 14b)的病毒载量。
[0051 ] 图15a-15c:用iSIV和LP胃内免疫后(iSIV/LP免疫如.2),在体外和体内008 +1'细胞 介导的抗病毒活性。图15a,在将被直肠内挑战的8只恒河猴中,在免疫后的60-420天期间, CD8+T细胞的抗SIV活性(病毒抑制的倍数);图15b和图15c,用口服iSIV/LP免疫的那8只恒 河猴和仅用LP(n = 4)或仅用iSIV(n = 4)处理的8只对照猴中,直肠内SIVmac239挑战后,血 衆和细胞的病毒载量。
[0052] 图16a-16e:在8只猕猴(iSIV/LP免疫如.2)中,在31¥1^〇239直肠内挑战后,直肠粘 膜上皮内淋巴细胞(IPL)中(图16a-图16b),固有层(lamina propria)细胞中(LPC)(图 16c-图16d)和盆腔淋巴结中(PLN)(图16e)的SIV DNA和RNA载量。
【具体实施方式】
[0053]发明的详细描述
[0054]本发明涉及包含抗原和非致病活细菌的混合物的药物组合物。
[0055] 抗原
[0056]由于HIV基因组中突变、重组、插入和/或缺失所致的高度变异性,HI V被分类为组、 亚组、型、亚型和基因型。有两个主要的HIV组(HIV-1和HIV-2)和许多亚组,原因是HIV基因 组不断地突变。组和亚组间的主要不同与病毒包膜(envelope)相关。HIV-I被分类为主要的 亚组(M),所述亚组M被分类为命名为A到J的9个亚型(分支(clade)或亚型)(Hu等人,JAMA 275:210-216,1996;Korber等人,Science 280:1868-1871,1998),以及第 10个之外的亚组 (0)。还存在来自于前一个的体内重组的许多其它亚组(Papathanasopoulos MA等人,Virus Genes 2003,26:151-163)。优选,HIV病毒是HIV-I或HIV-2,包括所有已知的和至今未知的 其分支。然而,优选的是HIV-I。
[0057]在本发明的上下文中,"抗原"来自HIV来源,这意味着其与特异性HIV组、亚组、型、 亚型或一些亚型的组合相关。优选地,所述HIV抗原是HIV-I或HIV-2抗原。
[0058]所述抗原是非感染性的。
[0059] 很长时间科学界怀疑CD4+T细胞(既是HIV-I又是SIV的主要靶点)的激活直接导致 病毒复制(Andrieu和Lu,1995; Korin和Zack,1999)。但是,仅仅在最近,才澄清了CD4+T细胞 激活和SIV或HIV感染过程的连续步骤之间的相互作用。在静态的⑶4+T细胞中,在进入后2 小时内,跟随病毒穿透之后的是在质膜上提呈来自进入的病毒粒子的Gag和Pol蛋白表位, 而Env和Nef蛋白需要重新合成(Sacha等人,2007)。但是,感染过程随后的阶段,即,病毒整 合之后的逆转录,在静态细胞中发展得非常没有效率(Vatakis等人,2009a和2009b)。相反 地,当在质膜上提呈Gag和Pol表位之前或之后的48小时之内激活⑶4+T细胞,HIV/SIV逆转 录和DNA整合完全活化,其允许非常有效的病毒复制和释放(Vatakis等人,2009a和2009b)。
[0060]因而,发明人假定,在HIV/SIV暴露后,体内特异性阻断早期发生的HIV/SIV Gag或 Pol特异性CD4+T细胞的激活,将导致防止活化的病毒复制。
[0061 ] 考虑到这一点,为了诱导HIV Gag和/或Pol抗原提呈⑶4+T细胞激活的抑制,继而 在病毒暴露的人中防止体内HIV复制和传播,本发明的药物组合物包含HIV抗原,其优选具 有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位。这样的抗原有利地或含有或衍生自HIV Gag 和/或 Pol。
[0062]因而,术语"含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原"指HIV抗原:
[0063]-包含至少一个Gag和/或Pol (作为"含有Gag和/或Pol的抗原"或
[0064]-包含一个或多个由GAG,例如衣壳蛋白(p24)和基质蛋白(pl7),编码的蛋白,和/ 或一个或多个由P0L,例如整合酶、逆转录酶和蛋白酶,编码的蛋白(作为"衍生自Gag和/或 Pol的抗原");或
[0065]-包含一个或多个来自这些蛋白的表位(也作为"衍生自Gag和/或Pol的抗原")。
[0066] 特别地,选自如下的任何其它病毒蛋白或其表位不是包含于文中公开的药物组合 物的必要组分4附、¥1?、¥?1?、!11¥-1的¥?1]、!11¥-2的¥?乂、1^¥、陬?、了41'等等。如果存在,这些 蛋白的任一个仅仅是用于文中公开的药物组合物中的任选组分。
[0067] 优选抗原是颗粒抗原。这意味着其优选选自病毒颗粒、重组病毒颗粒、病毒样颗 粒、表达Gag和/或Pol的重组细菌或真菌、在其表面提呈一个或多个病毒蛋白或肽或表位 (含有或衍生自HIV Gag和/或Pol)的聚合微颗粒。优选地,一个或多个来自Gag和/或Po 1的 表位由所述抗原产生或表达或包含于所述抗原。当使用重组病毒颗粒或病毒颗粒或表达 Gag和/或Pol的重组细菌或真菌时,其优选是失活的微生物。
[0068] 抗原可以是病毒颗粒、重组病毒颗粒、病毒样颗粒或表达Gag和/或Pol的重组细菌 或真菌。其还可以是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自HIV的Gag和/或Pol)、重组的 或非重组的、可以是缀合物(con jugate)或多联体(concatemer)的形式。然后,抗原是病毒 核酸非依赖的,即,其是非病毒DNA或非病毒RNA依赖的。
[0069] 抗原可以来自有利地包含于适当的重组微生物中的病毒核酸序列的表达。
[0070] 如果包含于本发明药物组合物中的抗原是表达Gag和/或Pol的重组细菌,那么所 述重组细菌优选不同于也包含在组合物中的非致病活细菌。
[0071] 当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或衍生自 HIV的Gag和/或Pol)时,其优选是颗粒的形式。实践中,适当的颗粒抗原,可由活的微生物 (例如,酵母),以与重组DNA B型肝炎疫苗相同的方式生产,在重组DNA B型肝炎疫苗的情况 中,表达的HBsAg多肽自我组装成免疫原性球形颗粒,其非常类似慢性HBV感染患者血清中 发现的天然22-nm颗粒(Plotkin等人,2008)。
[0072] 或者,当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含有或 衍生自HI V Gag和/或Po I)时,其是缀合物的形式。在这样的实施方式中,如本领域公知的, 感兴趣的蛋白或肽共价缀合于适当的载体。可商业获得的常规载体尤其是蛋白,如KLH(钥 孔戚血蓝蛋白)蛋白、BSA(牛血清白蛋白)蛋白、OVA(卵清蛋白)蛋白等(优选其可以安全地 口服施用于人类)。生产适当的缀合物的方法对本领域技术人员是熟悉的。
[0073]但是,或者,当根据本发明的药物组合物中的抗原是一个或多个病毒蛋白或肽(含 有或衍生自HIV Gag和/或Po 1)时,其是多联体的形式。如本领域中公知的,多联体由感兴趣 蛋白或肽的多个拷贝形成,其在一个大分子中物理连接在一起。在多联体中,感兴趣蛋白或 肽的一个拷贝可以直接地或被合成手臂分隔而连接至其它拷贝。因而,多联体包含至少两 个拷贝,优选多至10个拷贝或更多,的感兴趣蛋白或肽。生产适当多联体的方法属于本领域 技术人员的普通常识。
[0074] 如文中使用的,"病毒样颗粒"(VLP)指非常类似成熟病毒粒子的颗粒,但是其不含 有所述病毒的病毒基因组物质。更准确地,VLP,也称为假病毒粒子,代表由病毒衣壳和/或 其它病毒蛋白的多个拷贝组成的亚单元结构。这些病毒蛋白能够在体内自我组装成明确的 球形对称的VLP。这些VLP不包含编码病毒蛋白的任何核酸分子,更准确地,其不包含任何核 酸分子。因而,VLP在自然中是非复制且非感染的,这使得其安全地以药物组合物的形式施 用。用于生产VLP的方法是本领域技术人员公知的(参见,例如,Liew等人,2010 !Plummer和 Manchester,2010)。用于生产VLP的适当方法的非限制的例子在US 5,919,458、EP 386882、 TO 91/07425、US 5,861,282和WO 91/05864中描述了,其公开了不包含HIV基因组也不包含 任何核酸分子的HIV VLP(假病毒粒子)。
[0075] 如文中所述的,"重组病毒颗粒"指包含来自不同病毒的蛋白、或在其表面暴露来 自不同病毒的蛋白的病毒颗粒。而且,重组病毒颗粒
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