用于治疗糖尿病的靶向dpp-4疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于预防或治疗糖尿病的疫苗，其包含DPP-4(二肽基肽酶4)的特定部 分氨基酸序列作为免疫原，本发明还涉及用于糖尿病的预防或治疗剂，其包含识别上述 DPP-4的部分氨基酸序列的DPP-4中和抗体。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种由于体内胰岛素数量不足或作用不足而使血糖相比健康对象升高 的代谢疾病，其转而引起肾、视网膜、神经等中的微血管病变以及大血管病变如动脉硬化等 以显著损害健康生活。迄今为止，降血糖剂如胰岛素、胰岛素促泌剂、胰岛素增敏剂、糖苷 酶抑制剂等已广泛应用作临床治疗方法。虽然这些降血糖剂的有效性已得到认同，但它们 各自具有许多问题。例如，胰岛素当以不适当方法或剂量给药时具有引起低血糖的风险。在 显示出显著降低的胰腺胰岛素分泌能力的糖尿病患者中，胰岛素促泌剂和胰岛素增敏剂的 有效性降低。在具有显著胰岛素抵抗的糖尿病患者中，胰岛素和胰岛素促泌剂的有效性降 低。
[0003] 已知糖尿病病原学中涉及多种因素。作为其中之一，GLP-1(胰高血糖素样肽-1) (一种已知的作为胃肠道激素的肠降血糖素)参与葡萄糖代谢。GLP-1不但刺激胰岛素分泌， 还刺激骨骼肌、脂肪组织和肝以改善胰岛素敏感性，并可控制血糖水平。然而，其被DPP-4 (丝氨酸蛋白酶)快速降解(非专利文献1)。因此，为治疗糖尿病，已研究了靶向DPP-4的药物 研发，且迄今已有一些DPP-4抑制剂上市。然而，由于给药频率和剂量倾向于增加，因此患者 存在经济负担大的问题。
[0004] [文献列表]
[0005] [非专利文献]
[0006] 非专利文献1:J Biol Chem 1996;271(38) :23222-23229
【发明内容】
[0007] 本发明解决的问题
[0008] 本发明的目的是提供用于治疗或预防糖尿病的疫苗，其包含DPP-4的特定部分氨 基酸序列，以及用于糖尿病的预防或治疗剂，其包含识别上述DPP-4的部分氨基酸序列的 DPP-4中和抗体，其将用于预防或治疗糖尿病的方法，其在剂量和给药频率方面优于常规 DPP-4抑制剂。
[0009] 解决问题的方法
[0010]本发明人从DPP-4的三维结构信息推测多个氨基酸部分对于结合及裂解GLP-1而 言是重要的，并设计所述部分作为能够诱导DPP-4中和活性的抗原候选物。上述合成的多种 抗原侯选物与KLH接合(连接）（conjugate)并连同弗氏佐剂(Freund's adjuvant)给药至小 鼠。结果，指明了显示出显著抗体增加的两种抗原侯选物。对给药所述两种抗原侯选物的小 鼠进一步喂食高脂膳食。结果，采用一种抗原侯选物免疫的小鼠相比于对照显示出高DPP-4 活性抑制率，以及胰岛素分泌和葡萄糖耐量的改善。在给药所述抗原侯选物3次的小鼠中诱 导的抗体滴度增加维持约3个月。此后通过再给药所述抗原侯选物再次通过增强效应而轻 易增加抗体滴度。
[0011]基于这些发现，本发明人已进行进一步研究并完成了本发明。
[0012]即，本发明提供了
[0013] [1]用于预防或治疗糖尿病的疫苗，其包含任意以下（1)-(3)中的任意物质：
[0014] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺乳 动物氨基酸序列；
[0015] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和
[0016] (3)能够表达上述(1)或(2)多肽的表达载体；
[0017] [ 2 ][ 1 ]所述疫苗，其包含载体蛋白质；
[0018] [3][1]或[2]所述疫苗，其包含佐剂；
[0019] [4]用于糖尿病的预防或治疗剂，其包含识别以下（1)或(2)多肽，并抑制DPP-4的 功能的抗体：
[0020] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列;和
[0021] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0022] [5]用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括给药有效量的以下（1)-(3)中的任意物 质至对象：
[0023] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列；
[0024] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和 [0025] (3)能够表达上述(1)或(2)多肽的表达载体；
[0026] [ 6 ][ 5 ]所述方法，其包括给药载体蛋白质；
[0027] [ 7 ] [ 5 ]或[6 ]所述方法，其包括给药佐剂；
[0028] [8]用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括给药有效量的识别以下（1)或(2)多肽， 并抑制DPP-4的功能的抗体至对象：
[0029] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列;和
[0030] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0031] [9]用于预防或治疗糖尿病的方法中的以下（1)-(3)中的任意物质：
[0032] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列；
[0033] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和
[0034] (3)能够表达上述(1)或(2)多肽的表达载体；
[0035] [ 10] [9]所述物质，其包含载体蛋白质；
[0036] [11][9]或[10]所述物质，其包含佐剂；
[0037] [12]用于预防或治疗糖尿病的方法的抗体，其识别以下（1)或(2)多肽并抑制DPP- 4的功能：
[0038] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 动物氨基酸序列;和
[0039] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或对应于SEQ ID N0:2的非人哺 乳动物氨基酸序列中一个或数个氨基酸残基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0040] [13]由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列组成的多肽。
[0041] 发明效果
[0042]使用本发明的DPP-4部分氨基酸序列作为疫苗，可诱导抑制DPP-4活性的中和抗 体、可通过所述抗体抑制GLP-1降解，并可改善胰岛素分泌。此外，使用识别DPP-4部分氨基 酸序列的中和抗体可直接获得上述效果。此外，因为所述中和抗体的半衰期长于常规DPP-4 抑制剂的半衰期，所以可预期给药至患者的所述疫苗和抗体的给药频率相比于常规DPP-4 抑制剂可减小。
[0043] 附图简述
[0044]图1提供了显示以下的图表：
[0045] A:采用El、E2、E3或KLH疫苗免疫的小鼠中针对DPP-4的抗体滴度，*: P〈0.05，#: P〈 0.01，: P〈0.0013:来源于El或E3疫苗组血清的抗体与重组DPP-4蛋白的结合。
[0046]图2提供了显示以下的图表：
[0047] A:采用E1或E3疫苗诱导的抗DPP-4抗体对采用E1或E3疫苗免疫的第56天小鼠的血 浆中的DPP-4的功能的抑制率，*:P〈0·05。B:采用El疫苗(20μg/小鼠）或E3疫苗(20μg/小鼠） 免疫的第56天小鼠的血清对DPP-4功能的体外抑制率，*: P〈0.05X:采用KLH、E1或E3疫苗免 疫的小鼠中给予葡萄糖后的血衆GLP-1水平，*: P〈0.05。
[0048]图3提供了显示以下的图表：
[0049] A:采用E3疫苗诱导的抗DPP-4抗体对采用E3疫苗免疫的第28、42、56天小鼠的血浆 中的DPP-4的功能的抑制率，*:P〈0.05。B:采用E3疫苗（20μg/小鼠）免疫的第28、42、56天小 鼠的血清对DPP-4功能的体外抑制率，*: P〈0.05。
[0050]图4提供了显示以下的图表：
[0051] A:在正常膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食负荷后的血糖水平。B: 在正常膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食负荷后的胰岛素水平。C:在高脂膳 食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠中口服膳食耐量试验(MTT)的实施计划。D:在高脂 膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食负荷后的血糖水平。E:在高脂膳食条件 下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食负荷后0-120分钟的总血糖水平，*:P〈0.05。
[0052]图5提供了显示以下的图表：
[0053] A:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的胰岛素水平，^ΡΜ.ΟδαΒ: 在高脂膳食条件下，采用Ε3或KLH疫苗免疫的小鼠的!101^-11?，*:?〈0.05。(：:在高脂膳食条件 下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在腹腔内胰岛素给药后的小鼠的血糖水平。胰岛素给药时的 血糖水平视为100%，*:P〈〇. 05』:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在腹腔内 胰岛素给药后的小鼠的GLP-1水平，*: P〈0.05。
[0054]图6提供了显示以下的图表：
[0055] A:采用E3疫苗免疫的小鼠的抗体滴度的时程改变。B:在高脂膳食条件下，采用E3 或KLH疫苗免疫的小鼠的DPP-4水平，***: P〈0.001X:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗 免疫的小鼠的体重。D:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的膳食消耗量。 [0056]图7提供了显示以下的图表：
[0057] A:在高脂膳食条件下，在采用E3或KLH疫苗免疫的糖尿病模型小鼠中的口服膳食 耐量试验(MTT)的实施计划。B:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在膳食负荷 后的糖尿病模型小鼠的血糖水平，*: P〈〇. 05 X:在高脂膳食条件下，采用E3或KLH疫苗免疫 的糖尿病模型小鼠的膳食负荷后的0-120分钟总血糖水平，*: P〈0.05。
[0058]图8提供了显示以下的图表：
[0059] A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的膳食负荷后血糖水 平，*: P〈0.05 A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的膳食负荷后的0-120分钟总血糖水平，*: P〈0.05 X:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的 膳食负荷后胰岛素水平，*: P〈〇. 05。0:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小 鼠的膳食负荷后胰腺胰岛素含量，*: P〈〇. 05A:来源于采用E3或KLH疫苗免疫以及在膳食负 荷后的db/db小鼠的胰腺的免疫组化染色切片的显微图像。
[0060]图9提供了显示以下的图表：
[0061 ] A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的GLP-1水平，*:P〈0.05。 B:采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的DPP-