粘质沙雷氏菌菌苗在制备预防和/或治疗免疫系统功能缺陷类疾病及糖尿病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及粘质沙雷氏菌的用途，具体涉及该粘质沙雷氏菌菌苗在制备预防和/ 或治疗免疫系统功能缺陷类疾病和/或糖尿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫系统功能缺陷类疾病是指由于免疫系统的器官、组织、细胞及分子存在先天 性缺陷，或后天继发于感染、癌、代谢病、营养不良或物理及化学等因素，所引起的免疫功能 不全综合征，包括原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病。
[0003] 目前对于免疫系统功能缺陷类疾病的治疗多采用免疫抑制疗法，如采用肾上腺糖 皮质激素、细胞毒物质、环孢霉素、单克隆抗体等治疗超敏反应性疾病、自身免疫性疾病、淋 巴增殖病等;或采用免疫调节、增强及免疫替补疗法治疗免疫缺陷疾病、自身免疫疾病等。 但上述治疗方法所治疗的免疫缺陷类的疾病往往相对单一，其治疗效果还不是很理想。
[0004] 糖尿病(diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒 素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、 蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病 例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即"三多一少"症状，糖尿病(血糖)一旦控制不好会 引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。目前治疗糖尿病的口服降糖药 物主要有双胍类药物、磺脲类药物、噻唑烷二酮类药物、格列奈类药物、糖苷酶抑制剂、二 肽基肽酶-4 (DPP-4)抑制剂以及胰岛素注射剂，但上述对糖尿病的治疗药剂，往往价格高 昂，效率也往往不尽如人意。
[0005] 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)又称灵杆菌，是一种产生鲜红色素的细菌， 其形态多样，广泛分布于自然界中，是水和土壤中的常居菌群。国内外对粘质沙雷氏菌的研 究较早，但在预防和治疗免疫系统功能缺陷类疾病和糖尿病方面并不属于热门研究领域。 研究大多以粘质沙雷氏菌作为工程菌用于灵菌红素的制备；还有一些报道（专利 2012103989308)将粘质沙雷氏菌用于防治白蚁；以及利用粘质沙雷氏菌制备生物染料(专 利2012101038897);较少有关于将粘质沙雷氏菌用于预防和治疗免疫系统功能缺陷类疾病 的报道;未见将粘质沙雷氏菌用于预防和治疗糖尿病的报道。现有的治疗免疫缺陷疾病和 糖尿病的药物治疗效果欠佳，患者往往需要额外用药，给患者带来了不便，并增加了医疗成 本。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供粘质沙雷氏菌菌苗在制备预防和/或治 疗免疫系统功能缺陷类疾病和/或糖尿病药物中的应用。
[0007] 本发明是基于发明人的前期研究，以源自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏 的粘质沙雷氏菌(保藏号:CGMCC1.0589)作为出发菌株，经紫外诱变获得一株新菌株(保藏 号为CGMCC NO. 11987)，研究发现其具有广谱的抗肿瘤活性，并以该菌株作为研究的基础， 进行了一系列的技术扩展研究。发明人在利用上述菌株进行临床抗肿瘤研究时，意外的发 现，该菌株(保藏号为CGMCC NO. 11987)不仅具有抗肿瘤活性，而且对免疫功能缺陷类疾病 和糖尿病也具有较好的预防和/或治疗效果。
[0008] 本发明采用下述技术方案：
[0009] 根据本发明的第一方面，提供粘质沙雷氏菌在制备预防和/或治疗免疫系统功能 缺陷类疾病和/或糖尿病药物中的应用。
[00?0] 本发明的沙雷氏菌（Serratia sp. )SM-1，已于2016年01月11日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.11987。
[0011] 该菌株的形态学特征为:革兰氏阴性杆菌，大小为1.5~0.6um，周身鞭毛，有动力， 无荚膜及芽孢。普通肉汤琼脂培养基(PH7.2-7.4)生长良好，菌落乳白色，无异味，呈圆形、 光滑、隆起、边缘整齐。
[0012] 生理生化特性为：发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，产酸不产 气;不发酵鼠李糖、阿拉伯糖、蜜二糖，能产生胞外脱氧核糖核酸酶。
[0013] 4~28°C培养产生红色色素，但37°C培养不产生色素，而把培养温度从37°C降低到 28 °C培养又可产生红色色素。
[0014] 根据本发明的第二方面，提供一种粘质沙雷氏菌菌苗在制备预防和/或治疗免疫 系统功能缺陷类疾病和/或糖尿病药物中的应用。
[0015] 所述粘质沙雷氏菌菌苗的活性成分为上述粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物。
[0016] 所述粘质沙雷氏菌菌苗的制备方法为，由粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物通过适 当的分离方法获得。
[0017] 所述的适当的分离方法为:4000-6000rpm离心30-60min，弃上清，将沉淀进行灭活 处理，再离心、，弃上清，洗涤，离心、沉淀，配制即得。
[0018] 所述免疫系统功能缺陷类疾病包括红斑狼疮、银肩病、干燥综合症、鱼鳞病、疣类 性病和哮喘。所述糖尿病类疾病包括I型糖尿病和Π 型糖尿病。
[0019] 粘质沙雷氏菌的生物学纯培养物的制备方法为:将粘质沙雷氏菌斜面菌种的单菌 落接种于LB液体培养基上，摇床发酵培养;发酵培养的条件为:LB液体培养基PH6.0-8.0，接 种量为8-15%，通气量40-90%，培养温度32-39°C，培养时间16-26h，转速120-200rpm。
[0020] 上述应用中，可以将粘质沙雷氏菌菌苗与医学上可接受的载体以组合物的形式， 施加于需治疗的患者，使用量可以根据患者的年龄、病情等进行变化。
[0021] 所说的载体是指药学领域常规的载体，如稀释剂、分散剂、稳定剂等。
[0022] 上述组合物可以以常规的方法制备成各种剂型，优选的为:注射液制剂或冻干粉 针。
[0023]上述注射液制剂中，粘质沙雷氏菌菌苗的重量含量为0.1-99.9%，优选的含量为 0.5-90%。
[0024]本发明的有益效果：
[0025] (1)本发明提供的粘质沙雷氏菌菌苗对免疫系统功能缺陷类疾病和糖尿病均具有 明显的预防和治疗作用;而且该粘质沙雷氏菌菌苗为灭活的菌苗，安全无毒副作用。
[0026] (2)本发明提供的粘质沙雷氏菌菌苗经多年的临床应用研究证明，其疗效确切;而 现有的粘质沙雷氏菌的研究多停留在实验室阶段，其临床应用的前景尚存在诸多的不确定 性，因此，本发明的粘质沙雷氏菌菌苗更具备临床应用的价值。
【附图说明】
[0027 ] 图1:进化树不意图。
【具体实施方式】
[0028] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0029] 实施例1:菌株的筛选
[0030] 1.出发菌株筛选
[0031] 菌种源自中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的粘质沙雷氏菌，保藏号： CGMCC1.0589,无菌条件下，取原菌种10倍梯度稀释后分别涂布在LB斜面培养基上37°C培养 24h。选择菌落数目约为20个的平板，挑取较大、界限清晰、呈乳白色长势良好的单菌落作为 紫外诱变的出发菌株，取其菌体于生理盐水和玻璃珠的三角瓶中制成无菌菌悬液500mL，30 °C、250rpm水浴4h，制备成10 6CFU/mL的诱变菌悬液，备用。
[0032] 2.菌株诱变及致死率的确定
[0033]紫外灯预热25min，分别取诱变菌悬液10mL置于多个平板(D = 9cm)中，均匀放置紫 外灯下25cm处照射不同的时间（0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60s )，然后分别从每 个平板中取出lmL的菌悬液以生理盐水定容至10mL，逐级稀释至10'10_2、10_ 3、10_4、10_5、 1〇_6倍，取各个梯度的稀释液100uL在暗处涂布于平板固体培养基上，37 °C培养24h后取出， 挑取长势良好的菌落，试管斜面固体培养基保存，进行高产菌株的筛选。同时，用未照射的 菌悬液做空白对照，计算紫外诱变致死率。
[0034]致死率=紫外诱变菌悬液的菌落数/未诱变菌悬液的菌落数 [0035] 3.高产菌株的筛选
[0036] 3.1.平板初筛
[0037]根据紫外诱变选取照射25-30s的诱变菌悬液生理盐水稀释至10'10'10'10 一4、 10-5、10-6倍，分别涂布于平板固体培养基，37°C培养24h。以菌落大小和生长状态为观测指 标选取单菌落35株，试管斜面传代3次后，稳定生长的共6株，分别命名为SM1-6。
[0038] 3.2.摇瓶复筛
[0039] ①菌种：SMI、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。
[0040] ②方法:将上述菌株与出发菌株SM0分别按10 %的接种量，置于装有LB液体培养基 的三角瓶(25mL/100mL)中，37°C培养21h，摇床转速180rpm。
[00411 3.3.菌体浓度的测定
[0042] 采用比浊法测定菌体浓度，取lmL发酵液用无菌蒸馏水稀释10倍，以未接种的培养 基做等量稀释作对照，在650 nm波长处测定细胞悬浮液的光密度(0D)值。
[0043] 3.4.菌种保藏
[0044] 经过复筛所得粘质沙雷氏菌高产优良菌株试管斜面保存于-80°C冰箱。
[0045] 4.结果分析
[0046] 4.1.菌种诱变结果
[0047]粘质沙雷氏菌菌悬液于紫外灯下25cm处照射不同的时间，得到诱变时间与致死率 的关系，见表1。
[0048]表1紫外诱变与致死结果
[0050]据文献报道，紫外诱变通常在偏低剂量中出现正突变，偏高剂量中出现负突变。前 人研究多倾向于低剂量处理细胞，一般致死率控制在70-80%之间。本实验采用的照射时间 为0-60s，结果表明：粘质沙雷氏菌在紫外照射25-30s范围内致死率为70-80%。
[00511 4.2.高产菌株稳定性筛选结果
[0052] 经紫外诱变筛选的SMI、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6稳定性较好的六株菌，与出发菌株 SM0同时进行摇瓶复筛，其中菌株SM1摇瓶发酵得到菌体生物量(细菌数)为10.65亿/mL，高 于其他菌株;并于冰箱_80°C中保藏，定期传代(25d传代一次）。
[0053]表2六株粘质沙雷氏菌摇瓶复筛菌体生物量比较结果
[0055] 4.3.传代稳定性
[0056]将菌株SM-1连续传60代，仍符合粘质沙雷氏菌特性，说明菌株SM-1具有传代稳定 性。
[0057] 4.4.16S rDNA测序