Rnase4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一个新的脑胶质瘤治疗靶点，具体而言，涉及将核 糖核酸酶4蛋白作为脑胶质瘤治疗靶点，还涉及核糖核酸酶4的siRNA、shRNA和中和性抗体， 包括使用该siRNA、shRNA和中和性抗体制备的药物作为靶向抑制脑胶质瘤生长的应用。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤泛指各种神经上皮来源的肿瘤，是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤， 约占全部颅内肿瘤的35%~60%。术语"脑胶质瘤"涵盖了 一类脑部肿瘤，包括星形细胞瘤、 少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤。胶质瘤均呈恶性浸润性生长，即使外科手术也难 以做到病理学的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，是青年和成年人肿瘤死亡的第二 大病因。由于颅内病变位置的特殊性，术后生存者多并发神经功能性障碍、生活质量低下 等。因此，如何提高胶质瘤患者的治愈率和生存率是当前胶质瘤基础研究和临床实践中迫 切需要解决的问题。
[0003] 目前认为，诱发脑胶质瘤发生和发展的因素多样，且具有不确定性。迄今已发现诸 如病毒感染、遗传因素以及癌基因和抑癌基因异常与胶质瘤关系密切。p53、pl6 Ink4a、PTEN和 EGFR等基因突变会影响细胞信号转导和细胞周期等生物学过程，最终导致脑胶质瘤的产生 和恶化。脑胶质细胞内RNA生物代谢的紊乱也可能导致其癌变，如非编码RNA异常调控(包括 上调、下调和突变）、mRNA发生可变剪接、RNA表观遗传学修饰等都与胶质瘤的发生和发展密 切相关。然而，脑胶质瘤发生和发展中引起RNA的生物代谢紊乱的分子机制仍不清楚，寻找 和发现导致脑胶质瘤组织内RNA生物代谢的关键信号通路及调控因子，将为治疗脑胶质瘤 提供新的靶点。
[0004] 核糖核酸酶4(Ribonuclease-4，RNASE4,以下用"RNASE4"简写代表"核糖核酸酶 4"）是人核糖核酸酶家族第四个成员。
[0005] 成熟的RNASE4是一个由119个氨基酸残基组成的分泌型单链碱性蛋白质，相对分 子量约为H.SkDaANASEd作为核糖核酸酶A超家族的成员，主要通过水解底物RNA参与各种 生物学过程。与家族其它成员相同，RNASE4专一性水解RNA链上的嘧啶核苷酸3 '端的5 ' -磷 酯键，进而产生寡核苷酸或核苷酸。RNASE4保留了该家族共有的结构特性，包括三个酶催化 位点(His-12，Lys-40和His-116)、保守序列CKXXNTF(XX为任意氨基酸)和由8个半胱氨酸残 基形成的分子内二硫键（Cys25-Cys81，Cys39-Cys92，Cys57-Cysl07 和 Cys64_Cys71)。然而， RNASE4又具自身的结构特征。与牛胰核糖核酸酶A(RNase A)结构相比较，该酶的C端缺少了 核糖核酸酶活性位点Ser-123，并且核酸催化结合结构域中的一些氨基酸残基也被相应的 替换，例如RNase A上Pr〇-42、Val-43和Lys-104分别被RNASE4上Arg-41、Phe-42和Arg-101 替换。以上独特的结构导致RNASE4有别于其它核糖核酸内切酶，即更偏好于水解尿嘧啶核 苷酸而非胞嘧啶核苷酸。此外，RNASE4是整个核糖核酸酶A超家族中进化最为保守的成员。 RNASE4的一级序列在脊椎动物中的相似度高达90%，远高于家族其它成员。RNASE4这种高 度的物种间保守性和独有的尿嘧啶核苷酸酶切偏好性，提示该酶可能通过其独特的核糖核 酸酶活性执行一些基本的生物学功能。然而，RNASE4是否能够作为上述脑胶质瘤治疗靶点 及作用机制仍未知。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物 中的应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中 的应用，所述RNASE4为核糖核酸酶4蛋白，其具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0008] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的改进:通过靶 向抑制核糖核酸酶4的表达或者活性，从而实现靶向抑制脑胶质瘤生长。
[0009] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 所述靶向抑制核糖核酸酶4表达的方法为:通过慢病毒介导shRNA或者转染试剂介导siRNA 的转染，将上述shRNA或者siRNA转入胶质瘤细胞，沉默胶质瘤细胞内核糖核酸酶4蛋白的表 达。
[0010]作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 所述siRNA/shRNA的核苷酸序列为以下任一：SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4。
[0011] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 所述siRNA/shRNA的核苷酸序列还包括位于核糖核酸酶4上的已知序列的互补序列。
[0012] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 利用核糖核酸酶4蛋白的中和性抗体抑制核糖核酸酶4蛋白的活性和作用。
[0013] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 所述中和性抗体为核糖核酸酶4特异性的兔多克隆抗体和鼠单克隆抗体，以及对上述中和 性抗体的序列进行的人源化替代后得到的抗体序列。
[0014] 作为本发明的RNASE4作为药物靶点在脑胶质瘤抑制药物中的应用的进一步改进： 所述利用核糖核酸酶4的中和性抗体抑制胶质瘤中核糖核酸酶4蛋白活性的方法为:通过将 上述中和性抗体直接作用于胶质瘤细胞体外培养体系，体内静脉注射给药（约10mg/kg/ 2day)，或者局部给药(约2mg/kg/3day)的方法抑制胶质瘤中核糖核酸酶4的作用。
[0015] 本发明4个序列的特征如下：
[0016] SEQ ID N0:1 的序列特征：
[0017] 长度：147个氨基酸；类型：氨基酸；链型：单链；拓扑结构：线型；特性：全长的 RNASE4蛋白包含147个氨基酸，其中编码序列的1-28位为信号肽序列，成熟的肽的分子量为 13.8kDa，等电点为10.3;来源:人类。
[0018] SEQ ID N0:2的序列特征：
[0019]长度：21个核苷酸;类型：核苷酸;链型：单链;拓扑结构：线型；特性:siRNA/shRNA 靶向RNASE4的mRNA作用序列;来源:人类RNASE4基因。
[0020] SEQ ID N0:3的序列特征：
[0021]长度:21个核苷酸;类型：核苷酸;链型：单链;拓扑结构:线型;特性:siRNA/shRNA 靶向RNASE4的mRNA作用序列;来源:人类RNASE4基因。
[0022] SEQ ID N0:4的序列特征：
[0023]长度：21个核苷酸;类型：核苷酸;链型：单链;拓扑结构：线型；特性:siRNA/shRNA 靶向RNASE4的mRNA作用序列;来源:人类RNASE4基因。
[0024]本发明的方案具体如下：
[0025]本发明提供了一个新的脑胶质瘤治疗靶点一一核糖核酸酶4(蛋白序列如SEQ ID NO. 1所示）。具体而言，RNASE4基因在脑胶质母细胞瘤中呈显著性高表达(如图1所示）。进一 步，免疫组织化学分析了 430例临床上不同恶化程度脑胶质瘤患者的肿瘤组织中RNASE4蛋 白的表达水平，Kaplan-Meier存活曲线和Log-Rank检验显示，RNASE4蛋白在恶性脑胶质瘤 (包括III和IV级胶质瘤）中显著性高表达，并且其表达水平和脑胶质瘤患者5年总生存率呈 负相关(如图2所示）。
[0026]本发明提供了一种抑制RNASE4基因表达水平的方法，利用转染试剂介导s iRNA/ shRNA方法、或者慢病毒介导shRNA感染方法，抑制RNASE4基因的表达水平。其中，术语 "siRNA"是指短干扰RNA(Short Interfering RNA，简称"siRNA"），是长度20到25个核苷酸 的双链RNA，能够专一性的方式抑制基因的表达。术语"shRNA"是指小发夹结构RNA (Short Hairpin RNA，简称"shRNA"）是一种短发夹结构的RNA序列，可以经由质粒表达而来，并干扰 靶基因表达。上述特异性靶向RNASE4基因的s iRNA/shRNA是根据其mRNA不同靶点进行设计， 可以有多个不同的siRNA/shRNA序列。例如序列SEQ ID NO.2;SEQ ID NO.3;SEQ ID N0.4所 示为靶向RNASE4的mRNA的三条不同s iRNA/shRNA作用序列。然而，本发明所涉及的RNASE4基 因 siRNA/shRNA不局限于上述三条序列，还包括所有位于RNASE4的mRNA序列其它互补序列。 [0027]本发明提供了一种利用RNASE4的中和性抗体抑制RNASE4蛋白的作用。上述的中和 性抗体直接作用于脑胶质瘤细胞体外培养体系中或者小鼠体内静脉注射给药，抑制RNASE4 蛋白的作用，并抑制脑