一种表面增强拉曼探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学成像领域，尤其涉及一种表面增强拉曼探针，本发明还涉及该表面增强拉曼探针的制备方法，本发明还涉及该表面增强拉曼探针的应用。
【背景技术】
[0002]癌症严重威胁人类的健康和生命安全，是死亡率较高的疾病之一。目前手术切除仍是治疗癌症的最有效方法之一。但是肿瘤组织呈浸润性生长，和周围正常组织没有明显的界限，因此对于肿瘤边界的精确定位一直困扰着临床医生及科研人员。通常，医生凭借经验对肿瘤组织进行切除，如果少切可能会造成患者癌症复发，而多切又会对患者造成伤害。近年来，伴随着纳米科学和技术的发展，用于癌症成像和治疗的纳米材料也得到了人们的广泛关注。纳米材料粒径小，容易通过细胞屏障，并且由于肿瘤组织微血管通透性增加和不健全的淋巴引流系统产生的高通透高滞留效应，使得其优先在肿瘤部位聚集，从而实现对肿瘤的精确定位。其中基于荧光纳米材料的肿瘤荧光成像因其成像快速、灵敏度高、价格低廉而被广泛关注。但是目前肿瘤荧光成像还存在很多问题限制了它的应用，如很多荧光染料具有毒性、生物组织自发荧光的干扰、荧光易发生淬灭等等。
[0003]与荧光成像相比，表面增强拉曼成像特异性好、灵敏度高、不易发生光漂白、不受生物组织自发荧光的干扰，且样品制备简单。但传统的表面增强拉曼探针多是将拉曼分子吸附在粗糙贵金属颗粒表面，探针信号相对较弱、信号稳定性差，体内成像效果不佳。要得到好的成像效果，通常需要信号采集时间长、激光功率大、探针的增强因子大。但是实际应用时又要求成像时间越短越好;并且增强因子越大、激光功率越大，在连续成像时探针就越容易发生光漂白而导致不稳定;且功率加大也会损害样品。因此，制备一种拉曼信号强、信号稳定性高、生物相容性好的表面增强拉曼探针用于生物医学成像，在较低的激光功率和较短的成像时间下，得到好的成像效果是一个迫切需要解决的问题。公开号为CN104914087A，发明名称为“一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及制备方法”的中国专利申请公开了一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及其制备方法，该方法制备的探针拉曼信号强；目前还没有此种表面增强拉曼探针在生物医学成像中应用的文献资料。但此种探针在使用过程中主要存在两个问题:一是其表面活性剂的毒性;二是其在成像过程中的稳定性。探针在制备过程中需要使用高浓度的十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)作为表面活性剂及稳定剂，CTAC具有较大的生物毒性，不适宜直接用于生物医学成像。稳定性方面，探针在长时间成像过程中，受到激光和热的影响会产生光漂白。
【发明内容】
[0004]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种新的表面增强拉曼探针，要解决的技术问题是改善现有拉曼探针的生物相容性和拉曼信号的稳定性。
[0005]为解决上述问题，本发明采取的技术方案是:一种表面增强拉曼探针，所述表面增强拉曼探针包括多层核壳结构金纳米颗粒及包覆在所述多层核壳结构金纳米颗粒外面的介孔二氧化硅层。
[0006]优选地，所述介孔二氧化硅层厚度为5-100nm。
[0007]其中，多层核壳结构金纳米颗粒的制备方法依照公开号为CN104914087A，发明名称为“一种多层核壳结构的表面增强拉曼探针及制备方法”的中国专利申请。
[0008]优选地，所述多层核壳结构金纳米颗粒具有金纳米核，所述金纳米核的外部分布有一层或多层拉曼分子层和一层或多层金壳层，其中第奇数层为所述拉曼分子层，第偶数层为所述金壳层，第一层拉曼分子层位于所述金纳米核的外表面，其余每层拉曼分子层位于其前面一层金壳层的外表面，每层金壳层位于其前面一层拉曼分子层的外表面。
[0009]更优选地，所述金壳层的层数为一层或两层。
[0010]更优选地，所述拉曼分子层中的拉曼分子选自对二巯基苯、对甲苯硫酸、对氨基苯硫酚和2-萘硫醇中的一种。
[0011]本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针的制备方法，所述方法包括如下步骤:
[0012]步骤一:将制备好的多层核壳结构金纳米颗粒加入到表面活性剂的水溶液里，加入碱性溶液调节pH值至10-11，获得碱性的金纳米颗粒溶液；
[0013]步骤二:将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入含正硅酸四乙酯的甲醇溶液，反应获得包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒；
[0014]步骤三:将步骤二所得的金纳米颗粒溶液离心，分散于乙醇中，加入离子交换剂超声，洗涤，获得所述的表面增强拉曼探针。
[0015]优选地，所述表面活性剂选自十六烷基溴化铵和十六烷基氯化铵中的一种;所述碱性溶液选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种;所述离子交换剂选自硝酸铵和氯化铵中的一种。
[0016]优选地，所述方法包括如下步骤:
[00?7]步骤一:将4mg的多层核壳结构金纳米颗粒加入到5ml表面活性剂的水溶液里，加入碱性溶液将溶液的pH值调整至10-11，获得碱性的金纳米颗粒溶液；
[0018]步骤二:将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入含有5%正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次1-1OOul，共加3次，继续搅拌反应10-24h，获得包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒；
[0019]步骤三:将包覆介孔二氧化硅层的多层核壳结构金纳米颗粒离心，分散于乙醇中，加入少量离子交换剂超声，重复洗涤3-5次后离心分散于乙醇中，获得用于成像的表面增强拉曼探针。
[0020]本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在生物医学成像中的应用。
[0021]本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在细胞水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤:
[0022]I)将细胞与表面增强拉曼探针溶液共孵育，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
[0023]2)用拉曼光谱仪对细胞进行拉曼成像。
[0024]优选地，所述方法包括如下步骤:
[0025]I)将细胞与0.0Ol-1OOn mol/L表面增强拉曼探针溶液共同置于细胞培养箱中，以37°C孵育2-24h，使表面增强拉曼探针进入细胞内部；
[0026]2)用拉曼光谱仪对细胞进行超快、超灵敏、超稳定的拉曼成像，可长时间成像，并对成像结果进行分析。
[0027]优选地，所述的细胞为正常细胞或肿瘤细胞株中的一种。
[0028]本发明还提供本发明所提供的表面增强拉曼探针在动物模型水平成像的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤:
[0029]I)构建肿瘤动物模型；
[0030]2)向试验动物体内局部注射表面增强拉曼探针溶液；
[0031]3)使用拉曼光谱仪对试验动物的肿瘤部位进行拉曼成像并对成像结果进行分析。
[0032]优选地，所述方法包括如下步骤:
[0033]I)构建肿瘤动物模型；
[0034]2)将表面增强拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH = 7.4的I3BS溶液中制成0.01-50n mol/L的溶液；
[0035]3)向试验动物体内局部注射经超声分散的0.01-50n mol/L的表面增强拉曼探针溶液；
[0036]4)注射2_24h后，使用拉曼光谱仪对试验动物的肿瘤部位进行超快、超灵敏的拉曼成像并对成像结果进行分析，实现对肿瘤位置及肿瘤边界的快速、精确定位;并且信号稳定不易发生光漂白，可反复成像对肿瘤边界进行确认。
[0037]优选地，所述的