用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊。它包含：复数个双性蛋白质、复数个纳米氧化铁及一亲水性药物及一疏水性药物；其中，该药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊由于以双性蛋白质做为材料，具有良好的生物兼容性，且其仅需单一乳化步骤即能形成纳米级中空结构。因此，本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊具有良好的药物承载量、具有同时包覆亲水性及疏水性药物的能力及药物操控释放的特性，故其可应用于标靶药物传递、核磁共振显影及热疗。
【专利说明】
用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种蛋白质纳米磁性壳核胶囊，特别是一种用于药物传递的蛋白质纳 米磁性壳核胶囊。
【背景技术】
[0002] 药物载体将药物传递至人体的病灶，以达到治疗的效果。为了药物的安全性及有 效性，药物载体系统被广泛地应用于改善药物释放、吸收、分布与代谢上。近年来，随着生物 技术的进步，蛋白质及基因药物的使用越来越多，但蛋白质药物的传输容易被胃酸破坏，造 成药效不佳；另一方面，抗癌药物毒性高，药物传输过程常造成正常细胞的毒害，而引发严 重的副作用；再者，慢性疾病的频繁用药，需要长效剂型以减少服药的频率，上述相关问题 为药物载体开发的重要考虑要点。
[0003] 在目前药物载体的技术中，纳米传递系统目前广泛被应用在医药及生技产业中， 以有机材料所制得的核壳纳米结构被应用来携带药物的载体，该些有机的核壳纳米结构， 例如是由双脂肪层所构成的微脂体（liposome)或由两性高分子所构成的微胞（micelle)， 然而，该些有机的核壳纳米结构具有结构不稳定、制程繁杂及不易控制等问题。此外，这些 技术因使用高分子聚合物作为原料，并使用多种小分子的接口活性剂来稳定接口，因此该 些材料还存有对人体造成毒性的问题。
[0004] 现行使用的抗癌药物常因对正常细胞的毒性，而在临床使用上受到很大的限制。 因此，急需开发方便使用且侵入性低的药物载体，能增加患者使用药物的便利性，并增加药 物对人体的可用率，使药物达到最佳的效果，同时还能减少副作用的产生，以改善患者对药 物的不适。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明揭露一种药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，本发明的壳核 胶囊是利用单一双性蛋白质（amphiphilic protein)与纳米氧化铁进行单一乳化步骤，BP 可形成纳米级中空结构，其中该双性蛋白质作用为稳定剂与界面活性剂，故能形成具有高 包覆药物效率的药物载体，更佳地是，亲水性药物分子及疏水性药物分子可同时存在于本 发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊内。此种利用单一乳化步骤的壳核胶囊的合成省略传统多 次以上的乳化步骤方式，且需要多种接口活性剂来稳定接口。本发明仅需利用蛋白质与纳 米氧化铁的单一乳化步骤即可形成，除了具有更好的生物兼容性，药物载体更具多功能性。
[0006] 本发明提供用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，包含：复数个双性蛋白质 (amphiphilic protein)、复数个纳米氧化铁、一亲水性药物及一疏水性药物，其中该双性 蛋白质具有一亲水端与一疏水端；其中该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包含一水相核层，包含 该亲水性药物；以及一油相壳层，包含该复数个纳米氧化铁及疏水性药物，而该油相壳层包 覆该水相核层，且一部份双性蛋白质介于该油相壳层与水相核层之间，另一部份双性蛋白 质围绕于该油相壳层；其中该双性蛋白质与该纳米氧化铁的比例为1:0. 8至1:16. 7之间。
[0007] 在本发明的一实施例中，其中该一部份双性蛋白质的亲水端界定形成该水相核 层，且该一部份双性蛋白质的疏水端与另一部份双性蛋白质的疏水端界定形成该油相壳 层。
[0008] 在本发明的一实施例中，其中于该油相壳层中该等双性蛋白质的疏水端与该纳米 氧化铁紧密交缠。
[0009] 在本发明的一实施例中，其中该双性蛋白质为胎牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin)或乳铁蛋白（Lactoferrin) 〇
[0010] 在本发明的一实施例中，其中该蛋白质纳米磁性壳核胶囊具有磁操控特性。
[0011] 本发明更提供一种用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的单乳化步骤的制 造方法，由以下步骤所组成：混合复数个双性蛋白质与一亲水性药物以形成一水相核层溶 液；分散复数个纳米氧化铁于一 CHC13溶液中，且加入一疏水性药物于该CHC13溶液中混合 形成一油相壳层溶液；将该水相核层溶液及该油相壳层溶液混合进行乳化步骤，以形成一 乳化液；以及把该乳化液中的CHC1 3完全挥发后，以水清洗，得到该蛋白质纳米磁性壳核胶 囊。
[0012] 本发明另提供一种药物传递系统，包含该蛋白质纳米磁性壳核胶囊。
[0013] 本发明又提供一种核磁共振显影剂，包含该蛋白质纳米磁性壳核胶囊。
[0014] 本发明再提供一种用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，包含：复数个双性 蛋白质（amphiphilic protein)、复数个纳米氧化铁、一亲水性药物及一疏水性药物，其中 该双性蛋白质具有一亲水端与一疏水端；其中一部份双性蛋白质的亲水端界定一第一空 间，该一部份双性蛋白质的疏水端与围绕于该一部份的另一部份双性蛋白质的疏水端共同 界定一第二空间，该第二空间包覆该第一空间，其中该第一药物活性成分容置于该第一空 间，而该磁性纳米粒子容置于该第二空间；其中该第一空间形成一水相核层，该第二空间形 成一油相壳层，且该油相壳层包覆该水相核层；该亲水性药物容置于该水相核层，该疏水性 药物容置于该油相壳层；其中该双性蛋白质与该纳米氧化铁的比例为1:0. 8至1:16. 7之 间，且该双性蛋白质为胎牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin)或乳铁蛋白（Lactoferrin) 〇
[0015] 本发明的用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊为中空球状结构，具有水相核 层及油相壳层结构，因此具有同时包覆亲水性及疏水性药物的能力。在疏水性的油相壳层 中，藉由双性蛋白质的疏水端和油相纳米氧化铁交缠，在乳化过程中纳米氧化铁协助油相 壳层稳定，而该油相壳层除了可以增加结构完整性以有效地保护药物之外，相较于传统技 术使用高分子载体，本发明的纳米载体因含有纳米氧化铁而具有磁操控特性，可以藉由磁 场刺激来进行热疗及载体的药物释放。
[0016] 由于蛋白质受热产生变性而引发载体团聚的效应，使本发明的蛋白质纳米磁性壳 核胶囊经加热后可达到更好的药物累积及目标治疗效应，此外，该蛋白质纳米磁性壳核胶 囊更可经多次离心清洗后重新分散，显示其稳定性极佳。该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的油 相壳层是由双性蛋白质及纳米氧化铁紧密交缠而构成，故该油相壳层除了有稳定该蛋白质 纳米磁性壳核胶囊的壳核结构的功能外，其所创造出壳层的强疏水性环境可以兼具避免水 相核层中的亲水性药物的自然释放及携带疏水性药物两种功能。其中，油相壳层也可以经 由表面修饰来增加标靶能力或改变此载体的性质，提高细胞摄入该胶囊的效率或该胶囊进 入病灶的精确性，对于药物治疗具有相当大的帮助。
[0017] 以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例用以阐明本 发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内， 当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的示意图；
[0019] 图1中，1表示蛋白质纳米磁性壳核胶囊；101表示油相壳层；102表示水相核层； 103表示双性蛋白质；104表示纳米氧化铁；105表示疏水性药物；106表示亲水性药物。
[0020] 图2显示牛血清蛋白（BSA)的疏水片段可夹带脂肪酸（Fatty Acids)、甲状腺素 (Thyroxine)、二氮平（Diazepam)及f丐（Calcium) 〇
[0021] 图3为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的扫描式电子显微镜影像。
[0022] 图4中（a)至（d)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的穿透式电子显微镜影 像；真空干在后的中空结构的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在穿透式电子显微镜中，（a)及（b) 显示油相壳层折迭部分对比较深，（c)及（d)显示纳米氧化铁和牛血清蛋白致密交缠形成 稳定油相壳层。
[0023] 图5为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的扫描式电子显微镜影像。
[0024] 图6中（a)至⑷为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的穿透式电子显微镜影 像；真空干在后的中空结构的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在穿透式电子显微镜中，（a)及（b) 显示油相壳层折迭部分对比较深，（c)及（d)显示利用控制乳铁蛋白浓度可制备实心球状 结构。
[0025] 图7中（a)至（d)为成中空球状结构及实心球状结构的比较图；其中，（a)为中空 球状结构及实心球状结构的粒径分布图；(b)为中空球状结构及实心球状结构的亲水性药 物（Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol)的包覆率数据图；（c)为中空球状结构及实 心球状结构的药物释放率；（d)为子宫颈癌Hela细胞株养在中空球状结构的本发明的蛋白 质纳米磁性壳核胶囊两小时以后的影像图；量子点以白色箭头表示。
[0026] 图8(a)至（c)显示不同浓度的双性蛋白质（牛血清蛋白）对的蛋白质纳米磁性 壳核胶囊的影响；其中，（a)为牛血清蛋白的重量百分浓度< 1%、（b)为牛血清蛋白的重量 百分浓度1 %~4%及（c)为牛血清蛋白的重量百分浓度> 4%。
[0027] 图9中（a)至（e)显示调整胎牛血清蛋白的浓度及Fe304的浓度可以调整蛋白质 纳米磁性壳核胶囊大小；(a)及（b)为lwt% BSA、8. 35wt% Fe304的条件下形成的蛋白质纳 米磁性壳核胶囊的扫描式电子影像图；（c)及（d)为2wt% BSA、16. 7wt% Fe304的条件下形 成的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的扫描式电子影像图；(e)为该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的 粒径分布图。
[0028] 图10为不同含铁量的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径分布图。
[0029] 图11(a)至（f)显示本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同温度下蛋白质纳米 磁性壳核胶囊型貌、表面电荷及水动力半径（Hydrodynamic radius) ; (a)至（d)为本发明 的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在高温下会有团聚现象的扫描式电子影像图；(a)及（c)为室 温环境下；(b)及（d)为加热至60°C;(e)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同温度 下的电荷分布图；（f)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同pH值下的粒径分布图。
[0030] 图12为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同pH值下的水合半径分布图。
[0031] 图13为肺癌A549细胞株分别在不同浓度的本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的 存活率的数据图；控制组为不加蛋白质纳米磁性壳核胶囊。
[0032] 图14为子宫颈癌Hela细胞株分别培养在10mg/mL高浓度及3mg/mL低浓度的本 发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的影像图；量子点以白色箭头表示。
[0033] 图15中（a)及（b)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的磁敏感特性的曲线图； (a)为不同强度高周波磁场强度（16kA/m及8kA/m)刺激的药物释放曲线图，（b)为利用磁 场的开关可达到调控药物释放速度的药物释放曲线图。16kA/m-Doxo及8kA/m-Doxo分别表 示该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包覆亲水性药物（Doxorubicin)施加16kA/m或8kA/m磁场 10分钟；16kA/m-PTX分别表示该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包覆疏水性药物（Paclitaxol) 施加16kA/m或8kA/m磁场10分钟；DE-Doxo与DE-PTX表示未施加磁场的载体药物释放情 形。
[0034] 图16中（a)及（b)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的动物试验结果；(a) 显示该蛋白质纳米磁性壳核胶囊可累积于小鼠肿瘤位置的影像图，（b)显示该蛋白质纳 米磁性壳核胶囊可经过30天的磁场治疗可降低小鼠肿瘤生长的曲线图。H)-VN S表示含 有亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol)的蛋白质纳米磁性壳核胶囊； ro-VNs-MFx3及ro-VNs-MFxl分别表示3次或1次磁场治疗的含亲水性药物与疏水性药物 的蛋白质纳米磁性壳核胶囊；FO表示单纯Doxorubicin与Paclitaxol ;VNs+MF表示该蛋白 质纳米磁性壳核胶囊加磁场；PD-VNs表示含Doxorubicin与Paclitaxol的蛋白质纳米磁 性壳核胶囊；Control为仅施打生理食盐水的控制组。
【具体实施方式】
[0035] 本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，该壳核胶囊利用单一双性蛋白质 (amphiphilic protein)与纳米氧化铁进行单一乳化步骤，即可形成纳米级中空结构。药物 的包覆可在蛋白质纳米磁性壳核胶囊制程中直接进行，以提升药物包覆率。除了可以同时 包覆疏水性及亲水性二种截然不同特性的药物进行控制释放之外，纳米氧化铁更能应用核 磁共振显影及热疗方面；该蛋白质纳米磁性壳核胶囊也可经过简单的修饰，使其具有标靶 特定部位的功能。
[0036] 实施例1本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的制备
[0037] 本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其藉由单一双性蛋白质与纳米氧化铁，经过 生物性考虑的挥发性溶剂的使用，即可以简单的单一乳化步骤形成一纳米中空结构。相较 于习知技术要形成中空结构的技术，须经过多次以上的乳化步骤，先形成水/油结构，习知 技术再经第二次乳化形成水/油/水的构造；而本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其核层 与壳层都是双性蛋白质，所以制备方法只需要经过一次乳化步骤即可形成水/油/水的中 空结构，双性蛋白质和纳米氧化铁结合可以稳定油相壳层，并具有同时包覆亲水性及疏水 性药物的能力。
[0038] 1. 1单一双性蛋白质以牛血清蛋白（Bovine serum albumin, BSA)为例
[0039] 本实施例以牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)为材料与油相纳米氧 化铁，较佳为磁性纳米铁，来说明本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的制程和应用，其应 用以疏水性药物紫杉醇（Paclitaxel，PTX)和亲水性药物盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride，D0X)为例。
[0040] 蛋白质纳米磁性壳核胶囊的制备方法如下：
[0041] 1 ·先配置BSA水溶液、D0X水溶液、紫杉醇（Pac 1 itaxe 1，PTX)溶液。
[0042] 2.合成5nm油相氧化铁（Fe304)，将Fe304去除乙醇后，分散于100L的CHC1 3中，并 加入PTX溶液，作为油相（oil phase)备用。
[0043] 3.将BSA溶液和D0X溶液做为水相（water phase)，与步骤2油相（oil phase) 溶液混合，利用能量超音波进行乳化30秒，待完全乳化后，置于通风操作台搅拌，于室温将 CHC13完全挥发。
[0044] 4.将产物用Milli-Q超纯水、8000rpm离心清洗三次后，再用Milli-Q超纯水溶。
[0045] 经由上述条件所乳化形成的本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊1为中空结构，其 结构如图1所示，其由双性蛋白质103,较佳实施例为牛血清蛋白（BSA)亲水端围绕形成水 相核层102,油相壳层101包覆着水相核层102。其中，油相壳层101是由双性蛋白质103 及油相纳米氧化铁104,较佳实施例为牛血清蛋白与油相纳米氧化铁紧密交缠而构成，故该 油相壳层101除了有稳定该蛋白质纳米磁性壳核胶囊1的壳核结构的功能外，其所创造出 油相壳层的强疏水性环境可以兼具避免水相核层102中的亲水性药物106的自然释放、及 携带疏水性药物105两种功能。而油相纳米氧化铁104使该蛋白质纳米磁性壳核胶囊1具 有磁操控特性。
[0046] 双性蛋白质例如牛血清蛋白（BSA)序列具有亲水性与疏水性的结构域，疏水 结构域可以携带油相分子，例如：脂肪酸（Fatty acid)、甲状腺素（Thyroxine)、二氮平 (Diazepam)及|丐（Calcium)，如图2所示，油相氧化铁会与这些位置结合，而亲水端许多含 0H官能基的胺基酸（amino acid)会朝向水溶液，因此牛血清蛋白可以存在于两相之间。根 据界面活性剂的HLB值（hydrophilic-lipophilic balance value,亲水-疏水平衡值）， BSA在特定浓度下具有稳定油/水（HLB值：8~16)和水/油（HLB值：3~8)界面的特性， 能够同时当作水/油及油/水的乳化剂使用，因此能自组装形成水-油-水的中空结构。
[0047] 发明人分别利用扫描式电子显微镜及穿透式电子显微镜分析本发明的蛋白质纳 米磁性壳核胶囊的结构，其结果如图3及图4所示，图3为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶 囊的扫描式电子显微镜影像，将本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊用去离子水洗净后，真 空干燥所拍摄的影像，由于蛋白质没有钢性性质，故干燥后的蛋白质纳米磁性壳核胶囊会 有明显的塌陷或皱缩的形貌，因为油相含有氧化铁不会蒸发，显示蛋白质纳米磁性壳核胶 囊内部确实为水相结构。图4中（a)至（d)为本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的穿透式 电子显微镜影像，其更可以清楚观察蛋白质纳米磁性壳核胶囊干燥皱缩后的透视结构，对 比较深的黑色颗粒为氧化铁，在氧化铁外有一层对比较淡的部分则是牛血清蛋白（图4中 (a)及（b))，氧化铁和牛血清蛋紧密结合形成具有可挠性的油相壳层（图4中（c)及（d))。
[0048] 1. 2双性蛋白质以乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf)为例
[0049] 本实施例以乳铁蛋白（Lactoferrin，Lf)材料与油相纳米氧化铁，较佳为磁性 纳米铁，来说明本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊和应用，其应用以疏水性药物紫杉醇 (Paclitaxel，PTX)和亲水性药物盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride)为例，其制 备方法如同实施例1. 1所述。
[0050] 经由上述条件所乳化形成的本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊为中空结构，该蛋 白质纳米磁性壳核胶囊也会呈现出壳核结构，其中壳为乳铁蛋白与氧化铁所组成的复合 物，如图5所示，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包覆亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性药物 (Paclitaxol)后，纳米结构依然保持于原来特性，其中空结构经干燥后产生凹陷，此结构的 形成机制也与实施例1. 1的结果一致。
[0051] 不过由于利用乳铁蛋白制造的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径大小与利用BSA 制造的不同，在穿透式电子显微镜观察下，如图6中（a)至（d)所示，利用乳铁蛋白制造的 蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径大小约为160nm，真空干燥后的中空结构的蛋白质纳米磁 性壳核胶囊可精楚观察到油相壳层折迭部分对比较深（图6中（a)及（b));本发明并可利 用控制乳铁蛋白的比例，降低乳铁蛋白的浓度形成实心球状结构（图6中（c)至（d))。
[0052] 本发明分析该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径，并以利用控制乳铁蛋白的比例形 成中空球状结构及实心球状结构作比较，其中〇. 5wt% _8wt %乳铁蛋白搭配氧化铁可行成 中空球，0. lwt% -0. 5wt%形成实心球。如图7中（a)所示，其中该蛋白质纳米磁性壳核 胶囊的中空球状结构的粒径大小较大约为220nm，而本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的 实心球状结构的粒径大小大约只有130nm，其粒径会相较于穿透式电子显微镜下观察较大， 其原因为载体的水合半径造成量测不同。在包药测试下，如图7中（b)所示，亲水性药物 (Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol)皆可以包覆于该些结构当中，由于中空结构其 具有亲水核，因此可以包覆更多亲水性药物。在长时间药物释放测定下，如图7中（c)所 示，两种结构的药物释放皆可以达到缓慢释放的效果。此外，在子宫颈癌Hela细胞摄入实 验中，经培养两个小时后，如图7中（d)所示，可以发现中空球状结构的蛋白质纳米磁性壳 核胶囊可以大量的被癌细胞吞入，并分散在细胞质当中，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊量子 点以白色箭头标示，证实本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊具有标靶功能。
[0053] 1. 3双性蛋白质的浓度对本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的影响
[0054] 在上述制备方法中，在氧化铁为0. 017g/mL的情况下，分别调整双性蛋白质的重 量百分浓度为< 1 %、1 %~4%及> 4%测试该蛋白质纳米磁性壳核胶囊是否形成。双性蛋 白质为牛血清蛋白测试结果陈列于表1及图8中（a)至（c)、双性蛋白质为乳铁蛋白测试结 果陈列于表2,皆显示出当双性蛋白质重量百分比在1%~4%时，会形成中空结构，且该蛋 白质纳米磁性壳核胶囊的粒径大小低于200nm(图8中（b));而当双性蛋白质浓度过低或 过高时，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊不易形成（图8中（a)及（c))。
[0055] 表1、牛血清蛋白的浓度对的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的影响
[0056]
[0057] 表2、乳铁蛋白的浓度对的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的影响
[0058]
[0059] 实施例2本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径大小
[0060] 本发明藉由调整Fe304的浓度、环境温度、pH值改变蛋白质纳米磁性壳核胶囊大 小，证实本发明蛋白质纳米磁性壳核胶囊大小可以人为控制，提供更为广泛的应用。
[0061] 2. 1调整胎牛血清蛋白及Fe304的浓度
[0062] 本发明藉由在前述的范围内调整胎牛血清蛋白及Fe304的浓度可改变本发明实施 例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊大小：图9中（a)及（d)为利用动态光散射仪分析本发 明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的结构；图9中（a)及（b)为lwt% BSA、8. 35wt% Fe304的条 件下形成的蛋白质纳米磁性壳核胶囊；图9中（c)及（d)为2wt% BSA、16. 7wt% Fe304的条 件下形成的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，证实随着氧化铁浓度的提升，合成蛋白质纳米磁性 壳核胶囊的粒径亦随之增加，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径分布图如图9中（e)所示。
[0063] 本发明不同含铁量的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，有不同的外观，藉由调整本发明 实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的氧化铁浓度，可以改变载体的粒径分布与大小， 如图10所示，不同含铁量的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的粒径分布图，含铁量越高粒径越 大。
[0064] 2. 2改变温度
[0065] 本发明实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同温度下的形貌，如图11中 (a)及（c)所示，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊在室温下为分散状态；如图11中（b)及⑷ 所示，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊加热样品至60°C为团聚状态，故该蛋白质纳米磁性壳核 胶囊随温度升高会有团聚现象产生。同时，本发明利用表面电位（zeta potential)检测该 蛋白质/氧化铁纳米磁性壳胶在不同温度下的电荷变化，如图11中（e)所示，增加该蛋白 质纳米磁性壳核胶囊的环境温度，会造成电性减少而产生团聚效应；本发明利用动态光散 射（dynamic light scattering)量测不同温度下该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的水动力半 径（Hydrodynamic radius)变化，亦证实本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊经加热后产生 蛋白质变性，而引发该蛋白质纳米磁性壳核胶囊载体团聚的效应，以达到更好的药物累积 及目标治疗效应。
[0066] 2. 3 改变 pH 值
[0067] 本发明实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在不同pH值下的水合半径，如表3 及图12所示，会随pH值下降而逐渐增加，且该些水合半径皆能维持本发明蛋白质纳米磁性 壳核胶囊原来的结构；证实本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊在较酸的环境下亦可维持原 结构特征。
[0068] 表3、不同pH值下的本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的水合半径
[0069]
[0070] 实施例3本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的生物兼容性
[0071] 本发明利用肺癌A549细胞株进行实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的生物 兼容性试验，肺癌A549细胞株分别在不同浓度蛋白质纳米磁性壳核胶囊的培养下，如图13 所示，其存活率与不加蛋白质纳米磁性壳核胶囊的控制组比较几乎没有差异，证实本发明 的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的生物兼容性极佳。
[0072] 此外，本发明利用子宫颈癌Hela细胞株分别在含有10mg/mL高浓度及3mg/mL低 浓度实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的培养基培养下，如图14所示，该蛋白质纳米 磁性壳核胶囊量子点以白色箭头标示，细胞透过核体内区隔（endosomal compartments)的 方式，可以摄取不经过任何修饰的蛋白质纳米磁性壳核胶囊；且高浓度的蛋白质纳米磁性 壳核胶囊，或细胞培养时间越久，将增加该蛋白质纳米磁性壳核胶囊在细胞的累积量。因 此，本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊除具有极佳的生物兼容性外。
[0073] 实施例4本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的磁的敏感特性
[0074] 本发明为检测该蛋白质纳米磁性壳核胶囊的磁敏感特性，分别以不同强度高周波 磁场强度（16kA/m及8kA/m)刺激后，如图15中（a)所示，16kA/m-Doxo表示该蛋白质纳米 磁性壳核胶囊包覆亲水性药物（Doxorubicin)施加16kA/m磁场10分钟，而16kA/m-PTX表 示该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包覆疏水性药物（Paclitaxol)施加16kA/m磁场10分钟，经 由磁场刺激后，药物皆能够达到快速释放的目的，图15中（a)图中DE-D 〇X〇与DE-PTX表示 未施加磁场的载体药物释放情形，其释放相对缓慢。图15中（b)则表示蛋白质纳米磁性壳 核胶囊包覆亲水性药物（Doxorubicin)或疏水性药物（Paclitaxol)，在开-关磁场下的药 物释放情形，可以发现药物可以随磁场快速释放。
[0075] 本发明利用磁场的开关可达到调控药物释放速度的目的，未给予磁场时，该蛋白 质纳米磁性壳核胶囊可将药物良好包覆于核内，当磁场一开启，药物迅速且精准的大量释 放。
[0076] 实施例5本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的动物试验
[0077] 本发明将实施例1. 1的蛋白质纳米磁性壳核胶囊（PD-VNs)进行荧光分子cy5. 5 标定，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊（PD-VNs)已含有亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性 药物（Paclitaxol);再将该蛋白质纳米磁性壳核胶囊利用尾静脉注入裸鼠中，经过3次磁 场治疗（PD-VNs-MFx3)或1次磁场治疗（PD-VNs-MFxl)。以用非侵入式活体分子影像系 统（Caliper IVIS system)作为观测肿瘤、蛋白质纳米磁性壳核胶囊分布，观察动物整体 的变化。并另以仅用单纯亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol) (PD)、 含有亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol)的蛋白质纳米磁性壳核胶囊 (ro-VNs)及该蛋白质纳米磁性壳核胶囊（不含药）加磁场（VNs+MF)作为对照组，以及仅施 打生理食盐水的控制组（control)。本实施例是方法为每只实验老鼠的体重及肿瘤大小将 固定一位成员观察测量，每周观察纪录3次。由于肿瘤形成椭圆形状，利用光标尺测量肿瘤 直径最长为a，直径最长为b，故肿瘤体积的计算依下列公式=l/2ab2。
[0078] 结果如图16中（b)所示，经过3次磁场治疗（PD-VNs_MFx3)或1次磁场治疗 (ro-VNs-MFxl)，并持续观察30天，其皆可达到抑制肿瘤生长的目的，以3次磁场治疗为最 佳；而仅用单纯亲水性药物（Doxorubicin)与疏水性药物（Paclitaxol)的H)，贝lj因药物被 代谢掉，造成药物毒杀性质不够强，而显示肿瘤持续生长。另外，该蛋白质纳米磁性壳核胶 囊（不含药）加磁场（VNs+MF)、或含Doxorubicin与Paclitaxol的蛋白质纳米磁性壳核胶 囊（PD-VNs)且不外加磁场则有部分抑制效果；Control为仅施打生理食盐水的控制组，无 抑制效果。
[0079] 另外，本发明将荧光染剂作为模拟药物包覆于本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊 内，再注射至小鼠体内，如图16中（a)所示，经由影像可观察到该其可累积于小鼠肿瘤位 置。
[0080] 经由上述结果证实本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊具有良好的磁敏感特性，故 有益于长时间的药物控制。
[0081] 综上所述，本发明的蛋白质纳米磁性壳核胶囊仅由一般的双性蛋白质所构成，其 材料为双性蛋白质，极具生物兼容性；且氧化铁媒介更可为该蛋白质纳米磁性壳核胶囊具 有药物操控释放及热疗的能力及核磁共振显影剂的特性，再者，不须经过繁复的改质或聚 合，不同以往需要交联反应来增加结构在溶液中的稳定性；其制程十分简单，利用单一双性 蛋白质即可同时稳定油/水及水/油的界面；药物包覆也可于合成该蛋白质纳米磁性壳核 胶囊时一并完成，不仅简化制程，在包覆药物的效率上也较高；且该蛋白质纳米磁性壳核胶 囊可同时包覆亲水及疏水两种特性的药物，应用性更为广泛。
【主权项】
1. 一种用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，包含：复数个双性蛋白质、复数个 纳米氧化铁、一亲水性药物及一疏水性药物，其中该双性蛋白质具有一亲水端与一疏水 端； 其中，该蛋白质纳米磁性壳核胶囊包含一水相核层，包含该亲水性药物；以及一油相 壳层，包含该复数个纳米氧化铁及该疏水性药物，而该油相壳层包覆该水相核层，且一部份 双性蛋白质介于该油相壳层与水相核层之间，另一部份双性蛋白质围绕于该油相壳层； 其中该双性蛋白质与该纳米氧化铁的比例为1:0. 8至1:16. 7之间。2. 如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其中该一部份双性蛋白质的亲水端 界定形成该水相核层，且该一部份双性蛋白质的疏水端与另一部份双性蛋白质的疏水端界 定形成该油相壳层。3. 如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其中于该油相壳层中该等双性蛋白 质的疏水端与该纳米氧化铁紧密交缠。4. 如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其中该双性蛋白质为胎牛血清蛋白 或乳铁蛋白。5. 如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其中该等纳米氧化铁赋予该蛋白质 纳米磁性壳核胶囊具有磁操控特性。6. -种如权利要求1所述的用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊的单乳化步骤 的制造方法，是由以下步骤所组成： 混合复数个双性蛋白质与一亲水性药物以形成一水相核层溶液； 分散复数个纳米氧化铁于一 CHC13溶液中，且加入一疏水性药物于该CHC13溶液中混合 形成一油相壳层溶液； 将该水相核层溶液及该油相壳层溶液混合进行乳化步骤，以形成一乳化液；以及 把该乳化液中的CHC13完全挥发后，以水清洗，得到该蛋白质纳米磁性壳核胶囊。7. -种药物传递系统，包含如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊。8. -种核磁共振显影剂，包含如权利要求1所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊。9. 一种用于药物传递的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，包含：复数个双性蛋白质、复数个 纳米氧化铁、一亲水性药物及一疏水性药物，其中该双性蛋白质具有一亲水端与一疏水 端； 其中一部份双性蛋白质的亲水端界定一第一空间，该一部份双性蛋白质的疏水端与围 绕于该一部份的另一部份双性蛋白质的疏水端共同界定一第二空间，该第二空间包覆该第 一空间，其中该第一药物活性成分容置于该第一空间，而该磁性纳米粒子容置于该第二空 间； 其中该第一空间形成一水相核层，该第二空间形成一油相壳层，且该油相壳层包覆该 水相核层；该亲水性药物容置于该水相核层，该疏水性药物容置于该油相壳层； 其中该双性蛋白质与该纳米氧化铁的比例为1:0. 8至1:16. 7之间。10. 如权利要求9所述的蛋白质纳米磁性壳核胶囊，其中该双性蛋白质为胎牛血清蛋 白或乳铁蛋白。
【文档编号】A61K47/42GK105832702SQ201510015520
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】胡尚秀, 李昀庭, 方人弘
【申请人】胡尚秀