一种生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法。本发明采用自制培养基，生产工艺简单，成本低廉，经牦牛安全性试验和免疫性试验证实，本发明的疫苗具有对大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌的免疫作用，比各单苗使用方便，只需免疫一次，就可以预防两种疾病，减轻了免疫接种工作量，避免了因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败，具有安全性好、免疫效力高、保存期长等优点。
【专利说明】
一种生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法
[0001]技术领域本发明涉及一种生产大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法，属于生物学领域，特别是兽用生物制品领域。
【背景技术】
[0002]牦牛是西藏牧民赖以生存的一种重要家畜，西藏现有牦牛约五千万头。而牦牛大肠埃希氏菌病严重危害着牦牛养殖产业。当前牦牛大肠埃希氏菌病发病率为10%，死亡率为25%。牦牛的死亡，给农牧民带来较大的经济损失。日前对牦牛大肠埃希氏菌病疫苗的研究只有牦牛大肠埃希氏菌病铝胶佐剂灭活疫苗。该病最早发生于母牦牛，以泌乳期的母牦牛最易感染，其次为1-4月龄犊牛，公牦牛次之。患病和带菌牦牛是主要的传染源，牦牛通过消化道感染。本病每年4-6月为发病高峰期，一般呈散发或地方流行性，以小肠的出血性或水样水肿为特征。患病成年牦牛高热、寒颤、食欲废绝、呼吸困难;有的表现出中毒性神经症状，之后昏迷死亡。牦牛巴氏杆菌病又称为牦牛出血性败血症，简称牦牛出败，是由多杀性巴氏杆菌引起的牦牛的一种败血性传染病。该病急性经过时呈败血性变化，慢性经过时则表现为皮下组织、关节、各脏器的局限性化脓性炎症。该病在牦牛产区发病率为2%左右，但致死率90%左右，因此危害很大，是目前牦牛强制免疫的重要疾病之一。牦牛出败呈散发性或地方流行性，一年四季均可发生，但秋冬季节发病较多，一年以上的壮年牦牛发病较多。
[0003]我国兽医生物制品中，制苗用菌液生产采用的是传统的天然培养基，如普通肉汤、马丁汤、肉肝胃膜消化汤等，制作繁琐。其主要成分肉浸液受动物的种类、年龄、及肉源的新鲜与消化程度影响大，造成疫苗的质量不稳定。大规模发酵用自制培养基按照细菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有培养菌数高、质量稳定、操作简便等优点。自制培养基是细菌冻干活疫苗质量好坏的关键因素。而且现有技术中，没有关于防治牦牛传染病的二联疫苗。有鉴于此，本发明的目的在于提供一种巴氏杆菌、大肠埃希氏菌病二联灭活疫苗，所用自制培养基适合牦牛致病性大肠埃希氏、巴氏杆菌株生长、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整。疫苗具有对大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌的免疫作用，比各单苗使用方便，只需免疫一次，就可以预防两种疾病，减轻了免疫接种工作量，避免了因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败，具有安全性好、免疫效力高、保存期长等优点。
【发明内容】
[0004]大肠埃希氏菌购自西藏农牧学院。该牦牛大肠埃希氏菌编号为藏-9903，该菌株的保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 208216。该菌属于已知菌株，在现有技术中已公开。巴氏杆菌(CVCC393)购自中国兽医药品监查所。毒株的标准及保存方法同“中华人民共和国兽用生物制品规程”的规定。
[0005]将牦牛大肠埃希氏菌(藏-9903)种子液按培养基总量的1%?2%接种于以胰酪蛋白胨、琼脂粉和酵母浸出粉为主要原材料的液体自制培养基中，30-45°C发酵或通气培养10?36h，培养过程中根据pH升高情况加入适量质量浓度为30%的灭菌葡萄糖溶液以控制pH值。培养结束后，立即加入浓缩后的巴氏杆菌种子菌液，加入1.5%明胶和5%蔗糖，加入经过灭菌处理并预热至37°C的常用的冻干保护剂，分装冻干。每头份活菌数不少于3 X19CFU0
[0006]本发明的详细描述
[0007]1.制备制苗用菌液
[0008](I)取(TC保存的牦牛大肠埃希氏菌真空冷冻干燥菌株I支，将冻干菌株融化后培养于液体培养基中，取液体培养物各划线2副普通琼脂平板，选择圆形、光滑、边缘整齐、大小适中的菌落各5个，37 °C培养20h后，接种到2.5 %的蛋白胨牦牛肉汤培养基中，置37 °C 140?16(^/11^11摇震培养2411后镜检及纯粹检验后，接种2.5%的蛋白胨牦牛肉汤大二角瓶的培养基中，置37°C140?160r/min摇震培养24h。
[0009](2)将巴氏杆菌菌种复苏传代后培养增殖，经深层通气发酵培养或扁瓶固体培养后，收集菌液，并浓缩备用。
[0010]2.培养基采用本发明设计的自制培养基
[0011](I)配方(W/V)如下:
[0012]胰酪蛋白胨3 %?5 %、酵母浸出粉I %?2 %、氯化钠0.08%,磷酸二氢钾0.007%,磷酸氢二钠0.09 %和葡萄糖0.1 %，1.5 %明胶和5 %蔗糖。
[0013](2)自制培养基配制方法
[0014]按上述配方依次称取培养基成分加入到注射用水中，充分溶解后用lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7左右，120°C灭菌45min。临用时，无菌操作加入终浓度I %的50%葡萄糖溶液，混匀。
[0015]30%葡萄糖溶液(W/V)称取30g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，120°C灭菌45111；[11，3?7°(^保存。
[0016]lmol/L的氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠，加注射用水溶解，定容至100ml，120°C灭菌45min，3?7°C保存。配制好1.5%明胶和5%蔗糖明胶与蔗糖溶液10ml备用。
[0017]3疫苗制造
[0018]将牦牛大肠埃希氏菌种子液按培养基总量的1.5%接种于以胰酪蛋白胨、琼脂粉和酵母浸出粉为主要原材料的液体自制培养基中，35°(:发酵或通气培养10?36h，根据pH升高情况加入适量质量浓度为30%的灭菌葡萄糖溶液以控制pH值。培养结束后立即加入浓缩后的巴氏杆菌种子菌液，加入1.5%明胶和5%蔗糖，加入经过灭菌处理并预热至37°C的冻干保护剂，充分混匀分装后，真空冷冻干燥而成。每头份活菌数不少于3X109CFU。
[0019]用于本发明的常用冻干保护剂可以是任意市售的冻干保护剂，优选明胶、蔗糖、葡萄糖、白蛋白、聚乙二醇。
[0020]本发明的积极效果
[0021]牦牛感染大肠埃希氏菌、巴氏杆菌疫病现状较为严重，给藏区牧民带来很大损失。本发明的防治牦牛传染病的二联疫苗在现有技术中没有报道过。且现有技术中非多联疫苗通常采用的是普通肉汤培养基，制作繁琐、制备过程中各种因素稳定性差，其制成的培养基批间质量差异较大，进而影响疫苗的均一性。而本发明所提供的自制培养基，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的大肠埃希氏菌、巴氏杆菌二联疫苗生产提供了有力的保障。本发明采用自制培养基，生产工艺简单，成本低廉，经牦牛安全性试验和免疫性试验证实，本发明的疫苗具有对大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌的免疫作用，比各单苗使用方便，只需免疫一次，就可以预防两种疾病，减轻了免疫接种工作量，避免了因频繁免疫所造成的免疫麻痹和免疫失败，具有安全性好、免疫效力高、保存期长等优点。
[0022]实施例1
[0023]1.制备制苗用菌液
[0024](I)取0°C保存的牦牛大肠埃希氏菌(藏-9903)真空冷冻干燥菌株I支，将冻干菌株融化后培养于液体培养基中，取液体培养物各划线2副普通琼脂平板，选择圆形、光滑、边缘整齐、大小适中的菌落各5个，37 °C培养20h后，接种到2.5 %的蛋白胨牦牛肉汤培养基中，置37 °C 160r/min摇震培养24h后镜检及纯粹检验后，接种2.5 %的蛋白胨牦牛肉汤大二角瓶的培养基中，置37°C160r/min摇震培养24h。
[0025](2)将多杀性巴氏杆菌菌种复苏传代后培养增殖，经深层通气发酵培养或扁瓶固体培养后，收集菌液，并浓缩备用。
[0026]2.培养基采用本发明设计的自制培养基
[0027](I)配方(W/V)如下:
[0028]胰酪蛋白5 %、酵母浸出粉2 %、氯化钠0.08%,磷酸二氢钾0.007%,磷酸氢二钠
0.09%和葡萄糖0.1 %，1.5%明胶和5%蔗糖。
[0029](2)自制培养基配制方法
[0030]按上述配方依次称取培养基成分加入到注射用水中，充分溶解后用lmol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7左右，120°C灭菌45min。临用时，无菌操作加入终浓度I %的50%葡萄糖溶液，混匀。
[0031]50%葡萄糖溶液(W/V)称取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，120°C灭菌45min，4°C 保存。
[0032]lmol/L的氢氧化钠溶液称取4g氢氧化钠，加注射用水溶解，定容至100ml，120°C灭菌45min，4°C保存。配制好1.5 %明胶和5 %蔗糖明胶与蔗糖溶液10ml备用。
[0033]3疫苗制造
[0034]将牦牛大肠埃希氏菌种子液按培养基总量的1.5%接种于以胰酪蛋白胨、琼脂粉和酵母浸出粉为主要原材料的液体自制培养基中，35°C发酵或通气培养24h，根据pH升高情况加入适量质量浓度为30%的灭菌葡萄糖溶液以控制pH值。培养结束后立即加入浓缩后的巴氏杆菌种子菌液，加入1.5%明胶和5%蔗糖，加入经过灭菌处理并预热至37°C的明胶，充分混匀分装后，真空冷冻干燥而成。每头份活菌数不少于3 X 109CFU。
[0035]4成品检验
[0036]性状乳白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
[0037]纯粹检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，纯粹检验合格。
[0038]活菌计数按瓶签注明头份，用普通琼脂平板做活菌计数(按《中国兽药典》规定的方法进行)。每头份含活菌数不少于3 X 19CFU0
[0039]安全检验按瓶签注明头份，将疫苗用普通肉汤或蛋白胨水稀释，皮下注射体重1.5?2.0kg兔2只，各1.0ml(含2头份)，观察21日，存活。
[0040]剩余水分测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，不超过4.0%。
[0041]真空度测定按《中国兽药典》规定的方法进行测定，符合规定。
[0042]实施例2
[0043]安全性试验
[0044]选用1-3月龄的西藏健康牦牛牛犊20头，随机分为5组，每组4头。1-4组为试验组，每组各接种I批牦牛大肠埃希氏菌和巴氏杆菌病灭活疫苗，每头接种2mL;l、3组牦牛在颈部皮下接种;2、4组牦牛在臀部肌肉接种。牦牛接种后14日，在与首次接种的相同部位重复接种疫苗4!11匕5组为对照组，每头牦牛注射肉汤的剂量和方法同试验组。试验组和对照组初次接种后和再次接种后均观察结果至14日。
[0045]试验组初次接种后和再次接种后观察牦牛均健活，体温、呼吸、心音等与接种前相同，均正常。对照组牦牛均健活。
[0046]实施例3
[0047]免疫效力试验
[0048]选用1-3月龄的西藏健康牦牛牛犊20头，随机分为5组，每组4头。1-4组为试验组，每组各接种I批牦牛大肠埃希氏菌和巴氏杆菌病灭活疫苗，每头接种2mL;l、3组牦牛在颈部皮下接种;2、4组牦牛在臀部肌肉接种。牦牛接种后14日，在与首次接种的相同部位重复接种疫苗2!11匕5组为对照组，每头牦牛注射肉汤的剂量和方法同试验组。再次接种24小时后，将1-2组牦牛分别肌肉注射牦牛大肠埃希氏菌的菌液2M LD(2倍最小致死量)，观察14天。将3-5组牦牛分别肌肉注射牦牛大肠埃希氏菌的菌液IM LD(最小致死量)，观察14天。
[0049]I至4组牦牛攻毒后，16头牦牛均存活;5组牦牛攻毒后，全部死亡。
[0050]将上述1-2组牦牛分别肌肉注射牦牛巴氏杆菌的菌液2M LD(2倍最小致死量)，观察14天。将3-4组牦牛分别肌肉注射牦牛巴氏杆菌的菌液IM LD(最小致死量)，观察14天。同时选取4头1-3月龄的西藏健康牦牛牛犊左为5组为对照组，每头牦牛注射肉汤的剂量和方法同试验组，肌肉注射牦牛巴氏杆菌的菌液IM LD(最小致死量)，观察14天。
[0051 ] I至4组牦牛攻毒后，16头牦牛均存活;5组牦牛攻毒后，全部死亡。
[0052]实施例4
[0053]免疫期试验
[0054]用生产的5批次疫苗进行免疫期试验，每批疫苗分5组，每组各接种5只1-3月龄的西藏健康牦牛牛犊，接种方法同实施例3，同时设立5只非免疫牦牛作为空白对照。经免疫30日、60日、90日、120日、180日、240日、300日、360日后，作攻毒保护试验，其结果牦牛大肠埃希氏菌免疫保护一直为100%，巴氏杆菌病180天免疫保护仍有80%的保护率，360日免疫保护达到75 %。
[0055]实施例5
[0056]保存期试验
[0057]将疫苗在2_8°C的保存条件下，保存期可以达到24个月，以I个使用剂量2mL(保存期满24个月)对健康易感牦牛进行免疫，分别在免疫后14、21天分别进行攻毒保护试验，均得到保护。疫苗质量没有发生改变。
【主权项】
1.一种生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法，其特征是将牦牛大肠埃希氏菌种子液按培养基总量的1%?2%接种于以胰酪蛋白胨、琼脂粉和酵母浸出粉为主要原材料的液体自制培养基中，30-45°C发酵或通气培养10?36h，培养过程中根据pH升高情况加入适量质量浓度为30%的灭菌葡萄糖溶液以控制pH值，培养结束后，立即加入浓缩后的巴氏杆菌种子菌液，加入1.5 %明胶和5 %蔗糖，加入冻干保护剂，分装冻干。2.如权利要求1的生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法，其中冻干保护剂为明胶、蔗糖、葡萄糖、白蛋白或聚乙二醇中的一种或多种。3.使用权利要求1所述的方法制备得到的牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗。4.一种免疫牦牛的方法，包括对牦牛施用权利要求2所述的疫苗。5.如权利要求1或2所述的生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法，其中冻干保护剂加入前，需要经过灭菌处理并预热至37°C。6.如权利要求1所述的生产牦牛大肠埃希氏菌病和巴氏杆菌二联灭活疫苗的方法，其中牦牛大肠埃希氏菌种子液是按照如下方法取得:取(TC保存的牦牛大肠埃希氏菌真空冷冻干燥菌株I支，将冻干菌株融化后培养于液体培养基中，取液体培养物各划线2副普通琼脂平板，选择圆形、光滑、边缘整齐、大小适中的菌落各5个，37°C培养20h后，接种到2.5%的蛋白胨牦牛肉汤培养基中，置37°C 140?160r/min摇震培养24h后镜检及纯粹检验后，接种.2.5%的蛋白胨牦牛肉汤大二角瓶的培养基中，置37°(:140?16(^/1^11摇震培养2411。
【文档编号】A61K39/102GK105833261SQ201610219981
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】申登庆, 王文卓, 张林青, 李晓东, 文进才让
【申请人】青海生物药品厂有限公司