一种生物工程脱细胞真皮基质的制备及用图
【专利摘要】本发明公开了一种新型的生物工程脱细胞真皮基质及其制备方法。对猪的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片，真皮基质脱细胞过程中全程使用混合保护液；采用高静压技术预分离真皮组织内的细胞；采用复合核酸酶方法消化残余细胞核；利用去垢剂脱除松散破碎细胞片；使用混合保护液进行漂洗。本发明运用适宜高效的物理手段，辅助少量的酶和去垢剂的方法充分脱去真皮中的细胞成分，在保护液的全程保护下，可以保证在细胞核脱净的基础上，最大限度地降低真皮基质的免疫原性，且同时保留真皮基质的正常三维胶原纤维结构及排列极性，使制得的脱细胞真皮基质具有良好的稳定性与生物相容性。
【专利说明】
一种生物工程脱细胞真皮基质的制备及用途
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程医用材料的制备领域，具体为真皮基质脱细胞的制备方法
【背景技术】
[0002]严重创伤、大面积烧伤和皮肤溃疡等患者存在皮肤缺失的巨大创面或难愈合，而治疗缺损的创面，基本上是以自体皮移植为主，但往往自体皮源紧张，尤其当大面积皮肤缺损时获取自体皮就更为困难。另一方面，取自体皮肤是对患者新的创伤;所以在这些病的治疗过程中，采用皮肤替代物暂时或长期覆盖创面，成为临床的需要。
[0003]天然真皮材料由于与人类皮肤相似，故成为皮肤移植的首选。其中异种皮价格低廉，来源广泛，但存在着异体细胞抗原性，很容易发生强烈的免疫排斥，消除其抗原性才能成为理想的皮肤替代物。因此如何对异种皮肤脱细胞，去除异种皮肤抗原性，同时保其完整的真皮胶原纤维的三维结构，成为目前组织工程真皮研制的热点。
[0004]现有脱细胞真皮制造技术均为化学试剂处理的方法破坏其细胞，并结合戊二醛等交联剂交联降低免疫原性，存在着破坏胶原结构、遗留生物毒性等缺点。近年来也提出了采用物理手段脱除异种皮细胞的方法，期望解决化学试剂处理方法制备真皮材料存在的缺点，然而这些脱细胞方法往往会导致组织内在结构遭到破坏，失去脱细胞组织原有的基本生物功能。
[0005]因此针对现有技术的不足，提供一种既能够降低真皮基质的免疫原性，又保留真皮基质的正常胶原结构的脱细胞真皮基质及其制备方法是当务之急。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种全程使用特殊保护液以及适宜高效的物理复合生物酶获取脱细胞真皮基质的方法。
[0007]本发明的创新处在于:1、对猪的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片；2、真皮基质脱细胞过程中全程使用包含一种或多种真皮结构保护成分的混合保护液;3、采用高静压技术预分离皮肤组织内的细胞;4、采用复合核酸酶方法消化残余细胞核;5、利用去垢剂脱除松散破碎细胞片;6、使用混合保护液进行漂洗。脱细胞步骤设定合适的温度、时间以及去垢剂、消化酶浓度对结膜组织进行处理。
[0008]各种保护性成分的用量为硫酸软骨素的浓度为30_80g/L;透明质酸的浓度为20-50g/L;甘油的浓度为100-500g/L;新霉素5-10mg/L。
[0009]高静压压力条件为400_600MPa，高静压频率为5?10次，每次为2?5分钟。
[0010]DNA酶的浓度为2000-4000U/ml，核酸酶的浓度为2000-4000U/ml ANA酶或核酸酶的脱细胞核时间为3-6小时，处理温度为15-30度。
[0011]去垢剂条件为Pluronic F68的浓度0.1_5%，十二烷基肌氨酸钠的浓度0.1_5%，PEG 400的浓度5-10%。去垢剂处理时间为3-6小时。
[0012]可选择性的同时或分开进行酶和去垢剂的处理。
【附图说明】
[0013]图1为正常猪皮肤切片的HE染色图
[0014]图2为脱细胞猪皮肤切片的DAPI染色图
[0015]图3为皮肤组织脱细胞全程使用保护液的结果
[0016]图4为皮肤组织脱细胞全程未使用保护液的结果
[0017]图5为皮肤组织脱细胞过程中使用去垢剂的结果
[0018]图6为皮肤组织脱细胞过程中未使用去垢剂的结果
[0019]图7为皮肤组织脱细胞过程中使用消化酶的结果
[0020]图8为皮肤组织脱细胞过程中未使用消化酶的结果
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，这些实施例只用于进一步详述说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定，在本发明保护范围之内做出非本质的调整需本发明方授权。
[0022]本发明的实施例1
[0023]取猪背部皮，经清洗、去毛后，留取厚度为0.3-0.5mm，宽度为l-5cm的中厚真皮皮片备用。
[0024]1、全程使用保护液对真皮组织进行保护，保护液配方为:RPM1-1640培养基，添加硫酸软骨素40g/L，透明质酸20g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为380m0sm ；
[0025]2、将真皮皮片密封在盛有保护液的塑料袋中；
[0026]3、于400MPa高静压条件下，处理8次，每次时间为5分钟；
[0027]4、将真皮取出后，置于含2%Pluronic F68+2000U/ml DNA酶的保护液中，温度为30 0C，设定摇床速度为100转/分钟，处理4小时；
[0028]5、去垢剂与酶处理完毕后，取出结膜置于保护液中漂洗3小时。
[0029]本发明的实施例2
[0030]取猪背部皮，经清洗、去毛后，留取厚度为0.3-0.5mm，宽度为l-5cm的中厚真皮皮片备用。
[0031]1、全程使用保护液对眼结膜组织进行保护，保护液配方为:RPM1-1640培养基，添加硫酸软骨素50g/L，甘油200g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为400m0sm ；
[0032]2、将真皮皮片密封在盛有保护液的塑料袋中；
[0033]3、于600MPa高静压条件下，处理5次，每次时间为3分钟；
[0034]4、将真皮取出后，置于含5%十二烷基肌氨酸钠+4000U/ml DNA酶的保护液中，温度为25°C，设定摇床速度为100转/分钟，处理3小时；
[0035]5、去垢剂与酶处理完毕后，取出结膜置于保护液中漂洗6小时。
[0036]本发明的实施例3
[0037]取猪背部皮，经清洗、去毛后，留取厚度为0.3-0.5mm，宽度为l-5cm的中厚真皮皮片备用。
[0038]1、全程使用保护液对眼结膜组织进行保护，保护液配方为:RPM1-1640培养基，添加硫酸软骨素30g/L，透明质酸50g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为450m0sm ；
[0039]2、将真皮皮片密封在盛有保护液的塑料袋中；
[0040]3、于800MPa高静压条件下，处理5次，每次时间为2分钟；
[0041 ] 4、将真皮取出后，置于含2%十二烷基磺酸钠+2000U/ml DNA酶的保护液中，温度为30°C，设定摇床速度为100转/分钟，处理5小时；
[0042]5、去垢剂与酶处理完毕后，取出结膜置于保护液中漂洗8小时。
[0043]以下对比结果均是按照实施例1的脱细胞步骤进行设置。
[0044]图3和图4分别是真皮组织脱细胞全程使用保护液和全程未使用保护液的结果比较。未使用保护液组全程使用灭菌注射用水代替保护液。通过图3和图4，可见使用保护液组脱细胞完全，未使用保护液(灭菌注射用水)组有明显细胞核残余。
[0045]图5和图6分别是使用去垢剂及未使用去垢剂的结果比较。如图5和图6所示，使用去垢剂组脱细胞完全，而未使用去垢剂组有明显的细胞核残余。
[0046]图7和图8分别是使用消化酶及未使用消化酶的结果比较。可见使用消化酶组细胞脱干净，未使用消化酶组有大量细胞核着色。
[0047]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种新型的生物工程脱细胞真皮基质及其制备方法，具体步骤如下: (1)对猪的皮肤进行预处理后得到真皮层皮片； (2)使用包含一种或多种真皮结构保护剂的混合保护液； (3)采用高静压技术预分离真皮组织内的细胞； (4)采用复合核酸酶方法消化残余细胞核； (5)利用去垢剂脱除松散破碎细胞片； (6)在真皮基质混合保护液进行漂洗去除多余的生物酶和细胞残留； (7)获得具有正常胶原纤维的三维结构及排列极性的带有生物特性的脱细胞真皮层皮片。2.如权利要求1所述的制备方法，取猪背部皮，经清洗去毛后，留取厚度为0.3-0.5mm，宽度为l_5cm的中厚真皮皮片备用。3.如权利要求1所述的制备方法，混合保护液如包括RPM1-1640培养基、硫酸软骨素、透明质酸、甘油、新霉素等及其组合，并需调节Ph值与渗透压到适宜值。4.如权利要求1所述的制备方法，高静压技术包括不同的压力、时间和频率参数。5.如权利要求1所述的制备方法，复合核酸酶包括DNA酶、RNA酶、其他核酸酶及其组合。6.如权利要求1所述的制备方法，去垢剂包括聚乙二醇(PEG)、Plur0nic、十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸钠、树胶、海藻酸钠、环糊精、CHAPS中的一种或多种作为组合。7.如权利要求1所述的制备方法，与真皮基质混合保护液中漂洗的时间为3?8小时。8.如权利要求3所述的制备方法，其各成分组成:RPM1-1640培养基含，但不完全包括硫酸软骨素的浓度为30-80g/L;透明质酸的浓度为10-50g/L;甘油100-500g/L;新霉素5-10mg/L，调节ph值为6.8-7.2之间，渗透压为350-450m0sm。9.如权利要求4所述的制备方法，所述的高静压压力条件为400-600MPa，高静压频率为5?10次，每次为2?5分钟；10.如权利要求5所述的制备方法，所述的复合核酸酶使用DN A酶时的浓度为2 O O O -4000U/ml，使用核酸酶时的浓度为2000-4000U/ml，DNA酶或核酸酶的脱细胞核时间为3-6小时，处理温度为15-30 °C。11.如权利要求6所述的制备方法，其中所述去垢剂PluronicF68浓度为0.1_5%，十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1-5% ,PEG 400的浓度为5-10%。去垢剂使用时间为1-8小时。
【文档编号】A61L27/60GK105833353SQ201610297083
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】史真, 史伟云
【申请人】拜欧迪赛尔（北京）生物科技有限公司