脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体、其制备方法及包含其的化妆品组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体、其制备方法及包含其的化妆品组合物，更详细地，涉及脱分化植物原生质体(protoplast)内引入有活性物质的结构体、其制备方法及包含其的化妆品组合物。上述结构体使现有植物细胞所具有的活性成分的稳定性保持原样，而且，引入细胞内的活性物质的稳定性高，包含其的化妆品组合物的基于上述活性物质的功效也得到提高，从而可确保多种功效。
【专利说明】
脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体、其制备方 法及包含其的化妆品组合物
技术领域
[0001]本发明涉及为了提高活性物质的稳定性和功效而将活性物质引入到脱分化植物 原生质体(protoplast)内的结构体、其制备方法及包含其作为有效成分的化妆品组合物。
【背景技术】
[0002]在自然界中存在的植物中分别具有不同的很多活性物质（phyto-c hemical)，其 种类有类萜、类黄酮、黄酮醇、多酚、氨基酸、木酚素、生物碱、维生素、儿茶酚化合物等无数 种类。
[0003] 对此，积极提出了从植物中仅提取特定成分或利用植物细胞的化妆品组合物。
[0004] 作为一例，在国际专利W02013-180526号中提及到火绒草提取物促进皮肤再生，从 而可利用于化妆品，国际专利W02012-102456号中提及到三叉仙菜提取物有效改善皱纹，从 而可用作多种化妆品。
[0005] 并且，在国际专利W02009-139581号中公开了来自紫杉形成层或原形成层且具有 以下特性的细胞株等具有抗氧化及抗炎效果，因而防止衰老并抑制黑色素生成，从而可用 作化妆品组合物，日本公开专利第2012-102136号中公开了为了使皮肤脱色和发光而包含 海茴香(Criste Marine)等好盐性植物的脱分化植物细胞的冷冻干燥物的化妆品组合。
[0006] 另一方面，如视黄醇等有效活性物质具有益于人体内生理学特性的功能，但其稳 定性弱，从而为了提高其稳定性而公开了多种方法。
[0007] 作为一例，在活性物质中适用利用磷脂质或表面活性剂的脂质体、利用神经酰胺 来稳定化的神经酰胺脂质体(c e r a s 〇 m e s)、利用液晶结构来稳定化的液晶脂质体（1 i q u i d crystal liposome)、利用单酸甘油酯的立方相的立方晶(Cubosome)等进行了各种尝试。
[0008] 与此同时，也正在进行将植物细胞适用于化妆品组合物的研究。
[0009] 在国际专利W02012-173458号中公开了内部包含没食子酸(Gallic acid)、氨基酸 等活性物质被稳定化的植物细胞的化妆品组合物，此时，上述植物细胞作为细胞壁，在细胞 壁内引入活性物质的情况下，可提高活性物质的稳定性。
[0010] 植物细胞的细胞壁包含大量纤维素，因此难以使其他物质渗透，从而为了活性物 质的引入而需要去除细胞壁，但在将细胞壁和细胞膜都去除的情况下，引入的活性物质的 稳定性反而会下降。
[0011] 现有技术文献 [0012]专利文献
[0013] (专利文献1)国际专利W02013-180526号
[0014] (专利文献2)国际专利W02012-102456号
[0015] (专利文献3)国际专利W02009-139581号
[0016] (专利文献4)国际专利W02012-173458号
【发明内容】
[0017]对此，本发明人为了将活性物质以高的引入率来稳定地内包在植物细胞内而进行 了多方面的研究，结果确认到在去除植物细胞的细胞壁并使用由细胞膜及细胞器形成的原 生质体的情况下，不仅提高对生物体的渗透性，而且还提高活性物质的引入率，从而可用作 化妆品组合物，并完成了本发明。
[0018] 因此，本发明的目的在于，提供一种以高的引入率来引入活性物质，从而可使上述 活性物质的功效极大化的结构体及其制备方法。
[0019] 并且，本发明的另一目的在于，提供包含上述结构体作为有效成分的化妆品组合 物。
[0020] 解决问题的手段
[0021] 为了实现上述目的，本发明提供一种脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结 构体。
[0022] 并且，本发明提供一种脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体的制备方 法，包括:从植物的叶、茎、根、花、果实及种子中获取植物细胞的步骤;利用植物生长素对上 述已获取的植物细胞进行脱分化来获取脱分化植物细胞的步骤;大量培养上述已获取的脱 分化植物细胞的步骤;利用酶反应来去除上述已大量培养的脱分化植物细胞的细胞壁，并 获取原生质体的步骤;通过加压渗透工序来将活性物质引入上述已获取的脱分化植物原生 质体内的步骤；以及进行后处理的步骤。
[0023] 并且，本发明提供一种包含脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体作为 有效成分的化妆品组合物。
[0024]发明效果
[0025] 本发明的结构体使现有植物细胞所具有的活性成分的稳定性保持原样，而且引入 细胞内的活性物质的稳定性高，从而基于上述活性物质的功效进一步得到提高，优选用作 化妆品的有效成分。
【附图说明】
[0026] 图1为表示本发明的脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体的制备步骤 的流程图。
[0027]图2(a)表示作为标准样品的环己二醇双乙基己酸酯，图2的（b)表示实施例1的原 生质体内引入有环己二醇双乙基己酸酯的结构体的气相色谱。
[0028] 图3的(a)表示作为标准样品的双维胺基甲基戊烷，图3的（b)表示实施例2的原生 质体内引入有双维胺基甲基戊烷的结构体的气相色谱。
[0029] 图4的（a)表示作为标准样品的β-拉帕醌，图4的（b)表示实施例3的原生质体内引 入有拉帕醌的结构体的气相色谱。
[0030] 图5的(a)表示作为标准样品的生长因子复合肽，图5的（b)表示实施例4的原生质 体内引入有生长因子复合肽的结构体的气相色谱。
[0031] 图6为表示各浓度的实施例1的结构体、环己二醇双乙基己酸酯及α-红没药醇对黑 色素的生成抑制效果的曲线图。
[0032] 图7为表示实施例2的结构体、双维胺基甲基戊烷、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成 功能的曲线图。
[0033] 图8为表示实施例3的结构体、β-拉帕醌、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成功能的曲 线图。
[0034] 图9为表示实施例4的结构体、生长因子复合肽、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成功 能的曲线图。
[0035] 图10为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及进行处置后的表 皮再生情况的图像。
[0036] 图11为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及进行处置后的黏 多糖的增加程度的图像。
[0037] 图12为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及进行处置后的I 型胶原蛋白的增加程度的图像。
【具体实施方式】
[0038]以下，对本发明进行详细的说明。
[0039] 本发明公开脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体。
[0040] 原生质体作为细胞中细胞壁被去除且存在细胞膜的原生质体，可将可用作化妆品 组分的多种活性物质引入上述细胞膜的内部。上述细胞壁包含大量的纤维素，因此难以使 其他物质渗透，因此为了活性物质的引入而需要去除细胞壁，但在将细胞壁和细胞膜都去 除的情况下，引入的活性物质的稳定性反而会下降，因而存在细胞膜的原生质体为优选。
[0041] 活性物质可为亲水性物质或疏水性物质，而在本发明中不进行特别限制。作为代 表性的活性物质，可为选自由机酸、维生素、熊果苷、腺苷、烟酰胺、多酚、类黄酮、视黄醇、环 己二醇双乙基己酸酯、双维胺基甲基戊烷、拉帕醌、生长因子、生长因子复合肽及它们的 组合组成的组中的一种。
[0042] 这种活性物质自身可用作化妆品组合物的有效成分，但其稳定性低而无法充分发 挥其活性，但由于被引入原生质体内而其活性稳定性得到提高，且借助上述原生质体而生 物体适应性大大提尚。
[0043] 图1为表示本发明的脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体的制备步骤 的流程图，以下，参照图1按各步骤进行详细说明。
[0044] 步骤(a):植物细胞获取步骤
[0045] 在步骤(a)中，从植物的叶、茎、根、花、果实及种子中获取植物细胞。
[0046] 在本发明中，对植物细胞的获取不进行特别限制，而可以适用公知的方法。作为一 例，在本发明的实施例中，在灭菌后，浸渍于添加表面活性剂的氯酸钠水溶液中后，进行清 洗来获取植物细胞。
[0047] 在本发明中，对可使用的植物不特别限制，而可使用所有植物。作为代表性的植 物，可为选自由意大利腊菊(Helichrysum italicum)、没药树(Commiphora wightii)、梨果 仙人掌（Opuntia Ficus indica)、苟药（Paeonia lactiflora)、沙漠蔷薇（Adenium obesum)、埃及蓝睡莲（Nymphaea coerulea)、斑叶桉（Eucalyptus punctata)、银杏树 (Ginkgo biloba)、百合花（Lilium candidum)、撤榄树（Olea europaea)、纸莎草（Cyperus papyrus)、莲花（Nelumbo nucifera)、红木（Sequoia sempervirens)、法国蔷薇（Rosa gallica officinalis)、咖啡树（Coffea arabica)、鸡蛋花（Plumeria obtusa)、栀子 (Gardenia jasminoides)、叶子花（Bougainvillea spectabilis)、茉莉花（Jasminum sambac)、百叶蔷薇（Rosa centifolia)、薄荷(Menthapiperita)、大马士革蔷薇（Rosa damascena)、鸾尾（Iris pallida)、葡萄树(Vitis vinifera)、白蔷薇（Rosa alba)、依兰 (Cananga odorata)、甜杏仁（Prunus amygdalus dulcis)、苹果树（Malus domestica)、杏 树（Prunus armeniaca)、人参（Panax ginseng)、黑莓（Rubus fruticosus)、花菱草 (Eschscholtzia californica)、积雪草(Centella asiatica)、酉爱樱桃（Prunus cerasus)、 夏威夷木權花（Hibiscus rosa sinensis)、欧洲刺柏（Juniperus communis)、棉花 (Gossypium arboreum)、海率（Phoenix dactylifera)、生姜（Zingiber officinale)、木權 花（Hibiscus syriacus)、野荸养（Pueraria tuberosa)、石植树（Punica granatum)、木棉 藻（Bombax costatum)、番红花（Crocus sativus)、撒尔维亚（Salvia officinalis)、睡莲 (Nymphaea alba)及它们的组合组成的组中的一种。优选使用意大利腊菊(Helichrysum italicum)、没药树（Commiphora wightii)、梨果仙人掌（Opuntia Ficus indica)等。
[0048] 步骤(b):脱分化步骤
[0049] 在步骤(b)中，利用植物生长素对上述已获取的植物细胞进行脱分化来获取脱分 化植物细胞。
[0050] 使用于脱分化(dedifferentiat ion)的植物生长素(auxin)作为植物的生长调节 物质之一，在低浓度下促进细胞生长，而在高浓度下抑制细胞生长。对此，作为植物生长素， 可为选自由α_萘乙酸（a_Naphtalene acetic acid)、2,4_二氯苯氧乙酸、吲噪-3-乙酸 (Indole-3-acetic acid)及它们的组合组成的组中的一种，可通过在包含浓度为1~5mg/L 的上述生长素的培养基中培养植物细胞，来诱导上述植物细胞的脱分化。
[0051]在本发明中，对上述培养基不进行特别限制，可使用在培养植物细胞中所使用的 所有培养基。
[0052] 步骤(c):脱分化植物细胞的培养步骤
[0053]在步骤(c)中，对在上述步骤(b)中获取的脱分化植物细胞进行培养。
[0054]在多种培养基内大量培养脱分化植物细胞，此时，作为培养基，可使用MS培养基、 B5培养基、WHITE培养基、N6培养基、SH培养基、Anderson培养基等公知的培养基，优选使用 MS培养基。
[0055]并且，在本发明中，对培养条件及期间不进行特别限制，可在公知的条件下进行。 [0056] 步骤(d):通过酶反应来去除细胞壁的步骤
[0057]在步骤(d)中，利用酶反应来去除大量培养的脱分化植物细胞的细胞壁，并获仅剩 下细胞膜和细胞器器官的原生质体。
[0058] 上述酶可为选自由纤维素酶(EC 3.2.1.4)、果胶酶(EC 3.2.1.15)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、几丁质酶(EC 3.2.1.14)、半纤维素酶及它们的组合组成的组中的一种。
[0059] 可使用0.01~10重量％的多种浓度的上述酶，优选使用0.1~5重量％的纤维素 酶、0.01~2.5重量％的果胶酶、0.1~5重量％的半纤维素酶，更优选地，使用1重量％的纤 维素酶、2重量％的半纤维素酶及0.5重量％的果胶酶的多成分酶混合物。
[0060] 在4°C~40°C的温度范围（更优选10°C~25°C)以10~50rpm的速度进行上述酶反 应15小时~24小时，可通过这种酶反应来获取仅去除脱分化植物细胞的细胞壁而稳定地保 存细胞膜的原生质体。
[0061] 步骤(e):通过加压渗透工序来引入活性物质的步骤
[0062] 在步骤(e)中，通过加压渗透工序来将活性物质引入已获取的上述脱分化植物原 生质体内。
[0063]具体地，将脱分化植物原生质体溶解于低级醇(C1~C4醇），若将其与活性物质及 水混合后添加氯化钠，则上述活性物质借助渗透化引入原生质体内部。
[0064] 这种工序为加压渗透工序，具体地，在0.01~lOMPa下进行，优选在0.05~IMPa下 进行，更优选在〇. 05~0.5MPa进行，此时，通过添加氯化钠使其浓度成为1 %以上，优选使其 浓度成为1~50%。若上述压力和浓度小于上述范围，则无法使活性物质的引入有效地进 行，相反地，若上述压力及浓度大于上述范围，则存在原生质体被破坏的隐患，因此，在上述 范围内适当地使用。
[0065] 可通过进行上述引入步骤来达到使活性物质的功效充分发挥的浓度，其可随着活 性物质而发生变化，但具有0.001~20 %的引入率（以重量％为基准）。作为一例，在作为实 施例1的活性物质的环己二醇双乙基己酸酯的情况下，当浓度为0.001~15重量％、优选 0.01~10重量％、更优选0.1~10重量％时具有优秀的活性。
[0066] 并且，在作为实施例2的活性物质的双维胺基甲基戊烷的情况下，当浓度为0.005 ~5.0重量％、优选0.01~2重量％时具有优秀的活性，在作为实施例3的活性物质的β-拉帕 醌的情况下，当浓度为〇.005~10.0重量％、优选0.01~5.0的重量％时，具有优秀的活性， 而且，在作为实施例4的活性物质的生长因子复合肽的情况下，浓度可为10~5000ppm，优选 50 ~5000ppm，更优选 100 ~500ppm。
[0067] 进一步地，为了提高引入率，还可以进行脱水反应。
[0068] 步骤(f):后处理步骤
[0069]在步骤(f)中，通过后处理来获取将活性物质引入原生质体内的结构体。
[0070]在这种后处理步骤中，利用常规的后处理工序，并通过离心分离及清洗来去除未 反应物质(未引入的活性物质)及盐。
[0071] 经过上述步骤来获取的原生质体内引入有活性物质的结构体使现有植物细胞所 具有的活性成分的稳定性保持原样，而且，引入细胞内的活性物质的稳定性高，从而基于上 述活性物质的功效也得到提高，优选可用作化妆品的有效成分。
[0072] 相对于化妆品组合物的总重量，包含0.001至99.0重量％的上述结构体，优选包含 0.01至10.0重量％的上述结构体，更优选包含0.1至3重量％的上述结构体。
[0073] 并且，可将化妆品组合物制备成公知的任何剂型，可制备成化妆水、营养乳液、营 养霜、按摩霜、精华素、面膜、膏、胶、面霜、乳液、粉、肥皂、油、粉底、蜡或喷雾形态的剂型。
[0074] 并且，在各剂型的化妆品组合物中，可根据其他化妆品的剂型、使用目的等，任意 选择除上述细胞以外的其他成分进行配合。并且，各剂型的组合物可含有在其剂型的制剂 化中所需要且适合的各种基剂和添加物，在不使其效果下降的范围内，包含非离子表面活 性剂、硅聚合物、体质颜料、香料、防腐剂、杀菌剂、氧化稳定剂、有机溶剂、离子性或非离子 性增稠剂、柔软剂、抗氧化剂、自由基团破坏剂、乳浊剂、稳定剂、润滑剂、硅、羟基酸、消泡 剂、保湿剂、维生素、昆虫忌避剂、香料、保鲜剂、表面活性剂、消炎剂、Ρ物质拮抗剂、填充剂、 聚合物、推进剂、碱化剂或酸化剂、或着色剂等公知的化合物来制备
[0075] 在本发明的剂型为膏、面霜或胶的情况下，作为载体成分，可利用动物性油、植物 性油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、二氧化硅、滑石或 氧化锌等。
[0076] 在本发明的剂型为粉或喷雾的情况下，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化 硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，尤其，在本发明的剂型为喷雾的情况下，还可包含如氯氟 烃、丙烷/ 丁烷或二甲醚的推进剂。
[0077] 在本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分，利用溶剂、溶解剂或乳 化剂，例如，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3_丁基乙 二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或失水山梨糖醇脂肪酸酯。
[0078] 在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可利用水、乙醇或丙二醇等液 状稀释剂，乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯失水山梨醇酯等悬浮剂，微晶纤 维素、氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。
[0079] 在本发明的剂型为含有表面活性剂的洁面霜的情况下，作为载体成分，可利用脂 肪族醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鑰衍生物、牛磺 酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪 酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛酯衍生物或乙氧基甘油脂肪酸酯等。
[0080] 以下，为了有助于理解本发明而公开优选实施例。但是，下述的实施例仅为了更加 容易地理解本发明而提供，本发明的内容并不限制于实施例。
[0081 ]制备例1:脱分化植物原生质体细胞制备 [0082] (1)脱分化植物细胞的获取
[0083]从意大利腊菊，没药树，梨果仙人掌的茎、叶等切割组织切片。在本操作步骤中，所 有操作都在无菌条件下且在无菌工作台上进行。
[0084] 为了对植物材料进行灭菌，将组织浸渍于70%的乙醇(Ethanol，Sigma，USA)60秒 钟，并浸渍于30 %的过氧化氢(Hydrogen peroxide，LG Chemical，Korea) 15分钟，来去除溶 剂，之后，利用无菌H2O清洗上述组织3~5次，浸渍于添加有几滴Tween20的氯酸钠(Sodium 1^(11'〇(3111〇1'；!^，3181]1&，1]3厶)15分钟，利用无菌!12〇清洗3~5次。
[0085]为了培养组织，将上述组织切片放入无菌培养皿（125mm)中并进行切割（2~3mm)， 小心去除已漂白的部分，将以这种方式获取的样品切成丝，塗抹在固体培养基(下列表1)并 埋入一半。
[0086]表 1
[0088] (2)脱分化植物细胞的再植(Replanting)
[0089]利用压舌板（Spatula)来采集2~3个细胞群集（1~2cm)后，涂抹于新的培养基并 进行分散。在此所有过程在无菌条件下且在无菌工作台上进行。
[0090] (3)在液状培养基中脱分化植物细胞的增殖
[0091] 在将上述脱分化植物细胞迀移至下述表2中的液状培养基之后，在25°C的温度、暗 的条件下，在50~150rpm的旋转搅拌机进行培养，此时，它们的每继代培养周期固定为10 天。
[0092]表 2
[0094] (4)获取去除脱分化植物细胞的细胞壁后的原生质体
[0095] 在已获取的上述脱分化植物细胞增殖的液状培养基中添加多成分酶混合物(纤维 素酶1 %，半纤维素酶2%及果胶酶0.5 % )，在25°C的温度范围以50rpm的速度进行反应20小 时，来去除细胞壁，
[0096] 接着，在200xg下对在培养液中的原生质体进行离心分离15分钟来获取后，再在 5000xg下进行离心分离15分钟来进一步进行纯化。
[0097]实施例1:脱分化植物原生质体内引入有环己二醇双乙基己酸酯的结构体的制备 [0098]在乙醇中对环己二醇双乙基己酸酯（Cyclohexandiol Bis-Ethylhexanoate，RNS， Korea)进行搅拌30分钟来制备浓度为10重量％的溶液。
[0099] 在已获取的20重量％的环己二醇双-乙基己酸酯溶液中添加20重量％的在制备例 1中所制备的原生质体和60重量％的蒸馏水，利用叶片式搅拌机(PL-S10，Poonglim，Korea) 并以500rpm、25 °C条件进行搅拌1小时。
[0100]接着，向活性物质溶液、原生质体及蒸馏水的混合物中添加氯化钠(NaCl，Sigma， USA)2重量％，利用高压反应器(Miniclave，Buchi AG，Switzerland)在0.5MPa、25°C的条件 下诱导反渗透、脱水以及环己二醇双乙基己酸酯的引入反应。
[0101 ] 之后，利用离心分离机（Supra 22K，Hanil，Korea)在5000xg下进行离心分离20分 钟，来获取原生质体内引入有环己二醇双乙基己酸酯的结构体。
[0102] 为了保存以上述方法获取的结构体，在20重量％的结构体中加入80重量％的甘油 来获取细胞组合物。
[0103] 实施例2:脱分化植物的原生质体内引入有双维胺基甲基戊烷的结构体的制备
[0104] 以与上述实施例1相同的方法进行，以双维胺基甲基戊烧（Bis-retinamido methylpentane，DermaLab，Korea)代替环己二醇双乙基己酸酯作为活性物质来使用，从而 获取原生质体内引入有双维胺基甲基戊烷的结构体(结构体/甘油，20/80重量％ )。
[0105] 实施例3:脱分化植物原生质体内引入有β-拉帕醌的结构体的制备
[0106] 以与上述实施例1相同的方法进行，以β-拉帕醌(0-1^口3(：11〇116,5丨811^，1]54)代替环 己二醇双乙基己酸酯作为活性物质来使用，从而获取原生质体内引入有β-拉帕醌（β-Lapachone，Sigma，USA)的结构体(结构体/甘油，20/80重量％ )。
[0107] 实施例4:脱分化植物原生质体内引入有生长因子复合肽(growth factor mimic peptides)的结构体的制备
[0108]以与上述实施例1相同的方法进行，以生长因子复合肽代替环己二醇双乙基己酸 酯作为活性物质来使用，从而获取原生质体内引入有生长因子复合肽的结构体(结构体/甘 油，20/80重量％)。
[0109] 作为生长因子复合肽的组成，将寡肽-34(01丨8<^6口1:丨(16-34,〇3代8611，1(〇代3)、寡 肽-24(Oligopeptide-24，Caregen，Korea)、十肽-4(Decapeptide_ 4,Caregen，Korea)、乙酰 十肽-3(厶。6七5^1〇6。&卩6卩1^(16-3，〇&代8611，1(〇代&)及1'11-多肽-4(1'11-?〇17卩6卩1:1(16-4，13;[0-FD&C，Korea)分别以4000ppm(共20000ppm)加入三次蒸馏水中，并进行搅拌30分钟来使用。
[0110] 实验例1:引入有活性物质的结构体的成分分析
[0111] 在本试验中，通过气相色谱GC(gas chromatography)来确认，在上述实施例1至4 中所制备的结构体中，活性物质是否稳定地引入到原生质体内，此时为了进行比较，使用各 活性物质的标准样品。
[0112] 图2(a)表示作为标准样品的环己二醇双乙基己酸酯，图2(b)表示实施例1的原生 质体内引入有环己二醇双乙基己酸酯的结构体的气相色谱，由此可以知道，细胞内引入了 作为活性物质的环己二醇双乙基己酸酯。
[0113] 确认到在实施例2及实施例3中也出现了相同的结果。
[0114] 图3(a)表示作为标准样品的双维胺基甲基戊烷，图3(b)表示实施例2的原生质体 内引入有双维胺基甲基戊烷的结构体的气相色谱，由此可以知道，细胞内引入了作为活性 物质的双维胺基甲基戊烷。
[0115] 并且，图4(a)表示作为标准样品的β-拉帕醌，图4(b)表示实施例3的原生质体内引 入有拉帕醌的结构体的气相色谱，由此可以知道，细胞内引入了作为活性物质的拉帕 醌。
[0116] 通过MALDI-T0F质量分析仪（Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight Mass Spectrometry)来实现将实施例4的引入有生长因子复合肽的细胞。
[0117] 图5(a)表示作为标准样品的生长因子复合肽，图5(b)表示原生质体内引入有实施 例4的生长因子复合肽的结构体的MALDI-T0F质量分析曲线图，由此可以知道，细胞内引入 了作为活性物质的生长因子复合肽。
[0118] 功效分析
[0119] 为了确认内包有上述实施例1至实施例4中所获取的活性物质的细胞作为化妆品 的效果及功效，进行如下所述的实验。
[0120]实验例2:实施例1的结构体的美白效果分析
[0121]环己二醇双乙基己酸酯具有美白效果，为了与在实施例1中所制备的结构体进行 美白效果比较，利用黑色素生成细胞来进行实验。
[0122]在本实验中，确立利用黑色素生成细胞(melanoma)细胞株和黑色素刺激激素的离 体分析（in vitro assay)系统，对基于环己二醇双乙基己酸酯的黑色素生成抑制效果、酪 氨酸酶活性抑制效果，从而确认到皮肤美白效果。
[0123] (1)细胞株及细胞培养
[0124] 在37°(：、5%的0)2条件下，使用添加有10%的胎牛血清$83,6讣(3〇(：〇)、10(^8/1^ 的链霉素、l〇〇U/mL的青霉素的达尔伯克改良伊格尔（DMElDulbeccc/s modified Eagle medium)培养基来对作为侵蚀性黑色素生成细胞株的B16细胞株(ATCC CRL-6323)进行培养 (Incubator;Thermo-scientific，USA)〇
[0125] 在100cm2的烧瓶(Corning，USA)使B16细胞充分增殖后，以培养3天的间隔利用磷 酸盐缓冲液(PBS)对培养细胞表面进行清洗后，放入0.25 %的胰蛋白酶-EDTA溶液，在培养 基中处理3分钟之后，扔掉胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C下保管5分钟来脱附细胞。将包含 10 % FBS的1 OmL DMEM移至新的培养容器，在37 °C、5 %的⑶2条件下以1: 5的分流比（sp 1 i t ratio)对已脱附的细胞进行继代培养。
[0126] (2)黑色素生成抑制效果测定
[0127] 利用DMEM在96孔板中每孔接种1 X 105个，制备各浓度的在实施例1中所制备的结 构体和已知有美白效果的环己二醇双乙基己酸酯、α-红没药醇，来处理2ml的样品液。之后， 处理lppm的α-黑色素细胞刺激素（α-Melanocyte stimulating hormone，a-MSH)并培养72 小时。然后，利用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗培养基后，每孔添加 1 〇〇yL的黑色素提取溶液（iN的Na0H+50 %的二甲基亚砜(DMS0))，在80 °C下溶解细胞后，利 用酶标仪(ELISA reader)在492nm下测定黑色素吸光度。
[0128] [数学公式1]
[0129] 黑色素生成抑制率（％ ) = [ (Mm-Ms)/(Mm-Mc) ] X 100
[0130] Me:控制组的黑色素量
[0131] Mm:a-MSH处理组的黑色素量
[0132] MS:处理样品和a-MSH的组的黑色素量
[0133] (3)结果分析
[0134] 图6为表示各浓度的实施例1的结构体、环己二醇双乙基己酸酯及α-红没药醇对黑 色素的生成抑制效果的曲线图。
[0135] 参照图6可知，在本发明实施例1中所制备的、原生质体内引入有环己二醇双乙基 己酸酯的结构体情况下，其黑色素抑制效果比环己二醇双乙基己酸酯和α-红没药醇优秀， 其浓度越高，黑色素生成抑制效果也大大增加。
[0136] 实验例3:实施例2的结构体的胶原蛋白生物合成效果分析
[0137] 双维胺基甲基戊烷具有皮肤再生效果，与在实施例2中所制备的结构体进行胶原 蛋白生物合成效果的比较，此时，作为比较例，还使用了视黄醇及腺苷。
[0138] (1)细胞株及细胞培养
[0139] 在96微孔板（961611111；[(31'(^13七6)的每孔(￥611)接种1\104人皮肤纤维芽细胞 (Human dermal fibroblast，Gibco，USA)，在补充有 100U/mL的青霉素、100yg/mL的链霉素 的10%的DMEM(Dulbeccc/s Modified Eagle's Medium)培养基中进行培养。维持上述培养 基直到80 %的附着的细胞汇合(conf luence)为止，在80 %的附着的细胞汇合时，进行继代 培养。每两天更换培养基直到汇合为止。在上述继代培养中，利用磷酸盐缓冲液清洗已去除 培养液的烧瓶，利用0. 25 %的胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco BRL，Grand I s 1 and，NY，USA)来使 细胞掉落后，对细胞悬浮液进行离心分离后，测定细胞数，再在培养液中以3倍的细胞进行 继代培养。
[0140] (2)胶原蛋白生物合成效果
[0141] 在具有含有10%的FBS的DMEM培养基的48微孔板中，以lxl05cells/well的浓度接 种人体正常纤维芽细胞(human normal fibroblast)，在5%的浓度(C〇2)的⑶2培养基中以 37 °C培养24小时。
[0142] 培养后，将培养基更换为将实施例2的结构体、双维胺基甲基戊烷、视黄醇及腺苷 调整为各浓度的、不存在血清的DMEM培养基后，再培养48小时。培养的最后24小时之前添加 50yg/mL的维生素C来促进胶原蛋白的合成。培养后，清洗各孔，更换为不含有血清的DMEM培 养基后，再培养24小时。
[0143] 培养后，收集各孔的上层液，利用试剂盒(Kit，Takara Shuzo Co.，Ltd，Japan)将 重新合成的胶原蛋白量作为I型前胶原肽(PICP，Type_I C-peptide)量进行测定，并以ng/2 X104细胞来换算PICP量，以测定胶原蛋白的合成效果。
[0144] (3)结果分析
[0145] 图7为表示实施例2的结构体、双维胺基甲基戊烷、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成 功能的曲线图，可见，引入有本发明实施例2的活性物质的细胞的胶原蛋白合成功能非常优 秀，而且，浓度越高，上述合成功能越提高。
[0146] 实验例4:实施例3的结构体的胶原蛋白生物合成效果分析
[0147] 以与上述实验例3相同的方法进行，培养后，将培养基更换为实施例3中所制备的 结构体、β-拉帕醌、视黄醇及腺苷被调整为各浓度且不存在血清的DMEM培养基后进行培养， 来分析胶原蛋白合成效果。
[0148] 图8为表示实施例3的结构体、β-拉帕醌、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成功能的曲 线图，可见，引入有本发明实施例3的活性物质的细胞的胶原蛋白合成功能非常优秀，而且， 浓度越高，上述合成功能越提高。
[0149] 实验例5:实施例4的结构体的效果分析
[0150] (1)体外（in-vitro)实验
[0151] 以与上述实验例4相同的方法进行，培养后，将培养基更换为实施例4中所制备的 结构体、生长因子复合肽、视黄醇及腺苷被调整为各浓度且不存在血清的DMEM培养基后进 行培养，来分析胶原蛋白合成效果。
[0152] 图9为表示实施例4的结构体、生长因子复合肽、视黄醇及腺苷的胶原蛋白合成功 能的曲线图，可见，引入有本发明实施例3的活性物质的细胞的胶原蛋白合成功能非常优 秀，而且，浓度越高，上述合成功能越提高。
[0153] (2)离体(ex-vivo)实验
[0154] 为了确认在实施例4中所制备的结构在人皮肤组织上的表皮再生效果和黏多糖的 增加效果及胶原蛋白增加效果，进行以下实验，其结果为如下。
[0155] 1.从40岁左右的女性的皮肤中取出15个组织。准备以活的状态培养的皮肤组织。
[0156] 2.如下所述，以3套(set)为1组的条件对其皮肤组织进行实验。
[0157] 表3
[0158]
[0159] 3.在D0中，将O.lg的样品涂敷于皮肤组织（在D2、D5、D6及D8中也以相同的方式进 行样品处理），样品的浓度为0.2%。
[0160] 4.在D0中，对3个对照批(control batch)皮肤组织进行采样，在D6和D9中，分别对 3个皮肤组织进行采样。
[0161] 5.固定于石錯。以5μηι的厚度进行切片。
[0162] 6.确认表皮的再生程度：利用马松三色染色法(Masson s trichrome-Goldner variant，Masson_Goldner trichrome staining kit，MERCK，USA)对石錯固定组织进行染 色后，利用Cel 1D奥林巴斯软件Olympus，Japan)来进行影像分析。
[0163] 7.黏多糖增加确认:利用阿辛蓝-PAS染色法(Alcian blue P.A.S.，Alcian Blue/ 卩八5 1(行，？〇178(^61?^，111(3.，1^4)对石蜡固定组织进行染色后，利用1^扣4〇1丨11来确认黏 多糖的增加量，并利用柯达体内图像分析仪(Kodak in vivo image analyzer，Eastern Kodak，Rochester，USA)来分析黏多糖的增加量。
[0164] 8.胶原蛋白的增加确认:在常温下，利用具有FITC标记的兔抗人I型胶原多克隆抗 体（Poab Rabbit anti Collagen I affinity purified Cat#PS047，Monosan， Netherlands)对已冷冻的石錯固定组织进行染色1小时，利用碘化丙啶(Propidium Iodid， Sigma-Aldrich，USA)对核进行染色后，利用LEICA Q Win来确认胶原蛋白的增加，并利用柯 达体内图像分析仪来分析胶原蛋白的增加。
[0165] 图10为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及进行处置后的表 皮再生情况的图像，可见再生效果非常优秀。
[0166] 在黏多糖的增加效果及胶原蛋白增加效果实验中也显示相同的这种结果。
[0167] 图11为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及进行处置后的黏 多糖的增加程度的图像，图12为表示利用实施例4的结构体对人的皮肤组织进行处置前及 进行处置后的I型胶原蛋白的增加程度的图像，由此可知，在根据本发明将生长因子复合肽 引入原生质体内的情况下，上述效果优秀。
[0168] 以下，为了有助于理解本发明而公开优选剂型例。但是，下述的剂型例仅为了更加 容易地理解本发明而提供，本发明的内容并不限制于剂型例。
[0169] 剂型例1:营养霜的制备
[0170] 利用公知方法来制备营养霜，以使上述营养霜具有如下列表4所示的组成。
[0171] 表4
[0173] 剂型例2:柔软化妆水(润肤液)的制备
[0174] 利用公知方法来制备柔软化妆水，以使上述柔软化妆水具有如下列表5所示的组 成。
[0175] 表5
[0177] 剂型例3:营养化妆水
[0178]利用公知方法来制备营养化妆水，以使上述营养化妆水具有如下列表6所示的组 成。
[0179]表6
[0181] 剂型例4:按摩霜
[0182] 利用公知方法来制备按摩霜，以使上述按摩霜具有如下列表7所示的组成。
[0183] 表7
[0185] 剂型例4:精华素
[0186] 利用公知方法来制备精华素，以使上述精华素具有如下列表8所示的组成。
[0187] 表8
[0189] 剂型例5:面膜
[0190] 利用公知方法来制备面膜，以使上述面膜具有如下列表9所示的组成。
[0191] 表9
【主权项】
1. 一种脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体。2. 根据权利要求1所述的结构体，其特征在于，上述植物为选自由意大利腊菊 (Helichrysum italicum)、没药树（Commiphora wightii)、梨果仙人掌（Opuntia Ficus indica)、苟药(Paeonia lactif lora)、沙漠蔷薇(Adenium obesum)、埃及蓝睡莲(Nymphaea coerulea)、斑叶桉（Eucalyptus punctata)、银杏树（Ginkgo biloba)、百合花（Lilium candidum)、撤榄树（Olea europaea)、纸莎草（Cyperus papyrus)、莲花（Nelumbo nucifera)、红木（Sequoia sempervirens)、法国蔷薇(Rosa gallica officinalis)、咖啡 树(Coffea arabica)、鸡蛋花(Plumeria obtusa)、栀子(Gardenia jasminoides)、叶子花 (Bougainvillea spec tab i 1 i s )、茉莉花（Jasminum sambac )、百叶蔷薇（Rosa centifolia)、薄荷（Mentha piperita)、大马士革蔷薇（Rosa damascena)、鸾尾（Iris pallida)、葡萄树(Vitis vinifera)、白蔷薇(Rosa alba)、依兰（Cananga odorata)、甜杏 仁（Prunus amygdalus dulcis)、苹果树(Malus domestica)、杏树（Prunus armeniaca)、人 参（Panax ginseng)、黑莓（Rubus fruticosus)、花菱草(Eschscholtzia californica)、积 雪草(Centella asiatica)、酸樱桃(Prunus cerasus)、夏威夷木權花(Hibiscus rosa sinensis)、欧洲刺柏（Juniperus communis)、棉花（Gossypium arboreum)、海率（Phoenix dactylifera)、生姜（Zingiber officinale)、木權花（Hibiscus syriacus)、野荸养 (Pueraria tuberosa)、石植树（Punica granatum)、木棉藻（Bombax costatum)、番红花 (Crocus sativus)、撒尔维亚（Salvia officinalis)、睡莲(Nymphaea alba)及它们的组合 组成的组中的一种。3. 根据权利要求1所述的结构体，其特征在于，上述活性物质为选自由亲水性物质和疏 水性物质组成的组中的一种。4. 根据权利要求1所述的结构体，其特征在于，上述活性物质为选自由有机酸、维生素、 熊果苷、腺苷、烟酰胺、多酚、类黄酮、视黄醇、环己二醇双乙基己酸酯、双维胺基甲基戊烷、 β-拉帕醌、生长因子、生长因子复合肽及它们的组合组成的组中的一种。5. 根据权利要求1所述的结构体，其特征在于，上述活性物质的引入率为0.001~20重 量％。6. -种脱分化植物原生质体内引入有活性物质的结构体的制备方法，其特征在于，包 括： 从植物的叶、茎、根、花、果实及种子中获取植物细胞的步骤； 利用植物生长素对上述已获取的植物细胞进行脱分化来获取脱分化植物细胞的步骤； 大量培养上述已获取的脱分化植物细胞的步骤； 利用酶反应来去除上述已大量培养的脱分化植物细胞的细胞壁，从而获取原生质体的 步骤； 通过加压渗透工序来将活性物质引入上述已获取的脱分化植物原生质体内的步骤以 及 进行后处理的步骤。7. 根据权利要求6所述的结构体的制备方法，其特征在于，上述植物生长素为选自由α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-乙酸及它们的组合组成的组中的一种，上述植物生长 素的使用浓度为1~5mg/L。8. 根据权利要求6所述的结构体的制备方法，其特征在于，在上述酶反应中，与选自由 纤维素酶(EC 3.2.1.4)、果胶酶(EC 3.2.1.15)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、几丁质酶(EC 3.2.1.14)、半纤维素酶及它们的组合组成的组中的一种的酶进行混合，在4°C~40°C的温 度下反应15小时~24小时。9. 根据权利要求6所述的结构体的制备方法，其特征在于，在上述加压渗透工序中，在 0.01~lOMPa的压力下添加氯化钠来使浓度成为1~50%。10. 根据权利要求6所述的结构体的制备方法，其特征在于，在引入上述活性物质后，在 进行后处理步骤之前，还进行脱水反应。11. 根据权利要求6所述的结构体的制备方法，其特征在于，在上述后处理步骤中，进行 离心分离及清洗。12. -种化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的脱分化植物原生质体内引 入有活性物质的结构体作为有效成分。13. 根据权利要求12所述的化妆品组合物，上述化妆品组合物的剂型为化妆水、营养乳 液、营养霜、按摩霜、精华素、面膜、膏、胶、面霜、乳液、粉、肥皂、油、粉底、蜡或喷雾。
【文档编号】A61K8/97GK105848635SQ201480071246
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月23日
【发明人】沈圣辅, 朴素玄, 洪宇辰, 崔殷豪
【申请人】豪威株式会社