用于预防或治疗铁缺乏的包含铁氧化物纳米颗粒的药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于预防或治疗铁缺乏和与此伴随的缺铁性贫血的药物组合物以及该药物组合物的制备方法，所述药物组合物包含铁氧化物纳米颗粒。
【专利说明】
用于预防或治疗铁缺乏的包含铁氧化物纳米颗粒的药物组 合物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于预防或治疗铁缺乏和由此伴随的贫血的药物组合物以及该 药物组合物的制备方法，所述组合物包含铁氧化物纳米颗粒。
【背景技术】
[0002] 铁是对几乎所有活的有机体来说都需要的必需微量元素，并且铁缺乏和过量起到 抑制或降低动物中的细胞功能的作用。通常，体内的含铁物质主要分成具有新陈代谢功能 和酶功能的功能性铁以及用于运输和储存的储存铁。铁缺乏是贫血的主要原因，并且全球 人口的大约15%具有缺铁性贫血(IDA)。
[0003]缺铁性贫血被认为是在全世界的人类中发生的最普遍的病理状态中的一种。缺铁 性贫血通常可以通过口服含铁制剂（其对于患者来说是最容易的方法)来预防或治疗。然 而，问题在于口服铁制剂可能造成消化失调，并且服用的铁制剂的生物可利用率低。
[0004] 此外，用于肠胃外施用的含铁制剂必须满足铁在血红蛋白合成中的容易可用性、 没有局部或全身副作用和足够的由于半衰期而造成的储存稳定性的需求。目前可获得的经 批准在美国使用的肠胃外铁制剂包括葡聚糖铁(例如，InFecUDexferrum)、葡萄糖酸铁络合 物(Ferrlecit)、鹿糖铁(Venoferrum)等。
[0005] 葡聚糖铁是首先在美国上市的肠胃外铁制剂，并且具有过敏(过敏样)反应(呼吸 困难、气喘咳嗽、胸部疼痛、低血压、疹子、血管性水肿）的高发生率。葡聚糖铁频繁造成严重 和危及生命的反应，并且还造成如关节疼痛、背部疼痛、低血压、发烧、肌肉疼痛、搔痒、头晕 和恶心的症状。这样的过敏反应的高发生率被认为是由于形成了抗葡聚糖部分的抗体造成 的。尽管这些不良事件没足够严重到危及生命，但仍然在许多案例中被排除进一步施用。
[0006] 其他的肠胃外铁制剂(例如，蔗糖铁和葡萄糖酸铁)是不含葡聚糖的产品，并且这 些产品的使用显示出明显的过敏反应的低发生率。然而，这些化合物具有低铁结合能力，并 且因此在产品中显示出高游离铁浓度。由于该原因，当施用时，施用剂量和速率根据铁化合 物的毒性、高pH和高摩尔浓度的物理性质受限制。缺点还在于可注射的高分子量物质比低 分子量物质导致更高的过敏性反应。
[0007] 因此，作为用于肠胃外施用的含铁制剂，开发出了不是基于铁复合物而是基于铁 氧化物纳米颗粒的菲立莫妥(ferumoxytol )，并且关于其效力和施用的信息描述在[Landry 等人（2005)Am J Nephrol 25,400-410,408]、[3卩;[110?^2等人（2005)1(1(11167 1111:168， 1801-1807]和美国专利第6,599,498号中。菲立莫妥具有相对大的尺寸，其中铁氧化物核的 平均粒径是大约7nm并且其分子量为731kDa。菲立莫妥具有低游离铁浓度，因为其具有高于 其他肠胃外铁制剂(如，葡聚糖铁、蔗糖铁、葡萄糖酸铁等）的稳定性。典型的菲立莫妥治疗 包括对于lg铁的施用，每周施用两次，并且该施用模式增加医院成本(如导管和输液)并给 患者造成不便。
[0008] 可应用于各种纳米生物领域（如用于磁共振成像(MRI)的造影剂、细胞分选、高热 症、药物输送、生物传感器等）的铁氧化物纳米颗粒，可以通过共沉淀、水热合成、热分解等 来制备。在这些方法之中，共沉淀和水液合成是使氯化亚铁(II)和三氯化铁(III)在水溶液 中直接反应的沉淀法，并且使用这些方法以容易地制备铁氧化物纳米颗粒。然而，缺点在于 难以控制它们的尺寸。
[0009] 韩国专利公布第10-2007-0102672号提出了通过使用无毒金属盐作为反应物来制 备具有均匀粒径的铁氧化物纳米颗粒的高温分解法，但是该方法具有的缺点是，对于具有 4nm以下粒径的铁氧化物纳米颗粒的制备需要复杂的条件，并且因此难以商业化。此外，韩 国专利公布第10-2012-0013519号公开了制备具有4nm以下粒径的铁氧化物纳米颗粒的方 法，但是它的使用局限于T1造影剂。
[0010] 此外，铁氧化物纳米颗粒，例如，四氧化三铁(Fe3〇4,磁性物质）纳米颗粒在体内容 易沉淀，并且因此，在使用之前已经使用聚合物（如葡聚糖或壳聚糖)进行表面处理。然而， 葡聚糖的使用增加过敏反应(其为速发型超敏反应中的一种）的发生率，造成危及生命的情 况。此外，使用非葡聚糖物质(如壳聚糖)的缺点是，由于它们的低铁结合力导致递送至体内 的铁低。
[0011]因此，为解决现有技术中的这些缺点，迫切需要用于预防或治疗铁缺乏或由此伴 随的贫血的包含铁氧化物纳米颗粒的药物组合物，其中，所述组合物对人体是无毒的，并且 具有低过敏反应和高的铁递送效率。
【发明内容】
[0012] 技术问题
[0013] 本发明的一个目的是提供一种用于预防或治疗铁缺乏的药物组合物，其包含铁氧 化物纳米颗粒作为活性成分，其中，所述组合物没有在肠胃外施用时由高浓度的游离铁造 成的毒性，具有低过敏反应发生率、高的铁生物可利用率和室温下的长期储存稳定性。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括以下 步骤:使铁氧化物纳米颗粒与磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇反应，然后在水中分散所得铁氧化 物纳米颗粒以获得纳米颗粒水溶液;冷冻干燥所述纳米颗粒水溶液以获得干燥的纳米颗 粒;以及在盐水溶液中分散所述干燥的纳米颗粒，然后浓缩。
[0015]技术方案
[0016] -方面，为了达到上述目的，本发明提供了一种用于预防或治疗铁缺乏或由此伴 随的缺铁性贫血的药物组合物，所述组合物包含铁氧化物纳米颗粒。
[0017] 在本发明中，所述铁氧化物纳米颗粒可以是具有铁氧化物作为核并且用磷酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)进行表面改性的那些铁氧化物纳米颗粒，其中，所述铁氧化物可以是选 自氧化亚铁(FeO)、三氧化二铁(Fe 203)和四氧化三铁(Fe3〇4)的一种或多种，并且所述铁氧 化物纳米颗粒可以是顺磁性的或假顺磁性的(pseudo-paramagnetic)。
[0018] 本发明的另一个方面提供了一种制备所述药物组合物的方法，所述方法包括以下 步骤:使铁氧化物纳米颗粒与磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)反应，然后在水中分散所 得铁氧化物纳米颗粒以获得纳米颗粒水溶液;冷冻干燥所述纳米颗粒水溶液以获得干燥的 纳米颗粒;以及在盐水溶液中分散所述干燥的纳米颗粒，然后浓缩。
[0019] 根据本发明，当铁氧化物颗粒的表面用磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)的复 合物来改性时，向人体递送铁的效率可以增加，生物相容性可以改善从而不显示毒性，并且 稳定性可以增加以允许在室温下长期储存。
[0020] 有益效果
[0021] 根据本发明的包含铁氧化物纳米颗粒作为活性物质的用于预防或治疗铁缺乏的 药物组合物在口服施用时可以克服消化失调和低生物可利用率，并且还把由于铁制剂的解 离造成的游离铁的毒性问题，尤其是，在肠胃外施用时的过敏反应减至最低。此外，本发明 改善了铁氧化物纳米颗粒的稳定性以允许在室温下长期储存，并且还提供了适合于弹丸注 射的铁制剂，从而大大改善患者便利度。
【附图说明】
[0022]图1显示在本发明的实施例1-1中制备的大小为3nm的铁氧化物纳米颗粒的透射电 子显微镜图像；
[0023]图2显示在向小鼠施用在本发明的实施例1中制备的药物组合物KEG3之后，器官中 的铁(Fe-59)分布随着时间的变化；
[0024]图3显示在向小鼠施用在本发明的实施例1中制备的药物组合物KEG3之后，血浆和 血细胞中铁(Fe-59)分布的变化；
[0025]图4显示赋形剂治疗组和通过向正常小鼠施用本发明的实施例1的药物组合物 KEG3而制备的KEG3治疗组之间的血液血红蛋白（Hb)水平随着时间的变化的比较；
[0026]图5显示赋形剂治疗组和通过向正常小鼠施用本发明的实施例1的药物组合物 KEG3而制备的KEG3治疗组之间的红细胞的平均细胞体积(MCV)随着时间的变化的比较；以 及
[0027]图6为显示市售贫血药物和本发明的实施例1的药物组合物KEG3之间游离铁浓度 的比较的图。
【具体实施方式】
[0028]以下，将更加详细描述本发明。
[0029] 本发明涉及一种用于预防或治疗铁缺乏或由此伴随的缺铁性贫血的药物组合物， 所述药物组合物包含铁氧化物纳米颗粒。
[0030] 在此使用的术语"铁氧化物"指由铁和氧的结合形成的物质。铁氧化物的例子可包 括铁氧化物（如氧化亚铁(FeO)、三氧化二铁(Fe 203)和四氧化三铁(Fe3〇4，磁铁矿））和铁金 属氧化物，但是不局限于此。
[0031] 在本发明的实施方式中，所述铁氧化物纳米颗粒可以是用亲水材料进行过表面处 理的那些铁氧化物纳米颗粒，并且例如，铁氧化物颗粒的表面用磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇 (P0-PEG)改性以增加向人体递送铁的效率。尤其是，所述包覆材料具有优异的生物相容性 从而不显示毒性，并且增加稳定性以允许在室温下长期储存。
[0032]关于本发明的纳米颗粒，所述铁氧化物核颗粒的平均粒径为lnm以上至4nm以下， 并且优选2nm以上至4nm以下。为了使用本发明所述的铁氧化物纳米颗粒作为用于预防或治 疗铁缺乏或缺铁性贫血的药物组合物的活性成分，需要制备尺寸小且均匀的铁氧化物纳米 颗粒。
[0033] 考虑到铁氧化物纳米颗粒的排泄率和生物可利用率，纳米颗粒的铁氧化物核的粒 径可以优选为lnm以上。如果所述粒径超过4nm以增加铁氧化物纳米颗粒的体积，那么颗粒 分解花费的时间和生物可利用率增加，但是铁氧化物纳米颗粒迀移到除血管外的其他器官 增加，从而减少血液中的利用率。
[0034] 在具体的实施方式中，本发明所述的铁氧化物纳米颗粒可以是顺磁性的或假顺磁 性的，并且例如，所述铁氧化物纳米颗粒在20K或更高的温度下可以是顺磁性的或假顺磁性 的。
[0035] 具体地，根据本发明所述的铁氧化物纳米颗粒a)可以在20K或更高的温度下是顺 磁性的或假顺磁性的，b)可具有平均粒径为lnm至4nm的铁氧化物核颗粒，c)可以用亲水材 料表面处理，以及d)在颗粒之间可不附聚。优选地，所述亲水材料可以是磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇（P0-PEG)。
[0036] 根据本发明所述的铁氧化物纳米颗粒适合于用来治疗和预防铁缺乏和由此伴随 的缺铁性贫血的药物。尤其是，测量了根据本发明所述的铁氧化物颗粒中的游离铁浓度。结 果发现，与现有的铁制剂中的游离铁浓度相比，所述游离铁浓度非常低（图6)。因此，由于所 述低游离铁浓度，本发明的组合物由此造成的毒性很少，表明所述铁氧化物纳米颗粒可以 是足够安全施用于人体的。
[0037] 缺铁性贫血，例如，孕妇的缺铁性贫血、儿童和青少年的潜伏性缺铁性贫血、由胃 肠道病症造成的缺铁性贫血、由失血，例如，胃肠道出血（由例如溃疡、癌症、痔疮、炎性疾 病、乙酰水杨酸的摄取造成的）造成的缺铁性贫血、由月经造成的缺铁性贫血、由损伤造成 的缺铁性贫血、由口炎性腹泻造成的缺铁性贫血和在仅食用他们喜欢的食物的儿童和青少 年中由铁缺乏饮食造成的缺铁性贫血可以预防或治疗。此外，除铁缺乏以及缺铁性贫血之 外，根据本发明所述的药物组合物可以用来预防或治疗由铁缺乏造成的疾病，例如，免疫受 损、大脑机能障碍和不宁腿综合征。
[0038] 在病理学案例中，降低的血清铁水平导致降低的血红蛋白水平、降低的红细胞产 量，并且因此导致贫血。贫血的外部症状包括疲劳、脸色苍白、注意力不集中等。贫血的临床 症状包括低血清铁水平（血铁过少）、低血红蛋白水平、低血细胞比容水平、减少的红细胞 数、减少的网状细胞和升高的可溶性转铁蛋白受体。
[0039] 如在此使用的术语"预防"指在尚未被诊断有疾病或病症但是易患有该疾病或病 症的动物中抑制该疾病或病症的发生。此外，如在此使用的术语"治疗"指抑制疾病或病症 的发展、缓解疾病或病症或者消除疾病或病症。
[0040] 本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明所述的铁氧化物纳米颗粒，任意 一种或多种另外的药学上有效的化合物，以及任意一种或多种药学上可接受的载体和/或 辅助物质，和/或溶剂。
[0041] 此外，本发明所述的药物组合物可以通过口服施用和肠胃外施用的任意途径向儿 童、青少年和成人施用，并且优选通过肠胃外途径施用。
[0042] 如在此使用的术语"施用"指通过某些适合方法将本发明所述的药物组合物引入 到需要进行疾病治疗的受试者中。本发明所述的组合物可以通过各种途径(包括口服或肠 胃外途径)施用，只要其能够到达所需组织即可。关于本发明的目，任意特定患者的具体治 疗上有效的剂量水平可以依据医学领域中熟知的各种因素(包括将要实现的反应的种类和 程度，根据是否同时使用或不使用其他药剂的具体组成，患者的年龄、体重、健康状况、性别 和饮食，施用的时间和途径，组合物的分泌率、治疗的时期，组合使用或与特殊组合物同时 使用的其他药物，以及医学领域中熟知的类似因素)改变。
[0043] 更具体地，本发明所述的组合物可以通过静脉弹丸注射或肌肉弹丸注射的肠胃外 施用来给予。此外，用于肠胃外施用的可注射制剂可包含等渗水溶液或悬浮液，并且可以根 据本领域中的已知方法通过使用适当分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。例如，各个成分可 以通过将它们溶解在盐水溶液或缓冲液中配制成可注射制剂。此外，口服施用的制剂可包 括，但不局限于，粉末、颗粒、片剂、丸剂、乳剂、糖浆、胶囊等。
[0044] 在此使用的术语"药学上可接受的载体"指不会对有机体造成明显刺激并且不会 取消施用化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。药学上可接受的载体的例子可包括： 用于口服施用的载体，如，乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等;和用于肠胃外施 用的载体，如，水、适合的油、盐水溶液、葡萄糖水溶液和乙二醇。这些药物上可接受的载体 可包括，例如，盐水、蒸馏水、复方氯化钠注射液(Ringer ' s solution)、缓冲盐水、葡萄糖溶 液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或这些成分中的至少一种的混合物。任选地，其他类型的添加 剂，如稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等可以作为赋形剂加入。
[0045] 本发明的另一个方面提供了一种制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步 骤:使铁氧化物纳米颗粒与磷酸酯或磷酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)反应，然后在水中分散所得 铁氧化物纳米颗粒以获得铁氧化物纳米颗粒水溶液;冷冻干燥所述铁氧化物纳米颗粒水溶 液以获得干燥的纳米颗粒；以及在盐水溶液中分散所述干燥的纳米颗粒，然后浓缩。在所述 分散和浓缩步骤中，可以加入药学上可接受的赋形剂或添加剂。
[0046] 实施例
[0047] 以下将参考实施例详细描述本发明。但是，下列实施例仅用于说明的目的，并且本 发明并不意欲由下列实施例来限制。
[0048] 实施例1.含有铁氧化物纳米颗粒的药物组合物(KEG3)的制备
[0049] 1-1:粒径为3nm的铁氧化物纳米颗粒的制备
[0050] 将1 · 8g(2mmol)的油酸铁、0 · 57g(2mmol)的油酸和1 · 61g(6mmol)的油醇与 10g 的二 苯醚混合。然后，将所述混合物加入圆底烧瓶，在80°C下在真空下脱气1小时。将氩气通入到 所述烧瓶以保持惰性气氛，然后，在将温度以10 °C/min的速率升高至250 °C的同时允许反 应。随着所述反应进行，发现反应物的颜色变成黑色。在温度达到250°C后，允许所述反应30 分钟，随后快速冷却。产物用过量丙酮洗涤。将洗涤后获得的沉淀物分散在有机溶剂(如，氯 仿或己烷）中。
[0051] 图1为显示实施例1-1的铁氧化物纳米颗粒的透射电子显微镜结果的照片。铁制剂 的铁氧化物核颗粒的平均粒径为3.4nm，并且粒径的标准偏差为0.38nm〇
[0052] 1-2:用磷酸酯-聚乙二醇(磷酸酯-PEG，P0-PEG)表面处理铁氧化物纳米颗粒 [0053] 将0.15g的磷酰氯(P0C13)和6g的聚乙二醇甲醚加入到7ml的四氢呋喃（THF)溶液 中，随后搅拌4小时。将THF移除以获得磷酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)。
[0054]将10mg的在实施例1-1中制备的粒径为3nm的铁氧化物纳米颗粒与100mg制备的磷 酸酯-聚乙二醇(P0-PEG)在乙醇中混合，然后密封。在70°C下搅拌4小时用于配体交换。将所 得铁氧化物纳米颗粒用正己烷洗涤三次，并且将乙醇蒸发，随后加入水。将所述铁氧化物纳 米颗粒分散在水中以获得流体动力学直径为11.7nm的表面经处理的铁氧化物纳米颗粒的 水溶液。
[0055] 1-3:含有铁氧化物纳米颗粒的药物组合物(KEG3)的制备
[0056] 将100ml的0.9 %生理盐水加入到通过冷冻干燥在实施例1-2中获得的表面经处理 的铁氧化物纳米颗粒的水溶液而获得的干燥的纳米颗粒中，从而将所述纳米颗粒分散于其 中。将分散液通过孔径为〇.2μπι的注射器式过滤器。将滤液分开并放入容积为15ml的 Amicon?超离心过滤器-ultracel?-50K，并且通过以3，OOOrpm离心分离60分钟来移除滤 液来进行浓缩。将0.9%生理盐水加入到各个浓缩过滤器中用于稀释。重复几次离心浓缩以 获得溶液，其中，铁氧化物纳米颗粒被浓缩在〇. 9%生理盐水中。将该溶液命名为KEG3。
[0057] 实施例2.Fe-59_标记的KEG3的制备
[0058]除了使用加入59FeCl3的Fe-油酸盐复合物之外，通过使用以与在实施例1-1中相同 的方法制备的铁氧化物纳米颗粒，以与在实施例1中相同的方法来制备亲水化纳米颗粒溶 液。通过透射电子显微镜(TEM)确认合成了大约3nm的铁氧化物纳米颗粒。在亲水化之后的 测量结果显示，所述颗粒的流体动力学直径为14. lnm。
[0059] 测量在实施例1 -3中制备的KEG3药物组合物中的Fe-59-标记的粒径为大约3nm的 铁氧化物纳米颗粒的辐射强度，然后，加入生理盐水溶液(〇. 9 %NaCl水溶液）以制备铁(Fe) 浓度为1409yg Fe/mL的溶液。
[0060] 对比实施例1.粒径为12nm的铁氧化物纳米颗粒的合成
[0061] 以与 J · Park等人的U1 tra-large- scale syntheses of monodisperse nanocrystals(单分散纳米结晶物的超大规模合成），Nature Materials，3，891-895(2004) 中描述的相同方法制备粒径为12nm的铁氧化物纳米颗粒。将1.8g的油酸铁和0.28g的油酸 与l〇g的1-十八烯混合，随后以3.3°C/min的速率升高温度至318°C，并且在318°C下使颗粒 生长30分钟。
[0062] 实施例3.小鼠中Fe-59-标记的KEG3的铁氧化物分布
[0063]将0.1ml在实施例3中制备的Fe-59-标记的KEG3溶液经由6周大ICR小鼠的尾静脉 注射。注射后5分钟、10分钟和30分钟、1小时和6小时、1天、3天、10天、30天、91天和182天收 集血液、肌肉、骨骼、脂肪、心脏、肝脏、肺、肾、肠、胰腺、脾和胃（n = 3~4)。血液和各种器官 中的纳米颗粒的含量通过使用γ计数器测量59Fe放射性来计算。为评估通过静脉内施用铁 氧化物纳米颗粒对各个器官的暴露量，将在器官中测量放射性定量为％ ID(注射剂量)/g 和％ ID/器官（％ ID:剩余剂量与注射剂量的百分比（59Fe)，％ ID/g:每单位重量的％ ID，％ ID/器官:每个器官的％ID)。取出所述各个器官并称重。因为难以测量血液、肌肉、脂肪和骨 骼的整个重量，所以使用它们占总体重的比例来计算它们的重量(血液:7%，肌肉：40%，月旨 肪:7%，骨豁:10%)。此外，为了测量 59Fe在血液中的血浆和红细胞中的分布，随时间收集血 液，然后由其分离血浆和红细胞。测量血浆和红细胞的放射性。
[0064]如图2中所示，发现铁氧化物纳米颗粒的吸收主要在血液、肝脏和脾中。在肝脏中， 器官中的％ ID增加直到6小时为止，然后，在6小时后持续降低。肝脏在182天显示出3.73% ID/g和8.88% ID/器官。与肝脏相似，脾的暴露量在182天显示出12.4% ID/g和1.39% ID/器 官。为了计算体内剩余铁氧化物纳米颗粒的百分比，评估通过在相应时间里从整个机体中 测量的59Fe的含量减去红细胞中测量的 59Fe的含量获得的值。在这点上，存在的担忧是，肌 肉、脂肪或骨骼中的辐射强度的计算与血液中的辐射强度的计算可能重复，并且也难以测 量其整体重量。因此，从整个机体的辐射强度的计算中排除肌肉、脂肪和骨骼。以5.2mg Fe/ kg的剂量施用后，施用剂量的大约33%和64%分别在施用后91天和182天排出。
[0065]如图3中所示(血浆和红细胞的59Fe浓度比较的曲线图），随着时间的过去，血浆中 的59Fe逐渐下降而红细胞中的59Fe逐渐增加。3天后，大部分存在于血液中的59Fe在红细胞 中。
[0066] 实施例4.大鼠中的KEG3的药代动力学研究
[0067] 在实施例1中制备的KEG3溶液以2.6、5.2或10.4mg Fe/kg的单一剂量向45个无特 定病原（SPF)的斯普拉格-道利（Sprague-Dawley)大鼠 [Cr 1: CD(SD)]静脉内施用，并且在预 定的时间收集血液。离心分离所述血液以仅获得血浆，并且用4.7T磁共振成像(MRI)扫描仪 测量血浆的T2弛豫时间以分析血液中的KEG3浓度。
[0068] 在实验期间，未观察到动物死亡和异常，并且大鼠中的KEG3的药代动力学参数在 下表1中给出。在通过以2.6、5.2或10.4mg Fe/kg的剂量向雄性大鼠施用KEG3而制备的实验 组中，随着施用剂量以1: 2:4的比率增加，全身暴露量（由AUCinf测定）以剂量依赖的方式以 大约1:3:7的比率增加。在施用实验材料后的浓度-时间曲线中，终末半衰期(t 1/2)在所有施 用组中是2.2-4.2小时，施用试验材料后12-24小时，浓度低于检测限（3yg Fe/mL)。
[0069] [表1]
[0070]
[0071] 药代动力学参数:表观终末消除速率常数(Kel)，终末半衰期(t1/2)，最大观测峰值 血浆浓度(C max)，观察到Cmax的时间（Tmax)，总体清除率(CL)，从给药开始到最后取样的时间 在血清浓度时间曲线(AUC)下的面积(AUC last)，外推至时间无穷大的从Oh到无穷大的在血 浆浓度-时间曲线下的面积(AUCinf)。
[0072] 实施例5. KEG3对正常小鼠的血液成分的影响
[0073] 为了分析在正常小鼠中实施例1的KEG3的影响，42个9周大的C57BL/6小鼠用赋形 剂或实施例1中制备的KEG3以5.2mg Fe/kg的剂量静脉内施用。施用当天和施用后1天、3天、 7天和14天，收集血液，并且分析血液成分的变化以检查铁氧化物纳米颗粒的影响。
[0074] 在实验期间，在所有实验动物中没有发现异常。如在图4中所示，与赋形剂治疗组 相比，KEG3治疗组的血液血红蛋白（Hb)水平没有显著性变化。如在图5中所示，与赋形剂治 疗组相比，所述KEG3治疗组在试验材料施用后14天在红细胞的平均细胞体积(MCV)上显示 出统计学上的显著增加(P〈〇.05)，但是满足正常血液的MCV。因此，证实通过KEG3施用在正 常小鼠的血液成分中没有很大变化。
[0075] 实施例6 .KEG3的游离铁浓度的试验
[0076]为了例证在实施例1中制备的KEG3的在肠胃外施用期间产生毒性的游离铁的浓 度，通过超滤检验市售铁制剂和实施例1的KEG3的游离铁浓度。
[0077] 三种市售贫血药物（Venof errum、Cosmof er、Ferin ject)和在实施例1中制备的 KEG3分别以2，OOOyg Fe/mL的浓度稀释。然后，它们中的每一个使用具有10，000、30，000、 50,000和100,000截留分子量(110))的离心分离过滤器以3,000印111离心分离30分钟以仅收 集滤出液。
[0078]将50yL的含有10mM抗坏血酸的0.5M柠檬酸盐缓冲溶液加入到500yL的所述溶液 中，然后允许反应进行30分钟。向其中加入10yL的50mM BPS (红菲咯啉二磺酸酯 (Bathophenantroline disulfonate))，并且允许反应进行20分钟以上。将每100yL的所述 溶液加入到96孔微孔板中，并且使用酶标仪测量在535nm下的吸光度以测定游离铁浓度。 [0079]如在图6中所示，无论截留分子量，在实施例1中制备的KEG3的游离铁浓度显示出 在过滤器中50,000以下的一致水平，并且所述游离铁浓度还低于市售贫血症药物的那些游 离铁浓度，表示KEG3具有低毒性。
[0080] 实施例7.大鼠的单静脉内施用的急性毒性试验
[0081 ]使用5个无特定病原(SPF)的斯普拉格-道利大鼠 [Crl :CD(SD)]来检验KEG3的单次 静脉内施用的急性毒性。作为试验材料的施用途径，进行静脉内施用(其为人的临床预取途 径）。在所述试验中，基于10mL/kg的最大单次注射体积，施用剂量为840mg/kg的最大剂量。 通过应用3.2的剂量进展因子，将下面的剂量确定为在0ECD指南第425号中推荐的施用剂量 (1.75、5.5、17.5、55、175、550和84〇11^/1^)。下一剂量根据由4(^4258七3七？8111推荐的极限剂 量试验的程序来确定。如果动物在单次施用840mg/kg的极限剂量之后还存活，那么下一动 物以相同剂量施用。如果5个小鼠中的3个以上死亡，将试验转变成主要试验。单次剂量毒性 试验组的构成和施用剂量在下表2中给出。
[0082][表 2]
[0084] *以起始剂量施用的动物
[0085]在实验期间，没有观察到动物死亡，并且观察到与施用试验材料有关的皮肤颜色 的改变以及有色的尿。在所有动物中观察到重量减轻和增加的抑制。没有观察到与施用试 验材料有关的易见发现。发现通过使用铁氧化物纳米颗粒向雌性大鼠的静脉内施用的试验 材料的致死剂量50(LD50)超过840mg/kg(300mg Fe/kg)。
【主权项】
1. 一种用于预防或治疗铁缺乏或缺铁性贫血的药物组合物，其包含铁氧化物纳米颗 粒。2. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铁氧化物纳米颗粒包含铁氧化物核颗粒 和用磷酸酯-聚乙二醇改性的表面。3. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铁氧化物纳米颗粒的核颗粒的大小为 lnm至4nm〇4. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铁氧化物为选自氧化亚铁(FeO)、三氧化 二铁(Fe20 3)和四氧化三铁(Fe3〇4)的一种或多种。5. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铁氧化物纳米颗粒为顺磁性的或假顺磁 性的。6. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述铁氧化物纳米颗粒 a) 在20K或更高的温度下为顺磁性的或假顺磁性的， b) 包含粒径为lnm至4nm的铁氧化物核颗粒，和 c) 用亲水材料处理的表面，并且 d) 颗粒之间无附聚。7. 如权利要求6所述的药物组合物，其中，所述亲水材料为磷酸酯-聚乙二醇。8. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述缺铁性贫血为选自孕妇的缺铁性贫血、 儿童和青少年的潜伏性缺铁性贫血、由胃肠道病症造成的缺铁性贫血、由失血造成的缺铁 性贫血、由月经造成的缺铁性贫血、由损伤造成的缺铁性贫血、由口炎性腹泻造成的缺铁性 贫血、癌症患者的缺铁性贫血、由化疗造成的缺铁性贫血、由炎症(AI)造成的缺铁性贫血、 由慢性心力;S竭(CHF)造成的缺铁性贫血、由风湿性关节炎(RA)造成的缺铁性贫血、由系统 性红斑狼疮(SLE)造成的缺铁性贫血和由炎性肠病(IBD)造成的缺铁性贫血的一种或多种。9. 如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述药物组合物通过静脉弹丸注射或肌肉弹 丸注射施用。10. 如权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂或载体。11. 一种制备包含铁氧化物纳米颗粒的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤： 使铁氧化物纳米颗粒与磷酸酯-聚乙二醇反应，并在水中分散所得铁氧化物纳米颗粒 以获得纳米颗粒水溶液； 冷冻干燥所述纳米颗粒水溶液以获得干燥的纳米颗粒；以及 在盐水溶液中分散所述干燥的纳米颗粒并进行浓缩。
【文档编号】A61P7/06GK105848661SQ201480071514
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】全烽植, 权恩星, 金应奎, 明岏在, 朴炷锳
【申请人】韩化石油化学株式会社