一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料及其制备方法和应用，是培养脐带间充质干细胞分泌的基质，该基质可抗细胞的早衰。将脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，当细胞密度接近90%时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养7?10天；然后加入脱细胞液，构建得到细胞外基质生物材料。所述脐带间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。本发明提供的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料可用于细胞的培养，包括细胞移植治疗，再生医学和组织工程等领域。本发明研究表明MSCs培养在ECM的环境下胞内ROS的含量明显下降，证实了来源于UC?MSCs的ECM能够缓解H2O2诱导的UC?MSCs早衰，为解决细胞衰老带来的挑战提供了一种新的策略。
【专利说明】
一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以从多种成人组织中获取，由于MSCs具有自我更新、多向分化及免疫兼容性的特点在基于细胞理论的再生医学和组织工程方面引起了临床的广泛关注。MSCs自体来源主要源自骨髓基质、脂肪组织、滑膜组织及皮肤组织。MSCs从这些组织中获取方便，不涉及道德伦理问题，便于临床和实验研究。最近，MSCs来源于胚胎外组织，如来源于Wharton’s jelly(脐带中包绕两条脐动脉和一条脐静脉黏蛋白样结缔组织)的人类脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived MSCs，UC-MSCs)，在临床上的应用比较有优势。UC-MSCs可通过非侵入性的方式获得，符合伦理道德的要求。相比于其他组织获取的MSCs ,UC-MSCs的增殖能力更强，与胚胎干细胞有着相似的基因表达谱，体外传代多次才会出现复制性衰老。
[0003]与其他体细胞类似，MSCs在体外增殖出现生长停滞进入细胞衰老过程之前有一定的寿命限制。细胞衰老时形态上变的宽大而扁平，细胞增殖永久停滞即使细胞基本的新陈代谢能力仍存在。MSCs—旦衰老，多向分化潜能降低，限制了其在临床治疗方面的应用。端粒缩短，DNA受损，氧化应激，衰老相关基因表达都会引起细胞衰老。活性氧的累积(reactive oxygen species，R0S)，如过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)，引起氧化应激，进而诱发细胞早衰。有害水平的ROS在骨性关节炎中的关节软骨中不仅引起DNA氧化损伤，还使MSC的再生潜能受到抑制。
[0004]细胞衰老导致了细胞周期不可逆转的停滞，ρ16ΙΝΚ4α是一种细胞周期蛋白酶抑制剂，可调控细胞周期的进程，通过调控细胞周期激酶调节细胞从Gl期到S期。
[0005]关于干细胞衰老的分子机制已有大量研究报道，普遍认为与干细胞从体内到体外所处的微环境改变有关。MSCs—旦离开体外特异的微环境，逐渐失去其自我更新及多向分化的潜能。干细胞微环境重要的组成部分是ECM，ECM以其复杂的生物化学和物理信号维持着细胞功能。研究者们已经尝试重建细胞内天然的微环境，通过运用不同ECM蛋白的组合调控MSCs的命运。Linsley等比较了纤连蛋白原、I型胶原、纤连蛋白三种不同ECM蛋白，发现纤连蛋白原在促进MSCs成骨分化方面起着最重要作用。然而，天然的ECM不仅包含各种各样的蛋白质，如1、I1、II1、IV、V和VI型胶原，纤连蛋白和层粘连蛋白等粘附蛋白及大分子量蛋白聚糖，而且为细胞存在提供场所，加强MSCs对机械信号刺激的反应，像拉应力和压力的刺激，这是通过特异性的细胞表面的整合素-细胞外基质的相互作用。因此在天然细胞起源的ECM和有ECM蛋白涂层的基质上培养的细胞显示出了不同特性，但天然ECM调控MSCs功能的确切机制需要近一步的探索研究。
[0006]最近，有研究报道起源于MSCs的脱细胞ECM有益于体外MSCs的大量扩增和多向分化潜能。之前我们的研究表明脱细胞ECM不但提高了 MSCs的生物抗氧化功能而且也加强了细胞内褪黑素的抗氧化和骨诱导的特性，而来源于干细胞的ECM对MSCs的早衰的作用及调控其早衰的潜在机制目前还没有完全阐明。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于针对MSCs在体外扩增和体内移植过程中不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下造成细胞早衰的问题，提供一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料，以及该细胞外基质生物材料(ECM)抗细胞早衰的方法及应用。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
抗细胞早衰的细胞外基质生物材料，其是培养脐带间充质干细胞分泌的基质，该基质可抗细胞的早衰。通过脐带间充质干细胞分泌基质制备的ECM，具有多种蛋白质成分，可通过降低SAKa活性，促进细胞进入S期，减少胞内ROS水平，抑制ρ16ΙΝΚ4α基因及蛋白的表达来达到抗干细胞早衰的目的。
[0009]所述脐带间充干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。
[0010]所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，包括如下步骤:
1)将脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，当细胞密度接近90%时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养7-10天；
2)加入脱细胞液，PBS清洗，得到细胞外基质生物材料。
[0011]所述脐带间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。
[0012]所述完全培养基为组分为α-ΜΕΜ 80?90%体积比，胎牛血清10?20%体积比，抗生素1?200 U/mLo
[0013]所述完全培养液中抗坏血酸的浓度为100_200μΜ。
[0014]所述脱细胞液由ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制而成，含有Triton X-100 0.5-5%体积比和氨水1-40mM。
[0015]本发明提供的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料可用于细胞的培养，包括细胞移植治疗，再生医学和组织工程等领域。
[0016]在细胞培养时，将待培养细胞直接加入到本发明的细胞外基质生物材料中，可延缓细胞的衰老。
[0017]本发明的生物材料在制备抗细胞衰老的化妆品、药物或者保健品中的应用。将本发明的生物材料与本领域常规辅料混合制备成化妆品用于延缓细胞的衰老。
[0018]本发明构建得到ECM并考察了H2O2诱导下的UC-MSCs早衰情况，具体为:
(A)脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)培养在完全培养基中(培养基组分为α-ΜΕΜ 80-90%体积比，胎牛血清10?20%体积比，抗生素1?200 U/mL)，密度接近90%时，加入含有抗坏血酸(100_200uM)的完全培养液培养7-10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液(由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 0.5-5%体积比和氨水10_40mM)，构建得到ECM。
[0019](B)UC-MSCs培养在普通的孔板(TCPS板)和底部铺有ECM的孔板(ECM板)中，密度接近50%时，加入不同浓度梯度H2O2 (50 μΜ ,100 μΜ，200μΜ)处理2_4h，造成干细胞氧化应激。(B)去除H2O2后加入无血清的培养基清洗两次，加入上述的完全培养基继续培养3-5天后检测早衰干细胞SAKal染色阳性率、细胞内ROS表达水平、细胞周期中G0/G1期比例、细胞内pl6INK4aS因及蛋白表达水平。
[0020] 我们采用了中间不同浓度梯度的Η202(50μΜ ,100 μΜ，200μΜ)产生氧化应激环境诱导UC-MSCs早衰。ECM板与TCPS板相比，ECM板能有效抑制住H2O2诱导的UC-MSCs早衰，尤其H2O2浓度为50 μΜ和100 μΜ时。ECM能明显缓解细胞早衰，减弱衰老相关表型，包括SAKal活性、ROS水平、细胞周期分布、ρ16ΙΝΚ4α含量。而且，当H2O2浓度达到200uM时，ECM不能阻止MSCs的早衰。因此，ECM能在适度水平的氧化应激下缓解MSCs的早衰，异常高水平的氧化应激超过细胞最大承受范围，最终导致不可逆性的细胞衰老。
[0021 ]移植MSCs用于修复受损组织及替代衰老器官在临床治疗的应用具有很大的潜力，但受损组织区域内的病理条件及伴随着异常水平的氧化应激，对临床上的应用将是一大挑战。异常水平的ROS可以引起祖细胞及移植的MSCs的DNA损害，DNA损伤没有恰当的修复是导致细胞衰老的主要因素。MSCs为了
维持自我更新的潜能必须克服氧化应激诱导的衰老。
[0022]MSCs在细胞移植、再生医学和组织工程中广泛应用，但其不可避免的遭受氧化应激发生衰老，极大的限制了其应用，因此抵抗细胞衰老显得尤为重要。本发明证实了来源于UC-MSCs的ECM能够缓解H2O2诱导的UC-MSCs早衰，这为解决细胞衰老带来的挑战提供了一种新的策略，将有利于MSCs在临床方面的应用。
[0023]有益效果:
本发明提供的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料，通过脐带间充质干细胞分泌基质制备的ECM，具有多种蛋白质成分，可通过降低SAKa活性，促进细胞进入S期，减少胞内ROS水平，抑制ρ16ΙΝΚ4α基因及蛋白的表达来达到抗干细胞早衰的目的，本发明研究表明MSCs培养在ECM的环境下胞内ROS的含量明显下降，证实了来源于UC-MSCs的ECM能够缓解H2O2诱导的UC-MSCs早衰，这为解决细胞衰老带来的挑战提供了一种新的策略，将有利于MSCs在临床方面的应用。
【附图说明】
[0024]
图1为SA-P-Gal染色检测分析ECM作用各种浓度H2O2处理后干细胞内SA-P-Gal染色阳性率的变化；
图2为流式细胞术检测分析ECM作用H2O2诱导的早衰干细胞内ROS水平的变化；
图3为流式细胞术检测分析ECM作用H2O2诱导的早衰干细胞内细胞周期分布的变化；
图4为RT-PCR检测分析ECM作用各种浓度H2O2处理后细胞内p 16ΙΝΚ4α基因表达水平变化； 图5为Western bort检测分析ECM作用早衰干细胞后细胞内ρ16ΙΝΚ4α蛋白含量变化。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0026]实施例1抗细胞早衰的细胞外基质生物材料(ECM)的制备
人源UC-MSCs umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC_MSCs)在37°C、5%C02培育箱中培养于175cm2完全培养基的培养瓶中(培养基各组分的体积比为:89%的α-ΜΕΜ, 10%的胎牛血清，1%的青霉素、1%链霉素)，每三天换一次液。当细胞密度接近90%时用
0.25% trypsin-EDTA消化细胞，按5000/cm2接种于孔板中培养，直到达到90%融合，加入100μΜ抗坏血酸继续培养8天，三天换液一次。8天后为了获得游离的ECM，培养细胞加入脱细胞混合液(由ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有0.5%Triton X-100和20mM氨水)于37°C环境下孵育5分钟。随后脱细胞的ECM用PBS清洗3次，最后一次用含有IX双抗的PBS清洗并保留在孔板中，4 C存储在无囷环境中备用。
[0027]实施例2 ECM对各种浓度H2O2处理后干细胞内SA-f3_Gal染色阳性率、胞内ROSJH胞周期分布的影响
人源UC-MSCs在37 0C、5%C02培育箱中培养于175cm2培养瓶中(培养基各组分的体积比为89%的α-ΜΕΜ，10%的胎牛血清，1%的青霉素、链霉素)，每三天换一次液。当细胞密度接近90%时用0.25% trypsin-EDTA消化细胞，按5000/cm2接种于预处理(方法为TCPS板用0.2%明胶在37°C环境下孵育I小时，接着用1%戊二醛和IM乙醇胺在室温下孵育30分钟)的多种规格的孔板中(12孔板用于SA-P-Gal染色，6孔板用于ROS含量、细胞周期、RT-PCR测定，75cm2培养瓶用于ρ16ΙΝΚ4α蛋白分析)培养，直到达到90%融合，加入ΙΟΟμΜ抗坏血酸继续培养8天，三天换液一次。8天后为了获得游离的ECM，培养细胞加入脱细胞混合液(由ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有0.5%Triton X-100和20mM氨水)于37°C环境下孵育5分钟。随后脱细胞的ECM用PBS清洗3次，最后一次用含有IX双抗的PBS清洗并保留在孔板中，4°C存储在无菌环境中备用。UC-MSCs以5000/cm2密度分别接种在TCPS和ECM板中于37 °C、5%C02环境下培养。
[0028]A.ECM对各种浓度H2O2处理后干细胞内SAKal染色阳性率的影响
SA-13-gal染色阳性一直作为一个典型的过早衰老的生物标志物，SA-13-gal染色使用SA-13-gal染色试剂盒(碧云天生物研究所)。按照试剂商提供的操作说明，细胞过夜孵育在无CO2的37°C摇床中，第二天吸出染色液，PBS清洗两次后DAPI复染3 min，再用PBS清洗3次，尽快Olympus 1X51倒置显微镜下拍照。为了量化SA_i3-gal染色阳性细胞(细胞染成蓝色)的百分比，每组随机选择所拍摄的10张图片，每张图片至少含有200个细胞，统计衰老细胞的比例。
[0029]结果如图1所示，ECM明显降低各种浓度H2O2处理后UC-MSCs的SA-f3_gal染色阳性率。(Scale bar = 100 μπι)
B.ECM对H2O2诱导的早衰干细胞内ROS含量变化的影响
DCF-DA荧光定量法检测细胞内ROS水平。每管至少收集2 X 15个细胞在10μΜ I'二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)中37 °C避光水浴30分钟。使用Cytomics FC500流式细胞分析仪测量荧光强度。
[0030]结果如图2所示，ECM显著降低H2O2诱导的早衰UC-MSCs内ROS含量。
[0031]C.ECM对H2O2诱导的早衰干细胞内细胞周期分布的影响
细胞周期分布通过PI染色分析评估。贴壁细胞被胰蛋白酶分离，分离的细胞收集在EP管中，4°C固定在70%乙醇24小时。第二天用预冷的I3BS洗涤一次后，每管样品用100μ1的PI染液(含有50ug/ml PI和50ug/ml RNase A，PBS配置)在37°C
水浴箱中避光孵育30分钟，转移到流式管后尽快上机检测，每个样品至少检测5000个细胞。
[0032]结果如图3所示，ECM增加了 H2O2诱导的早衰UC-MSCs进入S期的比例。
[0033]实施例3 ECM对各种浓度H2O2处理后干细胞内ρ 16ΙΝΚ4α基因及蛋白表达的影响。
[0034]A.ECM对各种浓度H2O2处理后干细胞内ρ16ΙΝΚ4α基因水平变化的影响ECM构建及细胞培养方式同实施例1，贴壁细胞运用TRIzol试剂裂解进而提取总RNA，按照cDNA逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher公司)的操作步骤从总RNA中取Iug逆转录成cDNA。为了量化mRNA的表达，取等同于50ngRNA量的cDNA使用通用型荧光染料超混试剂盒(iTap? UniversalSYBR Green Supermix kit)在CFX96?实时PCR反应机上按照厂家提供的操作步骤进行聚合酶链反应。我们检测了衰老相关基因pl6INK4a，GAPDH作为内参基因。相关的转录水平按照如下公式计算:
X = 2_AACt, ΔΔ0? = ΔΕ-Δ0,ΔΕ = Ctexp-CtcAPDH, AC=Ctct1-CtGAPDH。
[0035]结果如图4所示，ECM大幅降低了各种浓度H2O2处理后UC-MSCs内pl6INK4a基因水平。
[0036]B.ECM对H2O2诱导的早衰干细胞内pl6INK4a蛋白含量变化的影响
75cm2培养瓶培养的细胞用胰酶消化后转移到1.5ml EP管中，高速离心后去除上清液，每管加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液ΙΟΟμΙ冰上裂解30分钟，高速离心后取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度。等量提取的蛋白在15%聚丙烯酰胺凝胶中变性和分离，然后由电泳转移到硝酸纤维素膜上，膜在PBS稀释过的ρ 16INK4a，a-tubul in抗体中4°C过夜孵育，接着膜在稀释的辣根过氧化物酶中继续孵育I小时，加入化学发光试剂盒后尽快曝光显影，使用Image J软件对目标蛋白量化。
[0037]结果如图5所示，ECM明显减少了H2O2诱导的早衰UC-MSCs内ρ16ΙΝΚ4α蛋白水平。
[0038]综上实验表明，ECM能明显减弱H2O2诱导的早衰UC-MSCs内SA-P-Gal活性，降低UC-MSCs内ROS含量，增加细胞进入S期比例，降低UC-MSCs内ρ 16皿4°基因及蛋白水平，有效缓解了 H2O2诱导的UC-MSCs早衰，在细胞移植治疗和再生医学等领域着广泛的应用前景。
【主权项】
1.一种抗细胞早衰的细胞外基质生物材料，其特征在于，是培养脐带间充质干细胞分泌的基质，可抗细胞的早衰。2.权利要求1所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤: I)将脐带间充质干细胞培养在完全培养基中，当细胞密度接近90%时，加入含有抗坏血酸的完全培养液培养7-10天； 2 )加入脱细胞液，构建得到细胞外基质生物材料。3.根据权利要求2所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞取自人源、猪源、鼠源或兔源。4.根据权利要求2所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述完全培养基为组分为α-ΜΕΜ 80?90%体积比，胎牛血清10?20%体积比，抗生素10?200U/mL05.根据权利要求2所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述完全培养液中抗坏血酸的浓度为100-200μΜ。6.根据权利要求2所述的抗细胞早衰的细胞外基质生物材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞液由ΡΗ7.4的磷酸盐缓冲液配制而成，含有Triton X-100 0.5-5%体积比和氨水10_40mMo7.权利要求1所述抗细胞早衰的细胞外基质生物材料在细胞移植、再生医学或者组织工程中的应用。8.权利要求1所述抗细胞早衰的细胞外基质生物材料在细胞培养中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将待培养细胞接种在所述抗细胞早衰的细胞外基质生物材料培养板中，在37°C、5% CO2环境下培养。10.权利要求1所述抗细胞早衰的细胞外基质生物材料在制备抗细胞衰老的化妆品、药品或者保健品中的应用。
【文档编号】A61L27/54GK105854084SQ201610202228
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】何帆, 周龙, 陈曦, 张文, 罗宗平, 杨惠林
【申请人】苏州大学附属第医院, 苏州大学附属第一医院