用于疫苗接种或免疫的化合物和方法

用于疫苗接种或免疫的化合物和方法
【专利摘要】本发明涉及一种疫苗接种或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化剂、抗原分子(例如疫苗组分)、和增强光化学内化(PCI)介导的疫苗接种效果的试剂，并用有效活化所述光敏化剂的波长的光进行照射，其中，所述试剂是本文定义的Toll样受体(TLR)的配体。本发明还涉及可用于所述方法的抗原组合物，例如疫苗组合物。本发明还提供了产生抗原呈递细胞的方法，所述抗原呈递细胞可用于产生免疫应答，例如用于疫苗接种，该方法涉及利用与上述相同的组分将抗原分子(例如疫苗组分)引入到细胞中以实现抗原呈递，和可用于所述方法的抗原组合物。本发明还提供了将利用所述方法体外产生的细胞用于对患者体内施用以引发免疫应答，例如实现疫苗接种。还提供了将抗原分子内化到细胞中的方法。
【专利说明】用于疫苗接种或免疫的化合物和方法
[0001] 本发明涉及一种疫苗接种或免疫的方法，所述方法涉及使用光敏化剂、抗原分子 (例如疫苗组分）、和增强光化学内化(PCI)介导的疫苗接种效果的试剂，并用有效活化所述 光敏化剂的波长的光进行照射，其中，所述试剂是本文定义的Toll样受体(TLR)的配体。本 发明还涉及可用于所述方法的抗原组合物，例如疫苗组合物。本发明还提供了产生抗原呈 递细胞的方法，所述抗原呈递细胞可用于产生免疫应答，例如用于疫苗接种，该方法涉及利 用与上述相同的组分将抗原分子(例如疫苗组分）引入到细胞中以实现抗原呈递，和可用于 所述方法的抗原组合物。本发明还提供了将利用所述方法体外产生的细胞用于对患者体内 施用以引发免疫应答，例如实现疫苗接种。还提供了将抗原分子内化到细胞中的方法。
[0002] 疫苗接种涉及施用抗原分子以激发免疫系统从而刺激发展对病原体的适应性免 疫。疫苗可预防或改善感染的发病率。疫苗接种是预防传染性疾病的最有效方法，由疫苗接 种引起的广泛免疫力是全球根除天花和世界上大部分地区限制如脊髓灰质炎、麻疹和破伤 风等疾病的主要原因。
[0003] 疫苗的活性剂可以是完整但失活(非感染性)或减毒(具有降低的感染性）的致病 病原体形式，或病原体的已发现具有免疫原性的纯化组分(例如，病毒外壳蛋白）。产生类毒 素以针对基于毒素的疾病进行免疫，如对破伤风的破伤风痉挛毒素进行修饰以去除其毒性 作用，但保留其免疫原性作用。
[0004] 由于大多数疫苗通过内吞作用被抗原呈递细胞摄取，通过核内体运输至溶酶体以 进行抗原消化，并经由MHC-II类途径呈递，疫苗接种主要激活CD4T辅助细胞和B细胞。为抗 击病症或疾病如癌症和细胞内感染，对细胞毒性CD8T-细胞应答的刺激是重要的。然而，细 胞毒性⑶8T细胞的诱导通常由于难以将抗原递送至胞浆和递送至抗原呈递的MHC I类途径 而失败。光化学内化(PCI)改善了分子向胞浆的递送，并且采用PCI的疫苗接种方法已知。 PCI是使用光敏化剂并结合可激活该试剂的照射步骤的技术，并且已知实现了将共同施用 于细胞的分子释放到胞浆。这种技术允许被细胞摄取到细胞器如核内体中的分子在照射时 从这些细胞器中释放到胞浆中。PCI提供了一种以不会导致广泛细胞的破坏或细胞死亡的 方式将不可透过膜(或透过性很差)的分子引入细胞的胞浆中的机制。
[0005] 光化学内化(PCI)的基本方法在W096/07432和W000/54802中有所描述，通过引用 将二者并入本文。在这样的方法中，需要内化的分子(其在本发明中是抗原分子)和光敏化 剂与细胞接触。光敏化剂和需要内化的分子摄取到细胞内的细胞膜包绕的亚区中，即，它们 被内吞到细胞内囊泡(例如溶酶体或核内体）中。在细胞暴露于适当波长的光时，所述光敏 化剂被激活，其直接或间接地产生破坏细胞内囊泡的膜的活性物质。这使得内化的分子被 释放到胞浆中。
[0006] 已经发现，按照这样的方法，大多数细胞的功能或活力并没有受到有害影响。因 此，提出了利用这种称为"光化学内化"的方法来将包括治疗剂在内的各种不同的分子输送 到胞浆，即到细胞的内部。
[0007] W000/54802利用这种常用方法来将传递分子呈递或表达在细胞表面上。因此，在 分子运输和释放到细胞胞浆中后，它（或该分子的一部分)可以被输送至细胞表面，在这里 它可以被呈递在细胞外侧，即，细胞的表面上。这种方法在疫苗接种领域特别有用，其中，疫 苗组分即抗原或免疫原可以被引入到细胞以呈递在细胞的表面上，从而诱导、促进或增强 免疫应答。
[0008] 虽然疫苗接种已经取得了一些值得注意的成功，但仍然需要替代的改进疫苗接种 方法。本发明解决了这一需求。
[0009] 本发明人惊讶地发现，有利的是，涉及利用光敏化剂、抗原分子(例如疫苗组分)和 本文限定的TLR配体并以有效活化所述光敏化剂的波长的光进行照射的方法产生了改善的 疫苗接种或改善的免疫应答。
[0010] 如将在下面的实施例更详细进行描述的那样，已经证实本发明的方法产生了改进 的疫苗接种或改进的免疫应答，例如，产生数量增加的抗原特异性T细胞。例如，图1表明，与 仅用抗原和光敏化剂治疗/照射相比，使用抗原、TLR配体(CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉）、光 敏化剂在小鼠体内疫苗接种，并用有效激活光敏化剂的波长的照射，导致小鼠血液和脾脏 中抗原特异性T细胞的百分比显著增加。在体内采用一系列其他TLR配体例如聚（1C)、咪喹 莫特和MPLA的实施例中，也表现出协同效应。因此，本发明人已证明，在体内使用本发明方 法中的多种TLR配体也可以实现免疫应答的协同改进。
[0011] 虽然不希望受理论的束缚，但据信本发明的方法导致在MHC I类分子的抗原呈递 提高，使得CD8+T细胞应答增加，因而改善了疫苗接种方法。如下面所讨论，本申请一些实施 例利用〇T-1细胞的模型系统，该系统用于评估MHC I类呈递（参见例如De 1 amarre等 J.Exp.Med. 198:111-122，2003)。在该模型系统中，抗原表位SIINFEKL的MHC I类呈递导致 0T-1T细胞活化，并且所述活化可通过抗原特异性T细胞的增殖的增加或者IFNy或IL-2的 产量的增加来测定。本发明方法的结果显示抗原特异性T细胞的数量增加，以及由T细胞产 生的IL-2和IFNy增加，这与增加或改善的抗原呈递相关。
[0012] 因此，在本发明的第一方面，提供了一种在细胞的表面上表达抗原分子或其一部 分的方法，所述方法包括使所述细胞接触所述抗原分子、光敏化剂、和TLR配体，并用有效活 化所述光敏化剂的波长的光照射所述细胞，其中，所述抗原分子释放到所述细胞的胞浆中， 并且所述抗原分子或其一部分随后呈递在所述细胞表面上。
[0013]优选的是，该方法（以及之后描述的方法)仅利用所述方法中的上述三种活性成分 (试剂），并且所述试剂在该方法中以适当水平(例如，下述的最小水平)存在，从而可影响本 发明的效果（即，在增强PCI疫苗接种/抗原呈递/免疫应答刺激中有积极作用）。因此，优选 的是所述试剂存在于不具有其他活性成分的缓冲液中。
[0014] 在所述方法中，所述抗原分子和所述光敏化剂以及可选的本文所述的TLR配体各 自被摄取至胞内囊泡中；当照射细胞时，胞内囊泡的膜破裂，将抗原分子释放到所述细胞的 胞浆中。
[0015] 各种试剂可以相对于彼此被摄取至相同或不同的胞内囊泡中。已经发现，由光敏 化剂产生的活性物质可延伸到包含该光敏化剂的囊泡外，和/或囊泡可融合从而使囊泡内 容物通过与破裂的囊泡融合而释放。在本文中提到的"摄取"表示所摄取的分子被完全包含 在囊泡内。胞内囊泡由膜包绕，并且可以是在内吞后形成的任何这类囊泡，例如核内体或溶 酶体。
[0016] 本文中所用的"破裂的"区室是指对该区室的膜的完整性永久或临时的破坏，该破 坏足以使其中容有的抗原分子释放。
[0017] 本文中所用的"光敏化剂"是能够在所述试剂受适当波长和强度的照射后活化而 产生活性物质时，将吸收的光能转化为化学反应的化合物。这些过程的高反应性终产物可 产生细胞毒性和血管毒性。方便的是，所述光敏化剂可以是定位到细胞内区室、特别是核内 体或溶酶体的光敏化剂。
[0018] 光敏化剂可以通过许多机制直接或间接地发挥其作用。因此，例如，某些光敏化剂 在通过光活化时直接变为有毒，而另一些光敏化剂起到产生毒性物种的作用，所述毒性物 种例如为氧化剂，如单线态氧或其他反应性氧物质，它们对于如脂质、蛋白和核酸等细胞物 质和生物分子破坏性极强。
[0019] 多种所述光敏化剂是本领域中已知的，在文献(包括W096/07432,通过引用将其并 入本文）中所有描述，并且可用于本发明的方法。存在许多已知光敏化剂，包括卟啉、酞菁、 红紫素、二氢卟吩、苯并卟啉、亲溶酶体(lysomotropic)弱碱、萘酞菁、阳离子染料和四环素 或它们的衍生物（Berg等，（1997)，J.Photochemistry and Photobiology ,65,403-409)。其 他光敏化剂包括特沙弗林、脱镁叶绿酸(pheophorbides)、类卟吩(porphycenes)、菌绿素 (bacteriochlorin)、酮绿素类(ketochlorins)、血卟啉衍生物和5-氨基乙酰丙酸及其衍生 物诱导的内源性光敏剂、光卟啉、光敏化剂二聚体或其他偶联物。
[0020] 卟啉是最广泛研究的光敏化剂。其分子结构包括通过次甲基桥连接在一起的四个 吡咯环。它们是经常能够形成金属络合物的天然化合物。例如，在氧转运蛋白血红素的情形 中，铁原子被引入血红素B的卟啉核中。
[0021] 二氢卟吩是大的杂环芳香环，其核心处由通过四个次甲基键偶联的三个吡咯和一 个吡咯啉构成。因此，不像卟啉，二氢卟吩在很大程度上是芳香性的，但不是在整个环呈现 出芳香性。
[0022] 本领域技术人员可理解哪种光敏化剂适合用于本发明。特别优选的是定位到细胞 核内体或溶酶体的光敏化剂。因此，光敏化剂优选是被摄取到溶酶体或核内体的内区室中 的试剂。优选的是，光敏化剂通过内吞摄取到细胞内区室中。优选的光敏化剂是二磺化酞菁 铝和四磺化酞菁铝（例如AlPcS 2a)、磺化四苯基卟啉（TPPSn)、磺化四苯基菌绿素（例如 IPBS2a)、尼罗河蓝、二氢卟吩e 6衍生物、尿卟啉I、叶赤素、血卟啉和亚甲基蓝。可用于本发明 的其他合适的光敏剂在W003/020309(通过引用将其并入本文）中有所描述，即，磺化间四苯 基二氢卟吩，优选TPCS 2a。优选的光敏化剂是两亲性光敏化剂(例如二磺化光敏化剂），如两 亲性酞菁、扑啉、二氢卟吩和/或菌绿素，特别包括TPPS 2a(二磺酸四苯基卟啉）、AlPcS2a(二 磺酸酞菁铝）、TPCS2a(二磺酸四苯基二氢卟吩）和TPBS 2a(二磺酸四苯基菌绿素）、或其药学 可接受的盐。此外，还优选亲水性光敏化剂，例如TPPS4(四磺酸间四苯基卟啉）。特别优选的 光敏化剂是磺化酞菁铝、磺化四苯基卟啉、磺化四苯基二氢卟吩和磺化四苯基菌绿素，优选 TPCS 2a、AlPcS2a、TPPS4和TPBS2a。在本发明特别优选的实施方式中，光敏化剂是二氢卟吩 TPCS 2a (二磺化四苯基二氢卟吩，例如Amphinex ?)。
[0023] 光敏化剂可与载剂连接，从而提供光敏化剂。因此，在本发明该实施方式的优选的 方面，所述光敏化剂是光敏化剂和式(I)限定的壳聚糖的缀合物：
[0025]其中，
[0026] n是大于或等于3的整数；
[0027] R在所述化合物中出现n次，并且
[0028] 所述总的Rn基团的0.1 %~99.9% (优选0.5%~99.5% )中，各R是选自以下的基 团A:
[0030] 其中，各Ri可以相同或不同，选自H、CH3和-(CH2)b-CH 3;a是1、2、3、4或5;并且b是0、 1、2、3、4或5(其中反荷离子可以为例如CD;优选的是办是?并且b是1，
[0031] 和
[0033] 其中，Y为0、S、S02、-NCH3 或，(〇12)<]〇13;0 = 1、2、3、4或5;并且(1=1、2、3、4或5，优选 Y是NCH3并且c是1，
[0034] 其中，各R基团可以相同或不同，并且
[0035] 所述总的Rn基团的0.1 %~99.9% (优选0.5%~99.5% )中，各R是选自以下的基 团B:
，和
[0037] 其中，
[0038] e是〇、1、2、3、4或 5;并且f是1、2、3、4或 5;优选e 和f = l，
[0039] R2是选自以下的基团 和
[0041 ] W是选自0、S、NH或N(CH3)的基团，优选是NH，
[0042] R3是选自以下的基团
[0045] V是选自C0、S02、P0、P02H或CH2的基团，优选的是C0，和
[0046] R4是选自 H、-OH、-0CH3、-CH3、-COCH3、C (CH3) 4、-NH2，-NHCH3、-N (CH3) 2 和-NC0CH3、优 选H的基团（取代在邻、间或对位），其可以相同或不同，其中，各R基团可以相同或不同。 [0047] 壳聚糖聚合物具有至少3个单元(n = 3)。然而，优选n是至少10、20、50、100、500、 1000,例如10至100或10至50。
[0048]在优选的实施方式中，R2选自
[0050]在另一优选的实施方式中，R3选自
[0052] 优选的是 R2 或 R3 是 TPPa、TPCalSTPCcl。
[0053] 基团A可提供70至95%的总Rn基团，基团B可提供5至30%的总Rn基团。
[0054]在最优选的实施方式中，光敏化剂和壳聚糖的缀合物选自（见图4中示意图1-5B的 编号）：
[0055] 17:B:25% ,A:75%
[0057] 19:B:25% ,A:75%
[0063] 在上述结构中，所给出的A/B%值是指基团A或B占 Rn基团的比例。星号表示壳聚糖 聚合物的其余部分。
[0064] 这些化合物可通过利用本领域标准程序的合成方法制备，本领域技术人员对此熟 悉。例如，编号17、19、33和37的下述优选缀合物的合成如图4的反应示意图1-5B所示(并且 还见图4说明）。
[0065] 本文所使用的"抗原"分子是这样的分子，其中当以适当方式提呈至免疫系统或免 疫细胞时，该分子或其一部分能够刺激免疫应答。因此有利的是，所述抗原分子将成为疫苗 抗原或疫苗组分，如含有多肽的实体。
[0066] 许多这种抗原或抗原疫苗组分在本领域中是已知的，并包括所有方式的细菌或病 毒抗原，或者实际上任何致病菌种(包括原生动物或高等生物体）的抗原或抗原组分。虽然 传统上疫苗的抗原组分已包括整个生物体(无论是活的、死的还是减毒的），即全细胞疫苗， 但是除此以外，亚基疫苗（sub-unit vaccine)，即，基于生物体的特定抗原组分(例如蛋白 或肽，甚至碳水化合物)的疫苗已被广泛研究并报道在文献中。任何此类基于"亚基"的疫苗 组分均可以用作根据本发明的抗原分子。
[0067] 然而，本发明特别可用在肽疫苗领域中。因此，根据本发明的优选抗原分子是肽 (其如本文中所限定，包括长度较短和较长的肽，即，肽、寡肽或多肽，以及蛋白分子或其片 段，例如，5~500、例如10~250、如15~75或8~25个氨基酸的肽）。
[0068]非常大量的肽疫苗候选物已在文献中提出，例如在病毒性疾病和感染，如AIDS/ HIV感染或流感、犬细小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治疗中（参见例如Phanuphak等， Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshil994, 69(4) ,811-20;Casal 等，J.Virol.，1995,69(11)，7274-7;Belyakov等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4)，1709-14;Naruse等，Proc.Natl.Sci.USA,1994 91 (20)，9588-92;Kabeya等，Vaccine 1996, 14(12)，1118_22;Itoh等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986,83(23)9174-8)。类似地，可以使用细菌肽，事实上也可以 使用源于其他生物体或物种的肽抗原。
[0069] 除源于病原微生物的抗原之外，肽也已被提出用作针对癌症或如多发性硬化症等 其他疾病的疫苗。例如，突变癌基因肽非常有希望成为在细胞毒性T淋巴细胞的刺激方面充 当抗原的癌症疫苗（Schirrmacher，Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers ,1997,17,316-327)。合成肽疫苗用于转移性黑色素瘤的治疗也已得到评价 (Rosenberg等，Nat .Med. 1998，4(3)，321-7)。用于多发性硬化症的治疗的T细胞受体肽疫苗 描述于Wilson等，J.Neuroimmunol ? 1997,76(1-2)，15-28中。任何此类肽疫苗组分均可以用 作本发明的抗原分子，事实上因为文献中描述或提出作为肽疫苗的任何肽也可以。肽因此 可以是合成的或分离的肽，或者是源于生物体。
[0070] 本发明优选的实施方式中，抗原是黑色素瘤抗原。"黑色素瘤抗原"可包括一种或 多种不同的抗原。
[0071] 例如，在一方面，黑色素瘤抗原是黑色素瘤蛋白或肽，例如抗原肽或T-细胞表位， 例如选自gpl〇〇、Melan-A、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)中的一 种或多种或其肽表位。这些和其他合适的黑色素瘤抗原在Renkvist等，Cancer Immunol. Immunother ? 50: 3-15，2001 (及其中的参考文献）和Hodi，Clin ? Cancer ? Res ? 12: 673-678，2006中有所公开，将它们通过引用并入本文。特别是，gplOO、Melan-2、酪氨酸酶、 MAGE-1、MAGE-3和TRP-2及其肽表位在Renkvi st等（同上）中有所描述。因此，本发明外延至 gp100 、Melan-2、酪氨酸酶、MAGE-l、MAGE-3或TRP-2,或包括它们经公开的肽表位或由这些 肽表位组成的抗原（公开于Renkvist等，同上），或与其具有至少95%序列同一性(利用本领 域一致的标准比较技术，在相关比较窗口中）的序列的应用。优选的实施方式中，抗原是 TRP-2 和/或 gp 100，优选TRP-2。
[0072] 肽抗原，例如长达至少200个氨基酸的肽抗原，可获自进行定制肽合成的公司，例 如United BioSystems Inc(前United peptide Corp ?，Herndon，VA，美国）。
[0073] 在替代性优选的实施方式中，抗原分子源自人乳头瘤病毒(HPV)。乳头瘤病毒基因 组分为早期区域(E)和晚期区域(L)，早期区域(E)编码6个化^244』546和￡7)开放阅读 框(0RF)，它们在最初感染宿主细胞后即刻表达;晚期区域(L)编码主要衣壳蛋白L1和次要 衣壳蛋白L2。所有病毒0RF编码在一个DNA链中。
[0074] 在优选的实施方式中，抗原分子包括蛋白或肽、或其片段，即，来自人乳头瘤病毒 (HPV)的抗原(例如，源自所述病毒），其优选是本文所述的早期或晚期蛋白中的一种或其一 部分。因此，HPV抗原可以是一种或多种已知抗原肽或T-细胞表位，例如选自任何类型HPV的 一种或多种任何已知抗原。HPV类型和抗原的具体情况可见于Ma等，Current Cancer Therapy Reviews 6:81-103,2010〇
[0075] 例如，抗原肽可源自HPV-16和/或HPV-18型HPV或31型或45型HPV。例如，抗原可源 自任何￡1、￡2、￡445、￡6或￡7蛋白或任何11和12蛋白。抗原肽可源自冊￥-16和18的￡2、￡6和 E7蛋白中的一种或多种。在优选的实施方式中，抗原分子包含HPV-16E7序列GQAEPD RAHYMIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗体字表示）。因此，HPV抗原可以是35个 氨基酸的肽。作为另选，抗原分子可仅为CD8表位RAHYNIVTF，即更短的肽。
[0076] HPV肽抗原可获自进行定制肽合成的公司，例如United BioSystems Inc(前 United peptide Corp ?，Herndon，VA,美国）。
[0077] -旦通过光化学内化法释放在细胞胞衆中，抗原分子可以通过细胞的抗原加工机 构而加工。因此，根据本发明表达或呈递在细胞表面上的抗原分子可以是被内化(胞吞）的 抗原分子的部分或片段。所呈递或表达的抗原分子的"一部分"优选包括通过细胞内的抗原 加工机构产生的部分。然而，所述部分也可以通过其他方式(通过适当的抗原设计实现，例 如pH敏感的键)或通过其他细胞加工方式产生。通常，所述部分的尺寸足以产生免疫应答， 例如在大于5个、例如大于10或20个氨基酸的肽的情形中。
[0078] 本发明增强PCI介导的疫苗接种的试剂是Toll样受体(TLR)的配体。Toll样受体是 在先天免疫系统以及消化系统中起关键作用的一类蛋白。TLR和白细胞介素-1受体形成受 体超家族，命名为白细胞介素-1受体/Toll样受体超家族。这个家族的所有成员具有Toll-IL-1受体结构域(TIR)。白细胞介素-1受体(IL-1R)家族的成员特征为细胞外免疫球蛋白样 域和细胞内Toll/白细胞介素-IR(TIR)域。具有亚族2TIR域的受体被视为TLR。
[0079] TLR是单一跨膜的非催化性的受体，通常表达在前哨细胞如巨噬细胞和树突细胞 中，这些细胞识别来自微生物的结构保守分子。一旦这些微生物突破如皮肤或肠道粘膜等 物理屏障，它们就被Toll样受体识别，从而激活免疫细胞反应。这些受体识别如病原相关分 子等分子，所述分子据信对病原体的功能至关重要且难以通过突变改变。它们可包括:细菌 细胞表面脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂肽和脂阿拉伯甘露糖；蛋白，如来自细菌鞭毛的鞭毛蛋 白；病毒的双链RNA;或细菌和病毒DNA的未甲基化CpG岛；和在真核DNA的启动子中发现的 CpG岛；以及某些其它RNA和DNA分子。对于大多数TLR，配体识别特异性现已通过基因靶向确 立。
[0080] 据估计，大多数哺乳动物物种具有10到15种类型的Toll样受体。人和小鼠中一共 鉴定出13种TLR(简称TLR1至TLR13)(小鼠中13种，人中10种）。
[0081] 本发明涵盖了 TLR的所有配体。术语〃配体〃用于表示与生物分子形成复合物以达 到生物学目的的物质。在TLR配体的情况中，其为信号触发分子，与靶标TLR上的位点结合。 当配体与其同源受体结合，其改变受体的化学构象。受体蛋白的构象状态决定其功能状态。 [0082]因此，本发明的TLR配体是结合至少一种、或一种或多种toll样受体(TLR)并导致 TLR活化、例如TLR介导的细胞信号传导活化的分子。
[0083] TLR信号传导分为两种不同信号传导途径，MyD88依赖的途径和TRIF依赖的途径。 本发明TLR配体激活所述两种途径中的一种或两种。因此，本发明的配体是结合一种或多种 TLR并活化TLR的分子，例如通过配体结合导致受体构象改变来激活TLR信号传导。
[0084] MyD88依赖性响应在TLR受体二聚化时发生，并且由除TLR3之外的每种TLR利用。它 的主要作用是活化NFkB和丝裂原活化蛋白激酶。受体中发生的配体结合和构象变化募集接 头蛋白MyD88，其是TIR家庭成员。MyD88然后募集IRAK4、IRAK和IRAK2。IRAK激酶然后使蛋白 TRAF6磷酸化并活化，该蛋白进而将蛋白TAK1及其本身多泛素化，从而促进与IKKP结合。在 结合时，TAK1使IKKP磷酸化，然后IKKP使IKB磷酸化导致其降解，并允许NFKB扩散到细胞核 中，激活转录，并随后诱导炎性细胞因子。
[0085] 另一途径是TRIF依赖的途径，其被TLR3和TLR4采用。对于TLR3,双链RNA(或类似 的，见下文)导致受体激活，募集接头蛋白TRIFJRIF激活激酶TBK1和RIP1，这会在信号传导 通路中产生支路。TRIF/TBK1信号传导复合物将IRF3磷酸化，允许其移位至细胞核中，并产 生I型干扰素。同时，RIP1的激活以与MyD88-依赖的途径相同的方式，导致TAK1的泛素化和 活化和NFkB转录。
[0086]用于确定TLR信号传导的激活的标准方法在本领域中是公知的，例如确定适当的 信号传导蛋白的磷酸化状态。作为另选，可以通过本领域中公知的方法确定配体是否通过 TLR起作用，例如通过基因删除编码特定TLR的基因，并确定配体的作用是否被保留。这种方 法可以用于体外和转基因敲除小鼠体内，转基因敲除小鼠可商购(TLR2、3和4敲除体可获自 The Jackson Laboratory，TLR1、2、3、4、5、6、7和9敲除体可获自 OrientalBioService Inc)。此外，可用的有HEK-Blue?细胞（Invivogen，San Diego，CA，美国），所述细胞被设计为 通过测定NF-kB/API活化而研究TLR的刺激。可获得用于TLR2-9和13的这种细胞。另外，TLR 诘抗剂，例如那些可从Invi vogen获得的TLR诘抗剂可用于确定TLR的诘抗作用是否抑制推 定配体的作用。因此，确定分子是否是TLR配体、例如特定TLR配体的方法是本领域中公知 的。
[0087] TLR的结构由富含亮氨酸重复序列（LRR)胞外结构域、螺旋跨膜结构域和细胞内 Toll/IL-1受体同源(TIR)信号传导结构域构成。胞外结构域含有不同数量的LRR并类似于 弯曲成马蹄铁形的螺线管。在两端存在遮蔽马蹄铁体的疏水核心的末端LRR。这些胞外结构 域是高度可变的。它们直接参与识别多种病原体相关基序，包括脂多糖、脂肽、胞嘧啶-磷 酸-鸟嘌呤(CpG)DNA、鞭毛蛋白、咪唑并喹啉、和ds/ssRNA。当受体活化后，TIR信号传导复合 物在受体和接头蛋白TIR域之间形成。
[0088]受体TLR7、8和9是具有比其他TLR更长的氨基酸序列的家族。它们定位细胞内并响 应于非自身的核酸而发出信号。它们也在其LRR14和15之间包含不规则链段。
[0089] TLR受体的序列是已知的，并且可按照例如前文所述评价本文中所描述配体对受 体的结合。例如，已知的TLR氨基酸序列示于下表1中。
[0090] 表 1
[0091]
[0092] TLR1是细胞表面受体，其配体包括脂蛋白和多种三酰脂肽，例如来自细菌的那些。 TLR1自身不识别配体，而是以与TLR2形成的复合物起作用。因此，配体识别TLR1与TLR2的复 合物。TLR1识别与TLR2(作为异源二聚体)组合的肽聚糖和(三酰基)脂蛋白。
[0093] 脂蛋白/肽是由与蛋白/肽连接的脂质构成的分子。细菌表达这种分子。三酰基脂 蛋白/肽包括3个酰基。优选的是，用于本发明的TLR1配体是三酰脂肽。
[0094] TLR1 配体可购自 Invivogen或Enzo Life Sciences(Farmingdale，NY，美国）。例 如，Pam3CSK4(InViV〇gen)是合成的三酰基脂肽(LP)，其模拟了细菌LP的酰基化氨基端。 [00 95]作为另选，可使用Pam3Cys-Ser_(Lys)4三盐酸盐（Enzo Life Sciences)，其是与 TLR2复合的TLR1的选择性激动剂。
[0096] TLR2是被各种各样的微生物分子刺激的细胞表面受体，所述微生物分子代表了革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及支原体和酵母的广泛物种群。TLR2识别革兰氏阳性菌的细 胞壁组分如肽聚糖、脂磷壁酸和脂蛋白、分枝杆菌的脂阿拉伯甘露糖和酵母细胞壁的酵母 聚糖。
[0097] 优选的TLR2配体为脂聚糖，如脂阿拉伯甘露糖和耻垢分枝杆菌的脂甘露聚糖。特 别优选的脂聚糖是具有对TLR2特异性的脂多糖(LPS)。这些分子具有通过共价键连接的脂 质和多糖，且见于革兰氏阴性菌的外构件中，并充当内毒素。在优选特征中，LPS来自牙龈卟 啉菌。LPS由通过称为脂质A的特定糖脂部分锚定在外细菌膜中的多糖区域构成。脂质A也是 内毒素，其引起LPS的免疫刺激活性。
[0099] (Lipid A =脂质A;〇-antigen = 〇-抗原；repeat 40units =重复40个单元；Core poly saccharide =核心多糖；Di saccharide diphosphate =二磷酉爱二糖；Fatty acids =月旨 肪酸）
[0100] 脂质A的最具活性形式含有6个脂肪酰基，并存在于病原菌如埃希氏大肠杆菌和沙 门氏菌中。
[0101 ]其他优选的TLR2配体有:脂磷壁酸，例如，源自诸如枯草杆菌和金黄色葡萄球菌等 不同细菌属的脂磷壁酸;肽聚糖，例如源自诸如枯草杆菌、埃希氏大肠杆菌菌株(例如0111: B4或K12)、金黄色葡萄球菌等等细菌属的肽聚糖;合成脂蛋白，如合成二酰基化脂蛋白或合 成三酰基化脂蛋白；和酵母聚糖(例如来自酿酒酵母），其为重复葡萄糖单元由0-1，3_糖苷 键连接的葡聚糖。TLR2配体可商购自Invivogen。
[0102] TLR3见于细胞区室中。本发明优选的配体为模拟病毒dsRNA的双链RNA分子，例如 聚腺苷酸-聚尿苷酸(P〇ly(A:U))或聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))。特别优选Poly(I:C)。
[0103] 双链RNA(dsRNA)是具有互补双链的RNA，与所有细胞中发现的DNA相似。dsRNA形成 某些病毒(双链RNA病毒）的遗传物质。双链RNA如病毒RNA或siRNA可触发真核细胞中的RNA 干扰，以及脊椎动物中的干扰素应答。
[0104] 在优选的特征中，配体是Poly^ChPoly I:C是一条链为肌苷酸聚合物、另一条 链为胞苷酸聚合物的错配双链RNA。这种分子可通过公知技术制备。存在各种商购来源，例 如可购自Invivogen的以下物质，并形成优选的实施方式：
[0105] -Poly(I:C)(HMW)，具有高分子量，平均尺寸为1.5kb_8kb，和
[0106] -Poly(I:C)(LMW)，具有低分子量，平均尺寸为0.2kb_lkb。
[0107] 高分子量和低分子量形式均是用于本发明的优选形式。
[0108] TLR4也存在于细胞表面，并具有数种配体类型，尤其包括脂多糖(LPS)、数种热休 克蛋白、纤维蛋白原、硫酸肝素片段、透明质酸片段、镍和各种阿片类药物。在一个优选方 面，配体是LPS1PS可源自各种细菌物种，例如埃希氏大肠杆菌0111:B4或K12或沙门氏菌 (通过酚-水混合物提取），在优选的特征中，LPS源自埃希氏大肠杆菌或明尼苏达沙门氏菌， 例如菌株R595。在另一优选的方面，TLR4配体是单磷酰脂A(MPLA)，其可从细菌(例如明尼苏 达沙门氏菌R595)中分离或通过合成制备。通常，TLR4配体可商购自例如Invi vogen。
[0109] TLR5结合来自革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌的配体鞭毛蛋白，如枯草杆菌、铜绿 假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌等。鞭毛蛋白是球状蛋白，将其自身排列为空心圆筒从而形成 细菌鞭毛中的细丝。其具有约30,000至60,000道尔顿的质量。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要 取代物，大量存在于几乎所有有鞭毛的细菌中。因此，优选的TLR5配体是鞭毛蛋白，优选来 自如上所述的细菌。TLR5配体可商购自例如Invivogen。
[0110] TLR6结合多种二酰脂肽。如上所述，脂肽存在于细菌中，并包含与肽连接的脂质。 二酰脂肽具有2个酰基，并形成用于本发明的优选TLR6配体。TLR6配体可商购自Invivogen。 例如，FSL-l(Pam2CGDPKHPKSF)是来自唾液支原体的与MALP-2相似的合成脂蛋白，MALP-2是 源自发酵支原体的脂肽(LP)。支原体LP(如FSL-1)含有二酰基化的半胱氨酸残基，而细菌LP 含有三酰基化的半胱氨酸残基。FSL-1被TLR6与TLR2的组合识别，而细菌LP被TLR2和TLR1的 组合识别。
[0111] TLR7配体包括小的合成化合物咪唑并喹啉、如腺嘌呤和鸟苷类似物（例如洛索立 宾)等碱基类似物和溴匹立明，以及单链RNA。
[0112]咪唑并喹啉化合物是双环有机分子，优选具有下式，其中办和此处的基团可变。 [0113]优选的是，咪唑并喹啉化合物具有式1或其药学可接受的盐：
[0115] 其中，是氨基烷基，其可选地取代有例如羟基，并且R2是烷基，且可选地间插有氧 或氮基团；其中，优选的是
[0116] 办是^012-(：(013)2-1?3;
[0117] R2 是-CH2-X-CH2CH3 或氢原子；
[0118] R3是0H或氢原子，并且X是0或NH。
[0119] 上式中，烷基可以为基团。
[0120]这些化合物的实例在本领域中已知，例如雷西莫特(或R848)(l-[4-氨基_2_(乙氧 基甲基)咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇）、咪喹莫特(3-(2_甲基丙基)-3,5,8_ 三氮杂三环[7.4.9.0 2'6]十三碳-1(9)，2(6)，4,7，10，12-己烷-7-胺）和嘎德莫特(1?1是1 CH2-C (CH3) 2〇H; R2是-CH2-NH-CH2CH3; 1 - [ 4-氨基-2-(乙基氨基甲基）咪唑并[4，5-C ]喹啉-1 -基]-2-甲基丙-2-醇）（均可获自InvivoGen(San Diego CA,美国））。在优选的实施方式中， 化合物选自雷西莫特和咪喹莫特。
[0121] 这些化合物的药学可接受盐也涵盖在本发明中。合适的盐包括例如乙酸盐、溴盐、 氯盐、柠檬酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、油酸盐、 硬脂酸盐、甲苯磺酸盐、钙盐、葡甲胺盐、钾盐和钠盐。
[0122] 洛索立宾是在N7和C8位衍生化的鸟苷类似物。这种核苷是免疫系统的非常强力的 刺激剂。
[0123] 溴匹立明是具有抗癌和抗病毒性质的试验药物，结构如下所示：
[0125] 单链RNA是优选的TLR7配体，例如ssPolyU，其中，优选的是所述单链分子长度为20 至200个核苷酸。所述分子容易通过合成制备。
[0126] TLR8配体是通常较小的合成化合物或单链RNA。优选的是所述TLR8配体是上述 ssPolyU 分子。
[0127] TLR9配体包括未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸DNAXpG〃寡核苷酸（或CpG 0DN)是所 述配体的实例，是胞嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(〃C〃)与鸟嘌呤三磷酸脱氧核苷酸(〃G〃)结合形 成的短单链合成DNA分子。〃p〃是指连续核苷酸之间的磷酸二酯键，不过某些0DN作为替代具 有经修饰的硫代磷酸酯(PS)骨架。如本文所指代，CpG核苷酸称为CpG基序。CpG基序未被甲 基化。包含CpG基序的序列被认为是病原体相关的分子模式(PAMP)，这是因为它们大量存在 于微生物基因组中，但在脊椎动物基因组中极少。CpG PAMP被模式识别受体(PRR)To 11样受 体9(TLR9)识别。TLR9识别特定的将微生物DNA与哺乳动物DNA区分开的非甲基化CpG寡核苷 酸(0DN)序列。
[0128] 已经描述了三种主要类型的刺激性0DN:A型、B型和C型。A型CPG 0DN由混合的磷酸 二酯/硫代磷酸酯骨架构成，并含有一种或多种CpG基序作为回文序列的一部分。A型CPG 0DN具有位于3'和5'端的poly G尾部(促进串联体(concatemer)形成的结构基序）j型CPG 0DN通常在一端或两端含有7至10个硫代磷酸酯修饰的碱基，抵抗核酸酶的降解，并提高0DN 的稳定性。例如，内部回文序列长度可以为8至16(优选的是10、12或14)个碱基对并在碱基 顺序上有变化，然而，优选的模式5'-0 Pu CG Pu:泛CG Py Py-3'，其中，与回文中心（以 ":"标示)等距离的碱基Pu、Py互补。在DNA链任一末端的poly G尾部的长度可变。
[0129] B型CPG 0DN可具有一种或多种包含CpG基序的6聚体共有序列。人共有序列可包含 序列5'-Pu Py C G Py Pu-3'（小鼠序列可以不同型CPG 0DN具有完全硫代磷酸酯化(PS 修饰)的骨架，通常长度为18至28(例如18-22)个核苷酸。B型CPG 0DN的实例是0DN 1826,其 具有序列5 ' -tccatgacgttcctgacgtt-3 '。
[0130] C型CPG 0DN结合了A型和B型的特征。C型CPG 0DN完全由硫代磷酸酯核苷酸构成， 并含有包含一种或多种CpG基序的回文序列。C型CpG 0DN的实例是0DN 2395,具有序列5'- tcgtcgttttcggcgc: gcgccg-3 '（下划线为回文序列）。
[0131] 另外，还可以使用含有两个回文序列的P型CpG 0DN，从而使它们形成更高级的结 构。
[0132] CpG寡核苷酸可通过本领域已知的标准寡核苷酸合成方法来合成。
[0133] 因此，本发明的CpG寡核苷酸外延为6个至50个碱基(优选18个至27个、优选20个至 25个碱基）的单链寡核苷酸，，其包含至少一个CpG基序和各处在所述基序3 '和5 '侧的至少 一个碱基，其中，所述CpG基序是胞嘧啶和其后以磷酸酯或硫代磷酸酯键连接的鸟嘌呤，其 中胞嘧啶的嘧啶环未被甲基化。在一个实施方式中，一个或多个基序侧翼是与所述一个或 多个基序共同形成回文序列的序列。如本文所用的〃回文序列〃是指正向序列与反向的互补 序列连接，从而使该序列可形成发夹，例如 CggCgC:gCgCCg(其中，回文的中心以〃：〃标示）。 CpG基序可形成序列的中心和/或位于回文序列中的其他部位。优选的是，回文序列(包括正 向和反向序列）长度为8至16、优选10至12或10至14个碱基。
[0134] 在另一优选的方面，CpG寡核苷酸序列包含回文序列5'_Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3'（其中，与回文中心（以":"标示)等距离的碱基Pu、Py互补)和/或一个或多个共有序列 5'-Pu Py CG Py Pu-3'。可选地，CpG寡核苷酸可含有长度为3至8个碱基的位于3'或5'末端 的poly G尾部。
[0135] 在本发明的优选的实施方式中，CpG寡核苷酸是18-27个碱基的C型CPG 0DN，其具 有10-14个碱基的回文序列和硫代磷酸酯骨架。特别优选的是具有下述序列的0DN 2395:
[0136] 5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg_3'（下划线为回文序列）。
[0137] 在本发明的替代性优选的实施方式中，CpG寡核苷酸是具有18-22个碱基和硫代磷 酸酯骨架的B型CPG 0DN。特别优选的是具有下述序列的0DN 1826:
[0138] 57-tccatgacgttcctgacgtt-37 〇
[0139] TLR11和TLR12配体包括抑制蛋白（profilin)，抑制蛋白是参与肌动蛋白细胞骨架 的动态翻转和重构的肌动蛋白结合蛋白。因此，优选的TLR11/12配体是来自弓形虫的抑制 蛋白，弓形虫是引起弓形虫病的专性细胞内寄生原虫。抑制蛋白可购自例如Enzo Life Sciences。
[0140] TLR13配体包括细菌核糖体RNA序列"CGGAAAGACC"，包含该核苷酸序列的核酸与该 配体构成本发明的一个优选方面。序列为5 '-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3 '的寡核苷酸是TLR13 配体，可购自例如Invivogen。
[0141] 因此，优选所述TLR配体是TLR2、3、4、7、8或9配体，优选如上所述的配体。在优选的 实施方式中，TLR配体是TLR3配体，优选如上所述。在替代性的优选实施方式中，TLR配体是 TLR4配体，优选如上所述。在另一替代性的优选实施方式中，TLR配体是TLR7~9配体、或 TLR7配体、或TLR8配体或TLR9配体，优选如上所述。
[0142] 此处所用的"表达"或"呈递"是指抗原分子或其一部分提呈在所述细胞表面上，其 使得该分子的一部分暴露于细胞周围的环境并与其互通，优选使得可对所呈递的分子或其 一部分产生免疫应答。在"表面"上的表达可以如此实现，其中拟表达的分子与细胞膜和/或 可存在于该膜中或可致使存在于该膜中的组分接触。
[0143] 本文中使用的术语"细胞"包括所有真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞）。因此， 代表性"细胞"包括所有种类的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞 和原生动物。但是，优选的是，所述细胞为哺乳动物细胞，例如来自猫、狗、马、驴、绵羊、猪、 山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的细胞，但最优选的是来自人的细胞。进行本发明方法、应用 等的细胞可以是能够在表面上表达或呈递被施用或运输到其胞浆中的分子的任何细胞。
[0144] 所述细胞通常为免疫细胞，即，参与免疫应答的细胞。然而，其他细胞也可以将抗 原呈递至免疫系统，因此这些细胞也落入本发明的范围。本发明的细胞因此有利地是下文 所述的抗原呈递细胞。抗原呈递细胞可参与本文所述的免疫应答的任何方面或"臂(arm)"。
[0145] 细胞毒性细胞的刺激需要抗原呈递至将被抗原呈递细胞以特定方式刺激的细胞， 例如MHC I类呈递(例如，CD8+细胞毒性T细胞的激活需要MHC-1抗原呈递）。产生抗体的细胞 还可以被抗原呈递细胞的抗原呈递所刺激。
[0146] 抗原还可以被抗原呈递细胞通过内吞来摄取，并在内吞囊泡中降解为肽。这些肽 可结合核内体中的MHC II类分子，并运输至细胞表面，在那里肽-MHC II类复合物可被⑶4+ T辅助细胞识别，并诱导免疫应答。作为另选，胞浆中的蛋白可被降解，例如被蛋白酶体降 解，并通过ATP(与抗原呈递相关的转运子)运输至内质网，在那里肽可结合MHC I类分子，并 运输至细胞表面(Yewdell和Bennink, 1992,Adv. Immunol .52:1-123)。如果肽是异源抗原来 源，肽-MHC I类复合物将被⑶8+细胞毒性T细胞(CTL)识别。CTL可结合肽-MHC(HLA)I类复合 物并由此被活化，开始增殖并形成CTL克隆。靶标细胞和细胞表面上具有相同肽-MHC I类复 合物的其他靶标细胞可被CTL克隆杀死。如果胞浆中引入了足够量的抗原，则可以建立对抗 异源抗原的免疫力（Yewdell和Bennink, 1992，同上；Rock, 1996，Immunology Today 17 : 131-137)。这是开发尤其是癌疫苗的基础。最大的实际问题之一是向胞浆中引入足够量的 抗原(或抗原的部分）。这可通过本发明来解决。
[0147] 如上所述，一旦通过光化学内化法释放在细胞胞浆中，抗原分子可以通过细胞的 抗原加工机构而加工，并以适当方式(例如通过MHC I类)而呈递在细胞表面上。该加工可以 涉及抗原的降解，例如蛋白或多肽抗原降解成肽，所述肽然后与用于呈递的MHC分子复合。 因此，根据本发明表达或呈递在细胞表面上的抗原分子可以是被内化(胞吞）的抗原分子的 部分或片段。
[0148] 多种不同的细胞种类可在其表面上呈递抗原，例如包括淋巴细胞(T和B细胞）、树 突细胞、巨噬细胞等。其他细胞包括例如癌细胞，例如黑素瘤细胞。这些细胞在本文中称为" 抗原呈递细胞〃。〃专门抗原呈递细胞〃是主要参与将抗原递呈给免疫系统效应细胞的细胞， 这在本领域中已知并在文献中有所描述，包括B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞。优选的是， 细胞是专门抗原呈递细胞。
[0149] 对于由抗原呈递细胞向细胞毒性T-细胞(CTL)进行的抗原呈递，抗原分子需要进 入抗原呈递细胞的胞浆(Germain，Cel 1，1994，76，287-299)。
[0150] 在本发明的例如涉及体外或离体方法的实施方式中，或作为另选涉及体内方法的 实施方式中，细胞是树突细胞。树突细胞为形成哺乳动物免疫系统一部分的免疫细胞。其主 要功能是将抗原材料加工并呈递在免疫系统的其他细胞的表面上。一旦被激活，它们迀移 至淋巴结并在那里与T细胞和B细胞相互作用从而引发适应性免疫应答。
[0151] 树突细胞源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞初始转变为未成熟树突细胞，未成熟 树突细胞的特征是高内吞活性和低T-细胞激活潜力。一旦它们接触到可呈递的抗原，它们 就被活化成成熟的树突细胞，并开始迀移至淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其 蛋白降解为小块，并在成熟时将那些片段利用MHC分子呈递在其细胞表面。
[0152] 树突细胞可源自任何合适的树突细胞来源，例如如来自皮肤、鼻内衬、肺、胃、肠或 血液。本发明特别优选的实施方式中，树突细胞来源于骨髓。
[0153] 树突细胞可以从天然来源分离，以用于本发明的体外方法，或可以在体外产生。树 突细胞产生自单核细胞，即，在体内循环并根据正确信号可以分化成树突细胞或巨噬细胞 的白细胞。单核细胞转而由骨髓中的干细胞形成。单核细胞衍生的树突细胞可以从外周血 单个核细胞(PBMC)体外生成。将PBMC铺设在组织培养瓶中使得单核细胞粘附。以白细胞介 素-4(IL-4)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理这些单核细胞导致在约一周内 分化为未成熟树突细胞（iDC)。后续以肿瘤坏死因子(TNF)处理进一步将iDC分化为成熟的 树突细胞。
[0154] 如本文所用的"接触"是指使细胞和光敏化剂和/或抗原分子和/或本文定义的TLR 配体在适合于内化到细胞中的条件下相互物理接触，例如优选的是在37°C在适当营养培养 基中，例如25°C至39°C，或在体内于体温（即，36°C至38°C)。
[0155] 细胞可以连续或同时与本文限定的光敏化剂和抗原分子和TLR配体接触。优选并 且方便的是，所述组分与细胞同时接触。光敏化剂和抗原分子(和可选的TLR配体)可被细胞 摄取到相同或不同的细胞内区室(例如，它们可以共同转位）。
[0156] 随后将细胞暴露于适合波长的光以激活光敏化合物，该光敏化合物进而引起细胞 内区室膜的破裂。
[0157] W0 02/44396(通过引用将其并入本文)描述了一种方法，其中，该方法中步骤的顺 序可以安排为例如使光敏化剂接触细胞，然后在需要内化的分子(此情况中为抗原分子)接 触细胞之前以照射进行活化。该方法利用了以下事实:将被内化的分子在照射时无需与光 敏化剂存在于同一细胞亚区室中。
[0158] 因此在一个实施方式中，所述光敏化剂和/或所述抗原分子和/或本文定义的TLR 配体一同地或相互分开地应用于细胞。然后在至少光敏化剂和抗原分子存在于同一细胞内 区室中时进行照射。这被称为〃后光（light after)〃法。
[0159] 在替代性实施方式中，所述方法可通过首先使所述细胞接触光敏化剂，然后接触 抗原分子和/或本文定义的TLR配体来进行，照射在光敏化剂被摄取到细胞内区室中之后、 但在细胞摄取抗原分子(和可选的TLR配体)进入包含所述光敏化剂的细胞内区室之前（例 如，其在光暴露时可存在于不同的细胞内区室)进行，优选在细胞摄取抗原分子(和可选的 TLR配体)到任何细胞内区室之前进行，例如在任何细胞摄取抗原分子(和可选的TLR配体） 之前进行。因此，例如可施用光敏化剂，然后进行照射，并随后施用其余试剂。这是所谓的〃 先光(light before)〃法。
[0160] 如本文所用的"内化〃是指分子的细胞内递送，例如胞浆递送。在此情形中，"内化〃 可包括分子从细胞内/膜包绕区室中释放到细胞的胞浆中的步骤。
[0161] 如本文所用的"细胞摄取"或"转位"是指内化的一个步骤，即，其中细胞膜外的分 子被摄入到细胞中从而使其出现在外部排布的细胞膜之内，例如通过内吞作用或其它适当 的摄入机制，例如进入或结合细胞内膜所限定出的区室，例如内质网、高尔基体、溶酶体、核 内体等。
[0162] 细胞与各种试剂接触的步骤可以以任何方便的或期望的方式来进行。因此，如果 该接触步骤在体外进行，则细胞可方便地保持在水性介质中，例如适当的细胞培养基中，并 在适当的时间点将各种试剂在适当的条件(例如适当的浓度和适当的时长)下简单地加入 到介质中。例如，所述细胞可在无血清培养基的存在下或含血清培养基的存在下与所述试 剂接触。
[0163] 下面的评述对分开将各种试剂应用于细胞进行讨论。不过，如上所述，这些试剂可 以一起、分别、同时或依次应用于细胞。如本文所述，在本发明方法中使用的各种试剂可在 体外或体内应用于细胞。在体内的情形中，如下文更详细地描述那样，应用可以通过直接 (即，局部)或间接(即，全身或非局部)施用。
[0164] 光敏化剂以适当的浓度和适当的时长接触细胞，所述适当的浓度和适当的时长是 本领域技术人员利用常规技术容易确定的，并取决于诸如所用的特定光敏化剂和靶标细胞 类型和位置等因素。光敏化剂的浓度利于使得一旦其被摄入到细胞中（例如进入或结合一 种或多种其细胞内区室)并被照射激活，则一种或多种细胞结构就会被破坏，例如一种或多 种细胞内区室裂解或破裂。例如，本文所述的光敏化剂可以以例如l〇μg/ml至50μg/ml的浓 度使用。
[0165] 对于体外使用，范围可以更宽，例如0.0005μg/ml至500μg/ml。对于人体内治疗，光 敏化剂可以在进行全身施用时以〇 . 〇5mg/kg体重至20mg/kg体重来使用。作为另选， 0.005mg/kg体重至20mg/kg体重的范围可用于全身施用。更方便的是，光敏化剂可局部施 用，例如通过皮内、皮下或肿瘤内施用，并且在此情况下，剂量可以是lyg至5000yg，例如10y g 至 2500iig、25iig 至 1000iig、50iig 至 500iig、lOyg 至 300iig 或 lOOlig 至 300iig。优选的是，剂量选 自100邱、150辟、200邱和250邱。优选的是剂量是75辟至125邱，例如100辟。所提供的剂量是 针对人的平均重量（即，70kg)而言。对于皮内注射，光敏化剂的剂量可以溶解于1 OOyl至lml 中，即，浓度可以为lμg/ml至50000μg/ml。在较小的动物中，浓度范围可以不同并可以相应 地调整，不过当局部施用时，对于不同动物几乎不需要改变剂量。
[0166]抗原的使用浓度取决于所用的抗原。方便的是，可在体外使用浓度为0.001 -500y g/ml (例如，20iig/ml ~500iig/ml、20iig/ml ~300iig/ml、20iig/ml ~lOOug/ml、20iig/ml ~50ii g/ml、lOμg/ml~50iig/ml、5μg/ml~50iig/ml、lμg/ml~50iig/ml、0 ? Olμg/ml~50iig/ml或 0.001lig/ml~50μg/ml)的抗原。对于肽抗原，可使用更低浓度，例如0.001iig/ml~500iig/ ml，例如0 ? 00 lμg/ml ~lμg/ml、5μg/ml、25μg/ml、50iig/ml或 100iig/ml。对于蛋白抗原，可使 用更高浓度，例如〇.5μg/ml~500iig/ml。对于体内使用，蛋白抗原剂量可以为0.5yg~500ii g，例如l〇yg~l〇〇yg或l〇yg~200iig。对于肽抗原，可米用0? lyg~4000iig、例如0? lyg~2000 吨、0.1吨~1000吨或0.1辟~500辟，例如0.1邱~100邱的体内剂量。这些剂量适合于局部 施用。可根据所研究的试剂被所研究的细胞摄入的效率以及在细胞中所需要实现的最终浓 度来确定适合的浓度。
[0167] 本文定义的TLR配体的浓度也取决于所要施用的具体分子，本领域技术人员将了 解合适的浓度或剂量。合适的体外和体内浓度或剂量的实例如下表2所示。
[0168] 表2
[0169]
[0170] 因此，例如，可以体外方便地使用lμg/ml~1 OOμg/ml (例如20iig/ml~1 OOμg/ml或 20μg/ml~50μg/ml)的浓度。可以使用体内剂量为10yg~lOOOyg的咪唑并喹啉化合物，例如 小鼠中为2〇yg~lOOyg，人中为l〇yg~10mg。对于局部施用，例如咪喹莫特在人体内局部施 用，可使用2 ? 5mg~50mg的剂量，例如lmg/cm2~5mg/cm2，例如2 ? 5mg/cm2。对于雷西莫特，剂 量可以为〇 ? lmg~50mg，例如lmg~5mg，例如lmg/cm2~5mg/cm2。相似的剂量适于嘎德莫特。 对于皮内注射咪唑并喹啉化合物，可以使用更小的剂量，例如至少1 〇yg或50yg，例如可使用 10yg~lmg。对于CpG寡核苷酸和其他TLR配体，可使用相似的剂量。Poly(IC)可以以小鼠体 内lyg~100yg的剂量和人体内lyg~10mg的剂量施用。
[0171] 在大多数情况下，光敏化剂、抗原分子和如本文所定义的TLR配体一起施用，但是 这可变化。因此，对于各不同组分，设想了不同的施用时间或模式或部位(或与细胞接触）， 并且本发明的范围内涵盖了这些方法。
[0172] 在一个实施方式中，将TLR配体，例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物、LPS或如 本文所定义的P〇ly(IC)分子与抗原分开施用，例如，在不同的制剂中分开施用，例如乳膏或 凝胶，或全身性施用，例如通过口服施用(例如使用雷西莫特时）。因此，在一个实施方式中， 例如CpG寡核苷酸或咪唑并喹啉化合物等TLR配体可在施用抗原和/或光敏化剂前施用，例 如24小时之前，例如通过局部预处理施用。在一些情况下，例如Poly (1C)或LPS等TLR配体在 抗原之前、同时或之后施用。
[0173] TLR配体可与其他试剂分开施用，例如在照明前约2小时施用。在替代性实施方式 中，所述试剂可以随同抗原或与抗原在同一时间（即，同时地)施用。
[0174] 便利的是，细胞与光敏化剂和/或抗原分子和/或本文所定义的TLR配体之间的接 触15分钟至24小时，例如30分钟至4小时，优选1.5至2.5小时。作为另选，时间的范围可为约 1小时至约48小时，例如约2小时至约40小时，或约6小时至约36小时，例如从12小时至30小 时，例如16小时至20小时，例如18小时或约18小时。
[0175] 在优选的实施方式中，细胞首先与光敏化剂温育。在一个实施方式中，施用光敏化 剂与抗原分子和/或TLR配体之间的时间以小时计。例如，光敏化剂可在照明前16至20小时 (例如18小时)应用，抗原分子和/或TLR配体可在照明前1至3小时（例如2小时）应用。因此， 施用光敏化剂与抗原分子和/或所述TLR配体之间的时间可以为15至23小时。
[0176] 因此，细胞在与光敏化剂温育后，与抗原和/或如本文所述的TLR配体温育。方便的 是，细胞在接触光敏剂/抗原后并在照射之前，可以放置在无光敏剂/抗原的培养基中，例如 30分钟至4小时，例如从1.5至2.5小时，这取决于与光敏化剂和抗原分子和TLR配体的温育 时机。
[0177] 使各种试剂与靶细胞接触的合适体内方法和温育时间取决于诸如施用模式和所 用试剂类型等因素。例如，如果所述试剂注入到需要处理/照射的肿瘤、组织或器官中，则注 射点附近的细胞会接触到所述试剂，因此倾向于比远离注入点的细胞速度更快地摄入所述 试剂，远离注入点的细胞可能在更晚的时间点以更低的浓度接触所述试剂。便利的是，可以 使用6至24小时的时间。
[0178] 另外，通过静脉注射或口服施用的制剂可能需要一些时间才能到达靶细胞并因此 可能需要更长的施用后时间（例如几天），以便使足够或最佳量的试剂累积在靶细胞或组织 中。个体细胞所需要的体内施用时间可能随这些参数以及其他参数而改变。
[0179]然而，虽然体内情况比体外更复杂，但本发明的基本概念仍然是相同的，即，分子 与靶细胞接触的时间必须使得在照射发生前适量的光敏化剂已被靶细胞摄入以及下述的 任一项：（i)在照射之前或照射期间，抗原分子(和可选的TLR配体)或者已被摄入到细胞中， 或者将在与靶细胞充分接触后被摄入到细胞中，例如进入与光敏化剂相同或不同的细胞内 区室，或（ii)在照射之后，抗原分子（以及可选的TLR配体)与细胞接触一段足以使其被摄入 到细胞中的时间。
[0180] 对于本文所述试剂的体内施用，可采用本领域常用或标准的任何施用模式，例如 对内部和外部身体表面进行的注射、输注、局部施用、经皮施用等。对于体内使用，本发明可 以用于含有细胞的任何组织（需要内化的包含光敏化剂的化合物或分子被定位至所述细 胞），包括体液位置，以及实体组织。可以治疗所有组织，只要光敏化剂被靶细胞摄入，并且 可以正确地递送光即可。优选的施用方式是皮内、皮下、局部或肿瘤内施用或注射。优选的 施用通过皮内注射进行。
[0181] 为了实现所期望的结果，例如抗原呈递、产生免疫应答或疫苗接种，所述方法或其 一部分可重复进行，例如可进行"重新疫苗接种"。因此，本发明整体上可在适当时间间隔后 进行多次(例如2、3或更多次），或该方法的部分可以重复，例如，进一步施用如本文所定义 的TLR配体或附加的照射步骤。例如，该方法或方法的部分可以在第一次实施之后的数天或 数周之内再次进行，例如5到60天（例如7、14、15、21、22、42或51天），例如7~20天，优选14 天，或例如1周至5周（例如，1、2、3或4周）。所述方法的所有或部分可以在适当的时间间隔重 复多次，所述时间间隔为例如每两周或14天。在优选的实施方式中，所述方法重复至少一 次。在另一实施方式中，所述方法重复两次。
[0182] 在一个实施方式中，在第2次或随后次进行所述方法时，抗原分子与光敏化剂和照 明联合施用，即，在第2次或随后次进行所述方法时不施用TLR配体。
[0183] 在替代性实施方式中，可以在进行本发明方法之前进行本发明方法的部分。例如， 可以在进行本发明方法之前，将该方法在不存在TLR配体的情况下进行一次或多次，例如两 次。作为另选，该方法可以在进行本发明方法之前在不存在光敏化剂和照明的情况下进行 一次或多次，例如两次。可以在进行本发明的方法之前数天(例如7或14天)或数周(例如1、3 或4周）进行本发明方法的一部分。可以在进行本发明的方法之前，以上述时间间隔将该方 法的一部分重复一次或多次。因此，在优选的方面，抗原分子(例如向受试者)施用2次以上 (例如，以上述的时间间隔），其中，至少所述抗原分子的施用根据本发明的方法进行。
[0184] "照射"以活化光敏化剂是指如下文中所述直接或间接地施加光。因此，受试者或 细胞可以例如直接(例如，对体外的单一细胞)或间接地用光源来照射，所述间接例如是在 体内，其时细胞处在皮肤表面之下或者处于不是其全部均可被直接照射(即，无其他细胞遮 蔽）的一层细胞的形态。可以在施用光敏化剂、抗原分子和文本限定的TLR配体之后约18至 24小时进行对细胞或受试者的照射。
[0185] 活化光敏化剂的照射步骤可根据本领域公知的技术和程序进行。所用的光的波长 和强度根据所使用的光敏化剂选择。适当的人工光源是本领域中公知的，例如，使用蓝色 (400nm~475nm)或红色（620mn~750nm)波长的光。对于TPCS 2a，例如可以使用的波长为 400nm至500nm、更优选400nm至450nm，例如430nm~440nm，进而更优选约435nm或435nm。在 适当的情况下，例如卟啉或二氢卟吩等光敏化剂可被绿光激活，例如KillerRed(Evrogen, Moscow,俄罗斯)光敏化剂可被绿光激活。
[0186] 合适的光源是本领域已知的，例如PCI Biotech AS的LuniiSourcc?灯。作为另选， 可以使用基于LED的照明装置，其具有高达60mW的可调节输出功率和430nm~435nm的发射 光谱。对于红光，合适的照明源是PCI Biotech AS 652nm激光系统SN576003二极管激光器， 不过也可以使用任何合适的红色光源。
[0187] 本发明方法中细胞暴露于光的时间可变。分子向胞浆中内化的效率随曝光增加而 提高直至达到最大值，超过该最大值后细胞损伤且因此细胞死亡会增加。
[0188] 照射步骤的优选时长取决于下述因素，例如靶、光敏剂、积聚在靶细胞或组织中的 光敏剂的量，以及光敏剂的吸收光谱与光源的发射光谱之间的重叠。通常，照射步骤的时长 为数秒至数分钟或者高达数小时(甚至达12小时）的量级，例如，优选至多60分钟，例如0.25 分钟或1分钟~30分钟，例如0.5分钟~3分钟或1分钟~5分钟或1分钟~10分钟，例如3分钟 ~7分钟，并优选约3分钟，例如2.5分钟~3.5分钟。也可以采用较短的照射时间，例如1秒~ 60秒，例如10秒~50秒、20秒~40秒或25秒~35秒。
[0189] 适当的光剂量可以由本领域技术人员选择，并且将同样取决于所使用的光敏剂和 在靶细胞或组织中积聚的光敏剂的量。当使用在可见光谱中具有较高消光系数(例如，在红 光区域，或如果使用蓝光则在蓝光区域，取决于所用的光敏化剂）的光敏剂时，光剂量通常 较低。例如，当采用可调输出功率高达60mW并且发射光谱为430nm~435nm的基于LED的照明 装置时，可以使用通量为〇 ? 〇5mW/cm2~20mW/cm2、例如2 ? 0mW/cm2的0 ? 24J/cm2~7 ? 2J/cm2的 光剂量。作为另选，例如如果采用LumiSource?灯，适合的是通量为0. lmW/cm2~20mW/cm2( Lumis.ource€>:提供13mW/cm 2)的0 . lj/cm2~6J/cm2的光剂量。对于红光，可以使用通量为 0 ? lmW/cm2~5mW/cm2、例如0 ? 81mW/cm2 的0 ? 03J/cm2~1 J/cm2、例如0 ? 3J/cm2 的光剂量。
[0190] 此外，如果要保持细胞活力，则需避免生成过高水平的毒性物种，并且可以因此而 调节相关参数。
[0191] 本发明方法可能不可避免地由于光化学治疗而导致一些细胞损伤，即，通过光敏 化剂活化时产生的有毒物质所导致的光动力学治疗效应。根据所提出的应用，这种细胞死 亡可能不严重，并可能实际上对某些应用是有利的（例如癌症治疗）。然而，在大部分实施方 式中，避免了细胞死亡，从而能由呈递细胞产生免疫应答。本发明的方法可修改，从而通过 选择相对于光敏化剂浓度的光剂量来调节存活细胞的分数或比例。同样，这类技术是本领 域公知的。
[0192] 优选的是，基本上所有或大部分（例如，至少75 %，更优选至少80 %、85 %、90 %或 95%的细胞)的细胞没有被杀死。PCI治疗后的体外细胞活力可以通过本领域已知的标准技 术如MTS试验测定。一种或多种细胞类型的体内细胞死亡可以在施用点1厘米范围（或在一 定的组织深度）内进行评估，例如通过显微镜进行评估。由于细胞死亡可能不会立即发生， 所述细胞死亡％是指在照射数小时（例如照射后至多4小时）内保持活力的细胞百分比，但 优选是指照射后4小时以上的活细胞％。
[0193] 所述方法可以在体内、体外或离体进行。优选的是，所述方法在体外或离体产生用 于体内施用或体内方法的细胞。因此，在优选的特征中，所述方法可用于在受试者中产生免 疫应答。
[0194] 因此，在另一方面，本发明提供了在受试者中产生免疫应答的方法，所述方法包括 对所述受试者施用抗原分子、光敏化剂和上文限定的TLR配体，并对受试者照射有效活化所 述光敏化剂的波长的光，其中，产生免疫应答。
[0195] 可以产生的"免疫应答"可以是体液和细胞介导的免疫，例如刺激抗体的产生，或 刺激细胞毒性细胞或杀伤细胞，这些细胞可识别并破坏(或是消除)在其表面上表达"外来" 抗原的细胞。术语"刺激免疫应答"因而包括所有种类的免疫应答和刺激它们的机制，并且 涵盖了对CTL的刺激(其构成本发明一个优选方面）。优选的是，所刺激的免疫应答是细胞毒 性CD8T细胞。免疫应答的程度可通过免疫应答的标志物来评价，例如分泌的分子如IL-2或 IFNy或抗原特异性T细胞的产生(例如，如实施例中所述的评估）。
[0196] 对细胞毒性细胞或抗体产生细胞的刺激需要将抗原呈递至将以特定方式由抗原 呈递细胞所刺激的细胞，所述方式例如为MHC I类呈递(例如CD8+细胞毒性T细胞的激活需 要MHC-I抗原呈递）。优选的是，免疫应答通过MHC-I呈递刺激。
[0197] 优选的是，免疫应答用于治疗或预防疾病、病症或感染，例如癌症。
[0198] 在一个实施方式中，癌症是黑色素瘤。黑色素瘤是黑色素细胞的恶性肿瘤，黑色素 细胞是负责产生黑色素(造成肤色的暗色素）的细胞。这些细胞主要出现在皮肤中，但也存 在于身体的其他部位，包括肠和眼睛中。黑色素瘤可以在包含黑色素细胞的身体任何部位 产生。
[0199] 本文所用的"黑色素瘤"包括所有类型的黑色素瘤，例如包括浅表扩散性黑色素 瘤、结节性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、纤维组织增生性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑 色素瘤和无黑色素的黑色素瘤、息肉样黑色素瘤、具有小痣样细胞的黑色素瘤和具有斯皮 茨痣特征的黑色素瘤。
[0200] 虽然大部分黑色素瘤在皮肤上发生(皮肤恶性黑色素瘤），但黑色素瘤也可在身体 其他地方发生，例如在内部器官中，例如在粘膜中。透明细胞肉瘤是软组织的恶性黑色素 瘤。黑色素瘤也可以发生在眼睛（葡萄膜黑色素瘤）、外阴、阴道或直肠。这些黑色素瘤也包 括在本发明的范围内。优选的是，待治疗的黑色素瘤是皮肤黑色素瘤。黑色素瘤也外延至转 移性黑色素瘤，即，源自原发黑色素瘤但已转移至不同位置从而产生继发性肿瘤的细胞。如 本文所述的黑色素瘤的治疗或预防外延至原发黑色素瘤和/或从原发黑色素瘤派生的继发 性肿瘤的治疗。因此，本发明还涉及治疗转移性黑色素瘤的应用。
[0201] 在替代性实施方式中，癌症与乳头瘤病毒相关或由乳头瘤病毒引起/由乳头瘤病 毒诱导，特别是人乳头瘤病毒(HPV)。如上文所讨论，乳头瘤病毒基因组是分为早期区(E)和 晚期区（L)，早期区（E)编码被宿主细胞初始感染后立即表达的6个化1』2444546和￡7) 开放阅读框(ORF)，晚期区（L)编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。所有病毒的ORF编码 在一条DNA链上。可根据本发明使用的HPV抗原可与由HPV感染导致的癌症相关，可以是如本 文所讨论的一种或多种已知的抗原肽或T-细胞表位。如上文所讨论，有数种类型的HPV，而 本发明所述的与HPV相关的癌症可以与任何类型的HPV相关或由任何类型的HPV所导致，例 如HPV-16和/或HPV-18,或者HPV-31或HPV-45。根据本发明使用的抗原可源自E1、E2、E4、E5、 E6或E7蛋白中的任一种或L1和L2蛋白中的任一种。因此，所述抗原分子可源自HPV-16和 HPV-18的E2、E6和E7中的一种或多种。在优选的实施方式中，抗原分子包含HPV-16的E7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8表位以粗体字表示）。因此，HPV抗原可以 是35氨基酸肽。作为另选，抗原分子可以仅为CD8表位RAHYNIVTF，即，更短的肽。
[0202]在替代性实施方式中，所述疾病、病症或感染是病毒感染，优选乳头瘤病毒感染， 特别是人乳头瘤病毒(HPV)感染。
[0203]优选的是所述方法用于疫苗接种。如本文中所述，"疫苗接种(vaccination)"是使 用抗原(或包含抗原的分子）引起免疫应答，该免疫应答预防或治疗疾病、病症或感染的发 展(或进一步发展），其中，所述疾病、病症或感染与抗原的异常表达或存在有关。优选的是， 所述疾病是癌症，例如黑色素瘤或与乳头瘤病毒如HPV相关的癌症。在一个实施方式中，疫 苗接种具有治疗性，例如用于治疗本文中所讨论的癌症。在替代性实施方式中，疫苗接种具 有预防性，例如用于预防癌症或在对更早期的癌症以治疗疫苗接种进行治疗后进一步降低 癌症发展。在另一实施方式中，当要产生针对感染(例如病毒感染，例如乳头瘤病毒感染)的 免疫应答时，疫苗接种具有预防性质。
[0204] 在本发明优选的实施方式中，所述方法例如疫苗接种的受试者是哺乳动物，优选 猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，但最优选的受试者是人。
[0205] 优选的是本文描述的方法实现协同效应(synergy)，即，与通过(i)在不存在的TLR 配体的情况下用抗原分子进行所述方法和（ii)在不存在光敏化剂和照射步骤的情况下用 抗原分子进行所述方法而观察到的加和增强相比，细胞表面呈递或免疫应答产生的程度增 强，即，观察到了所述方法之间的协同效应。细胞表面呈递或免疫应答产生的水平可以通过 适当方式评估，例如抗原特异性CD8+细胞的数目或免疫应答激活的标记物（例如IFN y或 IL-2)的水平。
[0206]本文所用的"协同效应"是指相对于简单加和效应的定量提高。
[0207] 本发明方法中所用的各种试剂可分别、依次或同时施用给受试者。
[0208] 上述与本发明在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分的方法相关而论述的方 面和特征在适当时也适用于以上产生免疫应答的方法。
[0209] 本发明还提供了将抗原分子引入细胞的胞浆中的方法，所述方法包括使细胞接触 需要引入的抗原分子、光敏化剂和本文定义的TLR配体，并以有效活化所述光敏化剂的波长 的光照射细胞。一旦被激活，所述细胞的包含所述化合物的细胞内区室将这些区室中所含 的分子释放到胞浆中。
[0210] 本发明上述方法可在体外或体内使用，例如用于原位治疗或用于离体治疗，然后 将经治疗的细胞施用到身体内。
[0211] 本发明还提供了在表面上表达抗原分子或其一部分的细胞，或细胞群，所述细胞 通过本文限定的任何方法获得或可通过其获得。还提供如下文所述用于预防或治疗的细胞 或细胞群。
[0212] 细胞群可在药物组合物中提供，所述组合物还包括一种或多种药学可接受的稀释 剂、载剂或赋形剂。
[0213] 本发明还提供了一种药物组合物，其包括抗原分子、光敏化剂和本文定义的TLR配 体以及一种或多种药学可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
[0214] 这些组合物(和本发明的产品）可以以任何方便的方式根据药物领域中已知的技 术和程序进行配制，例如利用一种或多种药学可接受的稀释剂、载剂或赋形剂进行配制。 "药学可接受的"在本文中是指与组合物(或产品）的其它成分相容并且接受者生理上可接 受的成分。组合物的性质和载剂或赋形剂材料、剂量等可以在常规的方式中根据选择和期 望的施用途径、治疗目的等选择。剂量同样可以在常规的方式中确定，并可取决于分子(或 组合物或产品的组分）的性质、治疗目的、患者的年龄、施用模式等。对于光敏化剂而言，也 应考虑在照射时破坏膜的效能/能力。
[0215] 细胞、例如抗原呈递细胞可以在体外制备。在治疗方法中，这些细胞可施用于体内 或离体组织，从而出于例如预防或治疗的目的使这些细胞刺激免疫应答。
[0216] 因此，本发明还提供了如本文所定义的细胞群(或包含细胞群的组合物），或抗原 分子、光敏化剂、以及本文定义的TLR配体，其用于预防或治疗或用于刺激免疫应答，例如用 于疫苗接种目的，例如在受试者体内刺激CTL，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病 症或感染，特别是用于治疗或预防癌症，如黑色素瘤或与乳头瘤病毒（如HPV)相关联的癌 症。作为另一种方式限定而言，本发明提供（i)细胞群、（ii)本文所定义的组合物、或（iii) 抗原分子和/或光敏化剂和/或TLR配体在制备药物中的应用，所述药物用于刺激受试者免 疫应答(例如，刺激CTL)，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫 苗接种和/或用于治疗或预防癌症，如黑色素瘤或乳头瘤病毒(如HPV)相关的癌症，其中，优 选的是所述免疫应答由本文所定义的方法刺激。
[0217] 所述刺激、治疗或预防优选包括对所述受试者施用所述药物。
[0218] 抗原分子、光敏化剂和TLR配体可组合并存在于所述组合物中。换言之，本发明提 供了抗原分子和/或光敏化剂和/或本文定义的TLR配体在药物制备中的应用，所述用于刺 激免疫应答(例如刺激受试者的CTL)，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感 染，特别用于疫苗接种目的，其中，所述药物包括在细胞表面上表达抗原分子或其一部分的 细胞群(所述细胞可通过本文限定的方法获得），用于施用给所述受试者。优选的是，细胞群 通过所述方法获得。细胞群用于对受试者施用。
[0219] 在替代性实施方式方式中，本发明提供了抗原分子、光敏化剂和本文定义的TLR配 体，用于在细胞的表面上表达所述抗原分子或其一部分，以刺激受试者的免疫应答(例如刺 激CTL)，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，其中，所述应用包括本文限 定的方法，优选用于制备细胞群，例如树突细胞。这些细胞随后可施用于受试者。
[0220] 本发明还提供了包括抗原分子、光敏化剂和本文定义的TLR配体作为联合制剂的 产品，其用于在本文所述的方法中同时、分别或依次使用以刺激受试者的免疫应答(或用于 在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分，或用于将抗原分子内化到细胞的胞浆中），优选 用于治疗或预防受试者的疾病、病症或感染。
[0221] 本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用于在本文所述的方法中刺激受试者免疫 应答，优选用于治疗或预防受试者的疾病、病症或感染，例如用于疫苗接种或免疫、或用于 在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分，或用于将抗原分子内化到细胞的胞浆中，所述 试剂盒包括
[0222] 第一容器，其包含本文定义的光敏化剂；
[0223] 第二容器，其包含本文定义的所述抗原分子;和 [0224]第三容器，其包含本文定义的TLR配体。
[0225] 本发明的产品和试剂盒是用于实现本文限定的细胞表面呈递(或治疗方法）。
[0226] 在另一实施方式中，本发明提供了在受试者体内产生免疫应答(例如刺激CTL)、优 选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染的方法，所述方法包括根据本文所述方 法制备细胞群，并随后将所述细胞施用于所述受试者。
[0227] 当经处理的细胞体内施用时，由所要求保护的发明实现的抗原呈递可有利地导致 对免疫应答的刺激。优选的是，产生了免疫应答，该免疫应答赋予了针对后续由包括或包含 所述抗原分子或其一部分的实体进行的激发(challenge)的保护，因此本发明可特别作为 疫苗接种方法使用。
[0228] 所述疾病、病症或感染是可通过产生免疫应答进行治疗或预防的任何疾病、病症 或感染，例如通过消除异常或外来细胞来进行治疗或预防，所述异常或外来细胞根据使其 与正常细胞有所区别(并被消除）的抗原(或其表达水平)而被识别。对所要使用的抗原分子 的选择决定所要治疗的疾病、病症或感染。基于上述的抗原分子，本文所述的方法、应用和 试剂盒等可用于治疗或预防例如感染(例如上文提及的病毒或细菌感染）、癌症或多发性硬 化症。对所述疾病、病症或感染的预防可成为疫苗接种。
[0229] 本文限定的"治疗"是指使所要治疗的疾病、病症或感染的一种或多种症状与治疗 之前相比有所减轻、缓解或消除。〃预防〃是指延迟或阻止疾病、病症或感染的症状的发作。 预防可以是绝对的（因此不发病），或可仅对一些个体或在有限时间内有效。
[0230]对于体内施用细胞，可以使用本领域常用的或标准的任何细胞群施用模式，例如 通过适当途径注射或输注。方便的是，细胞通过淋巴管内注射来施用。优选的是，每kg受试 者体重施用1 X 104至1 X 108个细胞（例如人体中为1.4 X 104/kg至2.8 X 106/kg)。因此，例 如，在人体内，可以以〇. 1 X 107至20 X 107细胞的剂量（即，每剂)施用，例如作为疫苗接种剂 量。必要时该剂量可在晚些时候重复。
[0231] 现在将参考附图在以下非限制性实施例中更详细描述本发明：
[0232] 图1显示了以抗原卵清蛋白（0VA)和标示出的情况下的TPCS2a(PCI)和CpG或R848的 混合物对小鼠进行体内疫苗接种后血(A)和脾脏(B和C)中的抗原特异性T细胞％。图(A)显 示了疫苗接种7天后血中的抗原特异性CD8+T细胞％，各圆圈表示一只动物。图（B)显示疫苗 接种14天后脾脏中的抗原特异性CD8+T细胞％，各圆圈表示一只动物。图（C)是表示与(B)所 示数据相同的柱状图。
[0233] 图2显示的是来自按图1图例所示进行接种的小鼠的CD8+脾细胞在以SIINFEKL抗 原肽进行体外刺激后的IFN- y产生程度。通过针对IFN- y的细胞内染色并通过流式细胞术 进行细胞分析来完成分析。图B是表示图A所示数据的柱状图。
[0234] _显示的是来自按图1图例所示进行接种的小鼠的总脾细胞在以SIINFEKL抗原 肽进行体外刺激后的IFN-y和IL-2产生量。分析通过ELISA完成。图A和C显示进行和不进行 SIINFEKL再刺激的结果，结果显示为不经过根据相应标准曲线进行校正的来自ELISA测试 的直接读数。图B和D显示SIINFEKL刺激的样品的相同数据，其中IFN- y和IL-2的浓度根据 相应标准曲线进行计算。
[0235] 里i显示方案1:合成化合物5的合成路线。试剂和条件：（a)丙酸，回流，1小时 (20%);(13)恥腸2(1.8当量），丁卩厶，室温，3分钟（67%);(。）511(：12.2112〇，浓11(：1，60°(：，1小时 (88%) ;(d)溴乙酰溴，Et3N，CH2Cl2,室温，1 小时（64%); (e)哌嗪，CH2C12,室温，1 小时 (94%)〇
[0236] 方案2:N-改性壳聚糖衍生物(TPP-CS-TMA&TPP-CS-MP)的合成。此处A-表示第1批 化合物，B-表示第2批化合物。试剂和条件：（a )MeS03H/H20，10 °C~室温，1小时，（90 % ); (b) TBDMSC1，咪唑，DMS0，室温，24小时（96 % ); (c)溴乙酰溴，Et3N，CH2C12，-20°C，1 小时（92 % ); (d) 化合物5,即TPP-NH-Pip(0.1 或0.25当量）4七北〇1(：13，室温，2小时（92%~90%);(6) NMe 3或 1-甲基哌嗪，CHC13，室温，24小时；（f)TBAF，NMP，55°C，24小时或浓HCl/MeOH，室温，24 小时。
[0237] 方案3-化合物1、3、20和21的合成方案。反应和条件：（a)丙酸，回流，1小时， (20%) ; (b)NaN02(l .8当量），TFA，室温，3分钟；（c)SnCl2 ? 2H20,浓HC1，60°C，1小时， (54 % ); (cU)对甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小时；（d2)邻氯苯醌，CH 2C12，室温，（80 % ); (e) 氯乙酰氯，Et3N，CH2C12，室温，2小时，原位；（f)哌嗪，CH 2C12，室温，12小时，（61 % )。化合 物20和21的所有衍生物将含有TPCaj^PCa2异构体。但是仅TPCai结构显示在方案和结构图 中。
[0238] 方案4-化合物22~28的合成方案。反应和条件：（a)乙酰氯，MeOH，回流，24小时， (87 % ); (b)BF3 ? Et20，CHC13，室温，对氯苯醌，48小时，（14 % ); (c) 2N K0H(在MeOH中），THF: 吡啶（10:1)，回流，24小时（71 % ); (cU)对甲苯磺酰肼，K2C03，吡啶，回流，24小时；（d2)邻氯 苯醌，CH2CI2:MeOH(75:25)，室温，（70 % ); (e)EDCI ? HC1，H0BT，Et3N，N-Boc-哌嗪5，DMF，室 温，24小时（54% ); (f )TFA，CH2C12，室温，1小时（89% )。化合物26~28的所有衍生物将含有 TPCcd^PCc2异构体。但是仅TPCcd#构显示在方案和结构图中。
[0239] 方案 5A和 5B:试剂和条件（6A):(a)化合物 21，即，TPC-NH-Pip(0.1 当量）、Et3N、 CHC13，室温，2h(78 % ); (b)NMe3或1-甲基哌嗪，CHC13，室温，24h。试剂和条件(6b): a)化合物 28, SP，TPC-C0-Pip(0.1 当量），Et3N，NMP，75°C，12h(89% ); (b)NMe3或 1-甲基哌嗪，CHC13,室 温，24h。
[0240] 图5显示的是佐剂poly(IC)和CpG的效果。以 10ug 0VA，以 100yg 0VA，以 10yg OVA 和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸，以 10yg 0VA、50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸和 150yg TPCS2a，以 10yg OVA和50yg Poly(IC)，以lOyg 0VA、50yg Poly(IC)和 150iig TPCS2Jt小鼠进行免疫，或不进行处理。对接受TPC&j^小鼠进行照射。小鼠在第7天 取血，并通过流式细胞术分析0VA特异性CD8T细胞的频率。在第14天获得脾细胞，并以 SIINFEKL肽再刺激，通过干扰素-y ELISA进行分析。（A)显示了实验组第7天血中的平均值 (总CD8+细胞中的抗原特异性CD44+细胞％)(每组5只动物，误差条:平均值的标准误差）。0) 显示以SIINFEKL肽再刺激脾细胞第14天后由干扰素-y (IFN-y )ELISA获得的结果。
[0241] _显示以OVA和po 1 y (IC)第1次和第2次免疫小鼠后的（总⑶8+细胞中的抗原特异 性⑶44+细胞％)平均值。
[0242] &显示在第2次(第22天)免疫后实验中各动物在第2次免疫后的值(总⑶8+细胞 中的抗原特异性CD44+细胞％ )(误差条是标准误差）。
[0243] 图8显示第2次免疫后TRP-2五聚体染色实验组的平均值（总⑶8+细胞中的抗原特 异性⑶44+细胞％)。
[0244] _显示了在第1和第2次免疫后利用红光照射以激活光敏化剂时实验组的平均值 (总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％ )。
[0245] 图10显示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后实验组的平均值（总CD8+细胞 中抗原特异性CD44+细胞的％ )(误差条为平均值的标准误差）。
[0246]图11显示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫实验组的平均值(总CD8+细胞中 的抗原特异性⑶44+细胞％ )。
[0247] 图12显示了图中所示以SIINFEKL肽再刺激或不进行再刺激的脾细胞中平均ELISA 值。
[0248] 图13显示了在第1和第2次免疫后实验组(每组5只动物，误差条是标准偏差）的平 均值(总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％ )。
[0249] 图14显示三次免疫的每一次之后的实验组的总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细 胞％。
[0250]图15显示3次免疫之后实验组的总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％。
[0251]图16显示第1和第2次免疫后的实验组(每组5只动物，误差条是标准偏差）的平均 值(总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％ )。
[0252]图17显示来自三个实验组中的典型动物在第三次免疫后的流式细胞术点状图。
[0253] 图18显示了3次免疫中每一次之后的平均值(总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细 胞％)。
[0254] 图19显示了在两次免疫后的实验组的总CD8+细胞中的抗原特异性CD44+细胞％。
[0255] 图20显示了在两次免疫后的实验组的总CD8+细胞中的抗原特异性CD44+细胞％ +/-SEM。 实施例
[0256] 材料和方法 [0257] 小鼠
[0258] C57BL/6小鼠购自Har 1 an(Horst，荷兰）。识别卵清蛋白（0VA)的MHC I类限制表位 0VA257-264的T-细胞受体转基因0T-I小鼠在苏黎世大学设施中繁殖(原购自Taconic Europe (Ry，丹麦））。所有小鼠保持在专门无病原体(SPF)条件下，所进行的程序经瑞士兽医部门批 准。在0T-1小鼠中，对T-细胞受体基因进行工程化，从而使这些小鼠中的所有⑶8+T细胞(称 为0T-1细胞)特异性识别卵清蛋白（0VA)抗原的特定肽表位(SIINFEKL)。
[0259] 免疫程序
[0260] 在第0天，对雌性C57BL/6小鼠在尾静脉静脉内注射来自Rag2/0T-1小鼠的1.5 X 1 〇6个脾细胞。这样，经过接种的小鼠具有如下的CD8T细胞"背景"：当（且仅当）其适当以MHC I类呈递在抗原呈递细胞时，其能够响应于来自0VA的SIINFEKL-表位。因此，0T-1细胞的转 移"扩增"经接种的小鼠的检测系统，使得通过测量抗原特异性CD8+T细胞以及IFN-y和IL-2产生，可以容易地测定体内疫苗接种的效果。
[0261] 4小时后，对动物在腹部皮下接种（包含以下规定成分的2X50iil溶液）。6组动物 (每组4只)接种的总剂量为：
[0262] 第1组：25ug TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0263] 第2组：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+60yg CpG。
[0264] 第3组：25yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0265] 第4组：10yg卵清蛋白。
[0266] 第5组：lOyg卵清蛋白+60lig CpG。
[0267] 第6组：10yg卵清蛋白+100yg R848(雷西莫特）。
[0268] 所用的CpG寡核苷酸是B型20聚体0DN 1826(由Microsynth(Balgach,瑞士）合成）， 序列为(5Z-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3')，具有全硫代磷酸酯(PS修饰)骨架。
[0269] 在第1天，对第1、2和3组的动物进行麻醉，并利用LumiSource灯(PCI Biotech AS) 以蓝光照射6分钟。在注射抗原溶液后约18小时对动物进行照射，照射的通量率为约13mW/ cm2。第7天，从尾静脉对小鼠采血，以SIINFEKL五聚体(Pro Immune)以及⑶8和⑶44抗体对血 细胞染色，以便进行流式细胞术分析(见以下规程）。在第14天，将小鼠安乐死，并收集脾脏。 对一份等分试样的脾细胞以SIINFEKL肽(EMC Microcollections，Tuebingen，德国）进行再 刺激，对细胞内IFN-y表达进行染色，通过流式细胞术分析(见下文)进行分析。将另一等分 式样的脾细胞重悬浮在细胞培养基中，在不进行再刺激的情况下在该培养基中保持过夜 (纯粹出于实践原因），如上述以SIINFEKL-五聚体染色，通过流式细胞术（见下文）进行分 析。
[0270] 脾细胞的SIINFEKL-五聚体
[0271] 对重悬在细胞培养基中并在不进行再刺激的情况下在该培养基中保持过夜(纯粹 出于实践原因）的细胞进行脾细胞的SIINFEKL-五聚体染色和流式细胞术。
[0272] SIINFEKL-五聚体染色和流式细胞术
[0273] 收集5~10滴尾部全血，并加入0.5ml的红细胞裂解液(Sigma)。在5~6分钟后，将 细胞旋转沉淀，以〇. 5ml PBS洗涤两次。细胞沉淀重悬浮在FACS缓冲液(具有0.01 %叠氮化 钠的2%FCS/roS)中，转移到U形96孔板中，并与FcR封闭抗体（l.Oyl Pharmingen的Anti-CD16/CD32)在冰上温育10分钟（lyl+49yl FACS缓冲液）。不经过洗涤，加入SIINFEKL-五聚 体-PE(ProImmune; 5ul/样品），混合并在37°C温育15分钟。不经过洗涤，加入荧光标记的⑶8 或⑶44,达到1:100的终浓度，并在冰上温育25至45分钟。细胞在100yl FACS缓冲液中洗涤， 并悬浮在l〇〇yl FACS缓冲液中。以FACSCanto对细胞进行分析。
[0274] 脾细胞离体再刺激
[0275] 通过以下方式分离并制备用于细胞内染色的脾细胞:将脾压碎，通过在裂解缓冲 液(Sigma)中搅拌1至2分钟在2%FCS/roS中分离细胞，并在2%FCS/roS中洗涤。在24孔板的 每个孔中加入完全培养基中的lml细胞悬浮液(500，000细胞/ml )，并在每个孔中加入5yg/ ml SIINFEKL，然后在37°C温育过夜。各孔中加入布雷费德菌素A(lμg/ml~2μg/ml)，并在37 °C温育4小时。细胞转移至U形96孔板，在2 % FCS/roS中洗涤，并重悬浮在50yl具有FcR封闭 抗体(Pharmingen的l.Oyl抗-CD16/CD32)的FACS缓冲液中，在冰上温育10分钟。不经过洗 涤，细胞与表面抗体⑶8或⑶44冰上温育20至45分钟（暗处），以FACS缓冲液洗涤，并通过重 悬在冰上的l〇〇yl多聚甲醛(PFA) (PBS中1 % )中固定10-20分钟。细胞以FACS缓冲液洗涤，重 悬浮在100yl NP40(PBS中1 % )中，并冰上温育3分钟。在FACS缓冲液中洗涤后，加入荧光标 记的干扰素y抗体，并避光在冰上温育35分钟。在FACS缓冲液中洗涤和悬浮后，利用Flowjo 8.5.2软件(Tree Star, Inc.，Ashland,OR)通过FACSCanto对细胞进行分析。
[0276] 流式细胞术
[0277] 通过流式细胞术(BD Biosciences的FACSCanto,San Jose,美国）确定0VA特异性T 细胞的频率。在流式细胞术运行之前，利用以各抗体分别染色的珠进行补偿。在抗体染色之 前，利用红细胞裂解液（Sigma)将血红细胞裂解。对各样品记录10 000个⑶8+事件，利用 Tree Star，Inc.(Ashland，0R)的Flowjo 8 ? 5 ? 2软件（http : //www ? flow jo ? com/)计算 SIINFEKL-五聚体阳性细胞的百分比。
[0278] ELISA
[0279] 利用Ready-set Go !试剂盒（eBioscience)根据制造商手册对相关分子进行 ELISA。
[0280]实施例1 :TLR配体对OVA体内疫苗接种的影响
[0281] 通过上述免疫规程对小鼠体内接种。7天后分离血，14天后分离脾脏。用血分析抗 原特异性CD8+T细胞，对脾细胞直接分析抗原特异性CD8+T-细胞，或在体外再刺激后分析 IFN-y或IL-2的产生。
[0282] 血和脾脏中抗原特异性T细胞的水平
[0283] 通过流式细胞术，利用特异性结合抗原特异性T-细胞的荧光标记的抗原特异性 "五聚体"测定抗原特异性T细胞的水平。确定了动物体内总CD8+T细胞中的抗原特异性CD8+ T细胞％ (见免疫规程中描述的染色和流式细胞术分析以及SIINFEKL染色的具体内容）。
[0284] 将内源T细胞作为效果的抗原特异性的内部对照，这是因为对T细胞的一般性刺激 还将影响内源T细胞，而不引起抗原特异性细胞％的增加。通常，在疫苗接种之前和在疫苗 接种之后的时间点测定0T-1细胞％。将仅采用抗原的效果（"常规疫苗接种"）与抗原+PCI的 效果相比较。
[0285] 以抗原离体刺激后脾细胞中IFN- y产生的水平(流式细胞术）
[0286] 对在疫苗接种的第14天移除的脾脏进行脾细胞分离并以SIINFEKL抗原肽再刺激， 并对IFN-y产生进行细胞内染色，以便通过以上规程中描述的流式细胞术分析CD8+T细胞。
[0287] 以抗原离体刺激后脾细胞中IFN- y和IL-2产生的水平(ELISA)
[0288]对在疫苗接种的第14天移除的脾脏进行脾细胞分离并以SIINFEKL抗原肽再刺激， 并通过以上规程中描述的ELISA分析IFN-y和IL-2的产生。
[0289] 莖里
[0290] 血和脾脏中抗原特异性T细胞的水平
[0291] 结果如图1所示。可以看到，当在第7天进行测试时，与仅用0VA抗原的情况相比 (A)，PCI引发了显著更好的效果。CpG寡核苷酸与仅用0VA抗原的情况相比也改善了疫苗接 种，但没有PCI程度那么大。单独的R848与仅用0VA抗原的情况相比没有改善疫苗接种，相反 其似乎在一定程度上抑制了疫苗接种的效果。与PCI+0VA的效果相比，将PCI与R848或CpG组 合改善了疫苗接种。这种改善在疫苗接种后14天分析脾细胞时更明显(B和C)。可以看出，在 这一时刻单独的PCI+OVA治疗的效果已经回到了背景水平，对于未使用PCI的R848/CpG+0VA 组也是如此。然而，在R484或CpG与PCI组合的两组中，观察到了明显更好的效果，对于R848 尤其明显。
[0292]细胞以抗原离体刺激后脾脏中IFN- y产生的水平(流式细胞术）
[0293] IFN-y和IL-2是以抗原刺激后⑶8+T细胞产生的细胞因子。结果如图2所示。与图1 所示结果相符，图2显示了 CpG/R848与PCI组合产生了最好的效果，在测试该参数时，CpG+ PCI看似好于R848+PCI。还可以看出，单独的抗原(OVA)未得到可检测的结果，而0VA+PCI引 起了可观察到的效果。未采用PCI的CpG/R848+0VA组未获得效果(CpG)，或仅获得勉强开检 测到的效果(1?848)，而组合0￥4+0口6+?(：1和0￥4+1?848+?(：1分别比0￥4+?(：1好约6倍和2.5倍。
[0294] 以抗原离体刺激后脾细胞中IFN- y产生的水平(ELISA)
[0295] 结果如图3所示。图3A和3C中显示IFN-y和IL-2的产生均在0VA+CpG/R848+PCI组 中最高，并且该产生依赖于SIINFEKL肽抗原的刺激，表明其为是抗原特异性效果。图B和D显 示CpG/R848+0VA+PCI组中的效果显著好于其他治疗组。
[0296] 实施例2:其他TLR配体对0VA体内疫苗接种的影响
[0297] 采用上述方法进行体内疫苗接种。因此，可进行上述方法，其中14组（每组4只动 物)接种的总剂量为：
[0298] 第1组：250iig TPCS2a(Amphinex)+10iig卵清蛋白（0VA，Grade V，Sigma-Aldrich) 〇
[0299] 第2组：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙龈卟啉菌）。
[0300] 第3组：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+50iig LPS(埃希氏大肠杆菌）。
[0301] 第4组：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+50yg LPS(明尼苏达沙门氏菌）。
[0302] 第5组：250yg TPCS2a+10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼苏达沙门氏菌）。
[0303] 第6组：250lig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0304] 第7组：250iig TPCS2a+10yg卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0305] 第8组：10yg卵清蛋白。
[0306] 第9组：10yg卵清蛋白+50yg LPS(牙龈卟啉菌）。
[0307] 第10组：10yg卵清蛋白+50yg LPS(埃希氏大肠杆菌）。
[0308] 第11组：l〇yg卵清蛋白+5〇yg LPS(明尼苏达沙门氏菌）。
[0309] 第12组：10yg卵清蛋白+100yg MPLA(明尼苏达沙门氏菌）。
[0310]第 13组：10iig卵清蛋白+lmg Poly(I:C)。
[0311 ]第 14组：10lig卵清蛋白+lmg ssPolyU。
[0312] Poly( I: C)、LPS、MPLA和ssPolyU均获自 Invivogen。
[0313] 实施例3:P〇ly(IC)和CpG对OVA体内疫苗接种的影响 [0314]材料和方法
[0315] 动物
[0316] C57BL/6小鼠购自Harlan(Horst，荷兰）DCD8T-细胞受体转基因0T-1小鼠 (B6? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb)llOOMjb)购自Taconic Europe(Ry，丹麦）或Jackson Laboratories (Bar Harbor，Maine) aOT-lCDST细胞识别卵清蛋白的H_2Kb_限制表位 311即￡此((^4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??条件下，所进行的程序得到瑞士和挪威兽 医管理结构的批准。
[0317] 材料和细胞
[0318] 鸡0VA购自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽购自EMC Microcollections (Tuebingen，德国），Poly(IC)(高MW)和CpG寡核昔酸0DN2395购自 InvivoGen(San Diego，美 国）。光敏化剂二磺酸四苯基二氢卟吩（TPCS2a)购自PCI Bi〇tech(LySaker，挪威hOVA、 TPCS 2JPP〇ly(IC)(如果采用)在PBS中混合，保持避光，在制备后60分钟内施用于小鼠。通过 LumiSource?(PCI Biotech)以照射激活TPCS2a〇
[0319] 小鼠的皮内光敏化和免疫
[0320]在免疫前一天，从雌性0T-1小鼠体内分离脾脏和淋巴结，从均化细胞悬浮液中通 过裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解缓冲液Hybri-Max)移除红细胞。剩余的细胞在PBS中洗 涤，通过70mi尼龙粗滤器过滤，通过静脉注射将2X10 6个0T-1细胞注射给受体雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特异性CD8T细胞的适应性转移有助于通过流式细胞术检测免疫应答。1天或 8小时后，通过尾部放血对小鼠采血，将血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特异性⑶8T 细胞的基线频率。
[0321]然后，将小鼠腹部区域剃毛，并且使用带有29G针头的注射器皮内注射疫苗，所述 疫苗由0VA或者由OVA、TPCS2a、Po ly (1C) (50yg)或CpG寡核苷酸(50yg)的混合物组成。疫苗保 持避光，并在制备后60分钟内使用。该疫苗在腹部中线的左侧和右侧分两次注射施用，每次 SOyhOVA使用剂量为10yg或100yg，并且TPCS 2a剂量为150yg。疫苗注射后18小时，通过腹膜 内注射氯胺酮（25mg/kg体重）和赛拉嗪（425mg/kg)的混合物将小鼠麻醉，并放置在 LumiSource光源上(进行照射和光敏化剂TPCS 2a激活）。照射时间为6分钟。
[0322] 在之后第7和14天，小鼠经尾部放血采血，并通过裂解去除红细胞，之后通过流式 细胞术分析抗原特异性CD8T细胞。在实验结束时(第14天），小鼠处以安乐死，并离体分析脾 细胞。
[0323]免疫应答的分析
[0324] 用抗CD8抗体和H_2Kb/SIINFEKL Pro5五聚体（Proimmune，Oxford，英国）染色细 胞，以进行流式细胞术分析，从而监测血中OVA特异性CD8+T细胞的频率。通过流式细胞术检 测CD44的表达，来进一步分析细胞的活化状态。细胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San ]〇86，美国）进行分析，并使用？1〇￥]〇8.5.2软件(1^66 3七31'，1]1〇.，4811]^11(1，010进行分析。
[0325] 对于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中对2X105个脾细胞进行 再刺激。72小时后，收集上清液并通过ELISA分析IFN-y (eBioscience-根据制造商的说明 书进行）。
[0326] Poly(IC)和 CpG 实验
[0327] 按照"材料和方法"部分描述进行实验，疫苗接种后第7天的小鼠血样通过所述流 式细胞术进行分析。第14天的脾细胞以SIINFEKL肽进行再刺激，并通过上述干扰素y ELISA 进行分析。所有小鼠接受所述0T-1细胞。
[0328] 以下试验组包括：
[0329] 1.未治疗:小鼠接受0T-1细胞，但未接种或照射。
[0330] 2.0VA:小鼠以10yg 0VA接种。它们未进行照射。
[0331] 3.0VA 100yg:小鼠以100yg 0VA混合物接种。它们未进行照射。
[0332] 4.0VA 10yg PCI:小鼠以10yg 0VA+150yg TPCS2a混合物接种。如上所述进行照射。
[0333] 5.CpG OVA:小鼠以10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸混合物接种。它们未进 行照射。
[0334] 6.CpG 0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg 0DN2395 CpG寡核苷酸+150yg TPCS2a混合 物接种。如上所述进行照射。
[0335] 7.Poly(IC)0VA:小鼠以10yg 0VA+50yg Poly(IC)混合物接种。它们未进行照射。
[0336] 8.Poly(IC)0VA/PCI:小鼠以 10yg 0VA+50yg Poly(IC)+150yg TPCS2a混合物接种。 如上所述进行照射。
[0337] 图5A显示了实验组的平均值(总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％)。可以看 出CpG和Poly(IC)佐剂在单独使用时均有仅很一般(CpG)或不明显(Poly(IC)的效果，并且 PCI在单独使用时明显比这些佐剂中任一种更有效。然而，当PCI与CpG或Poly(IC)组合使用 时刻观察到明显的协同效果，并且组合PCI+Poly (1C)最突出。
[0338] 图5B示出了SIINFEKL肽重刺激脾细胞后，干扰素-y (IFN-y )ELISA的结果。首先， 可以看出IFN-y的产生完全依赖于重刺激(未刺激的细胞的条勉强可见），表明这种产生具 有严格的抗原特异性。还可以看出，虽然来自CpG或Poly(IC)组的细胞实际上没有效果（单 独0VA也没有效果），但在所有的PCI治疗组中可观察到再刺激的强效果，再次在PCI+CpG和 PCI+Poly(IC)组中可以观察到协同效应，后者代表了更好的组合。
[0339] 对于实施例4至16，采用了以下材料和方法：
[0340] 动物
[0341] C57BL/6小鼠购自Harlan(Horst，荷兰）DCD8T-细胞受体转基因0T-1小鼠 (B6 ? 129S6_Rag2tmlFwa Tg(TcraTcrb) 1 lOOMjb)购自 Taconic Europe(Ry，丹麦）或购自 Jackson Laboratories(Bar Harbor，Maine) qOT-ICDST细胞识别卵清蛋白的H_2Kb_限制表 位511即￡此(0￥4，&&257-264)。所有小鼠保持在5??条件下，所进行的程序得到瑞士和挪威 兽医管理结构的批准。
[0342] 材料和细胞
[0343] 鸡0VA购自Sigma-Aldrich(Buchs，瑞士），SIINFEKL肽购自EMC Microcollections (Tuebingen，德国），并且TRP-2 (序列SVYDFFVWL)、gp 100 (序列KVPRNQDWL)和HPV 16 E7 (序 列GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR，下划线为CD8表位）获自United Peptides (此^1(1〇11，￥4)。？〇17(1〇、0口6寡核苷酸00似395、]\031^-3]\1、咪喹莫特和雷西莫特来自 InvivoGen(San Diego，美国）。光敏化剂二磺酸四苯基二氢卟吩(TPCS2a)购自PCI Biotech (1^881?51'，挪威）。
[0344] SIINFEKL、TRP_2和HPV五聚体购自Proimmune(0xford，英国）（Proimmune肽编码分 别为093、185和5021〇。
[0345] 带有获得性转移的0T-1细胞的小鼠的皮内光敏化和免疫
[0346] 在免疫前一天，从雌性0T-1小鼠体内分离脾脏和淋巴结，从均化细胞悬浮液中通 过裂解（Sigma-Aldrich的RBC裂解缓冲液Hybri-Max)移除红细胞。剩余的细胞在PBS中洗 涤，通过70mi尼龙粗滤器过滤，通过静脉注射将2X10 6个0T-1细胞注射给受体雌性C57BL/6 小鼠；SIINFEKL特异性CD8T细胞的适应性转移有助于通过流式细胞术检测免疫应答。1天或 8小时后，通过尾部放血对小鼠采血，将血收集在含有肝素的管中用于分析0VA特异性⑶8T 细胞的基线频率。
[0347] 对于皮内免疫，将小鼠腹部区域剃毛，并且使用带有29G针头的注射器皮内注射疫 苗，所述疫苗由0VA或者由OVA、TPCS 2a和不同佐剂的混合物组成。疫苗保持避光，并在制备后 60分钟内使用。该疫苗在腹部中线的左侧和右侧分两次注射施用，每次50yl。疫苗注射后18 小时，通过腹膜内注射氯胺酮(25mg/kg体重)和赛拉嗪(425mg/kg)的混合物将小鼠麻醉，并 根据各实验如以下所述进行照射。
[0348] 在第7天，小鼠经尾放血采血，并通过裂解去除红细胞，之后通过流式细胞术分析 抗原特异性CD8+T细胞。在实验结束时(第14天），小鼠处以安乐死，并离体分析脾细胞。
[0349] 正常小鼠的皮内光敏化和免疫
[0350] 将小鼠腹部区域剃毛，并且使用带有29G针头的注射器皮内注射疫苗，所述疫苗由 0VA蛋白或者不同肽抗原(在各实验中指明）、TPCS 24P不同的疫苗佐剂组成。疫苗保持避光， 并在制备后60分钟内使用。该疫苗在腹部中线的左侧和右侧分两次注射施用，每次50iU。抗 原和TPCS 2a&不同剂量使用(在各实验中指明）。在疫苗注射后的特定时刻(通常为18小时， 但在一些实验中不同），通过腹膜内注射氯胺酮(25mg/kg体重)和赛拉嗪(425mg/kg)的混合 物将小鼠麻醉，并根据各实验所述进行照射。
[0351] 在免疫小鼠后第7天(或者在一些情况下为第6天），小鼠经尾放血采血，并通过裂 解去除红细胞，之后通过流式细胞术分析抗原特异性CD8+T细胞。在一些实验中，小鼠在各 实验所规定的时间点接受多次(2或3次)免疫。在这些情况下，在免疫后6或7天取血样，并通 过如下所述的流式细胞术进行分析。
[0352] 经免疫小鼠的照射
[0353] 在一些实验中，通过以LumiSource?(PCI Biotech)照射活化TPCS2a。通常，在免疫 后18小时以LumiSource照射6分钟，但在一些实验中有如下所述的改变。在其他实验中，如 下所述使用基于LED的发蓝光照射明设备(PCI Biotech AS)，并且在一些实验中，采用PCI 652nm激光系统SN 576003二极管激光(PCI Biotech AS)进行照射。
[0354] 通过五聚体染色进行免疫应答分析
[0355] 在以抗CD8和抗CD44抗体以及与所用抗原对应的不同的五聚体对细胞染色后，通 过流式细胞术检测抗原特异性CD8T细胞的频率。通过流式细胞术测试CD44表达，从而分析 细胞的活化状态。细胞使用FACSCanto(BD Biosciences，San Jose,美国）进行分析，并使用 FlowJo8.5.2软件（Tree Star，Inc.，Ashland，0R)进行分析。
[0356] 通过ELISA分析免疫应答
[0357] 对于ELISA分析，以0.005μg/ml的SIINFEKL肽在96孔板中对2X105个脾细胞进行 再刺激。72小时后，收集上清液并通过ELISA分析IFN-y (eBioscience-根据制造商的说明 书进行）。
[0358] 实施例4:正常小鼠中以0VA和Poly (1C)进行PCI的效果
[0359] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS24P50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫动物。在免疫后18小时以 LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以SIINFEKL五聚体、CD8和 CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0360] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0361] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA接种。它们未进行照射。
[0362] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg OVA和150yg TPCS2a混合物接种并进行照射。
[0363] 4.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg OVA和50yg poly(IC)混合物接种。它们未进 行照射。
[0364] 5.0VA 200/poly(IC):小鼠以200yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC)混合物接 种并进行照射。
[0365] 图6显示了第1和第2次免疫后实验组(每组5只动物）的平均值(总⑶8+细胞中的抗 原特异性CD44+细胞％)。可以看出特别是在第2次免疫后，与仅采用poly(IC)(第4组)或仅 采用PCI(第3组)相比，PCI和poly(IC)的组合(第5组)得到了明显更好的免疫。
[0366] 实施例5:正常小鼠中以311见^此和口〇17(1〇进行?(：1的效果
[0367] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以lOOyg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第15天免疫动物。在免疫后18小时以 LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以SIINFEKL五聚体、CD8和 CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0368] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0369] 2.SIIN 100:小鼠以100yg的SIINFEKL肽免疫。它们未进行照射。
[0370] 3.SIIN 100/PCI :小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 100yg TPCS2J9混合物免疫并进行 照射。
[0371] 4.SIIN 100/poly(IC):小鼠以 100yg的SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的混合物免 疫。它们未进行照射。
[0372] 5.SIIN 100/poly(IC)/PCI:小鼠以lOOygde SIINFEKL肽/100yg TPCS2jP10yg的 Poly (1C)混合物免疫并进行照射。
[0373] 图7显示了第2次免疫后实验中各动物的值，表明通过PCI+Poly(IC)组合(第5组）， 所有动物均响应于免疫，而在其他组中仅有一只微弱响应的动物(在SIIN 100/PCI组中）。
[0374] 实施例6:正常小鼠中黑色素瘤抗原肽和poly(IC)的效果
[0375] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以TRP-2肽和gp-100肽 (各50yg)、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫动物。在免疫后18 小时以LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以TRP-2五聚体、CD8 和CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0376] 1.未治疗的TRP-2:小鼠未免疫或照射，血样以TRP-2五聚体染色。
[0377] 2.TRP-2/poly(IC):小鼠以TRP-2和gplOO肽和 10yg poly(IC)的混合物免疫。它们 未进行照射。血样以TRP-2五聚体染色。
[0378] 3.TRP-2/PCI:小鼠以TRP-2和gplOO肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并进行照射。 血样以TRP-2五聚体染色。
[0379] 4.TRP-2/poly(IC)/PCI:小鼠以 TRP-2 和 gplOO 肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并进行照射。血样以TRP-2五聚体染色。
[0380]图8显示了第2次免疫后TRP-2五聚体染色实验组的平均值（总⑶8+细胞中的抗原 特异性CD44+细胞％ )。可以看出，当TRP-2抗原与单独的poly(IC)(第2组）或与单独的PCI (第3组)使用时，在抗原特异性细胞中没有观察到超过未治疗动物中所观察到的明显响应。 相比之下，poly(IC)和PCI的组合(第4组)产生了明确的协同效果，使得抗原特异性⑶8+T细 胞数量显著增加。
[0381] 实施例7:正常小鼠中提供红光照射分析以0VA和poly(IC)进行的PCI
[0382] 如"材料和方法"中对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以lOyg或 100yg 0VA蛋白、150yg TPCS24P10或50yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫动物。 以PCI 652nm激光系统SN576003二极管激光器，通过以0.81mW/cm2光通量递送的0.3J/cm2的 光剂量进行照射（即，照射时间约6分钟）。每次免疫后第7天的血样以SIINFEKL五聚体、CD8 和CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0383] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0384] 2.0VA 10:小鼠以10yg的0VA免疫。它们未进行照射。
[0385] 3.0VA 100:小鼠以100yg的0VA免疫。它们未进行照射。
[0386] 4.0VA 10/红光PCI:小鼠以10yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并进行照射。
[0387] 5.0VA 100/红光PCI:小鼠以100yg 0VA和150yg TPCS2a混合物免疫并进行照射。
[0388] 6.0VA 10/红光 PCI+poly(IC):小鼠以 10yg 0VA、150yg TPCS24P50yg poly(IC) (第1次疫苗接种)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次疫苗接种)混合物免疫，并进行照射。
[0389] 7.0VA 100/红光PCI+poly(IC):小鼠以 100yg 0VA、150yg TPCS2jP50yg poly(IC) (第1次免疫)或1 〇yg P〇ly(ic)(第2次免疫)混合物免疫，并进行照射。
[0390] 图9显示了第1和第2次免疫后红光照射以激活光敏化剂的实验组的平均值(总⑶8 +细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％)。可以看出，对于10yg的0VA抗原，需要poly(IC)和PCI (第6组)的组合来实现免疫应答，单独的抗原或抗原与PCI组合(第4组)未获得免疫效果。对 于100yg的0VA抗原，单独的抗原稍有效果(第3组），但poly(IC)+PCI组合(第7组）的效果明 显更好。
[0391] 实施例8:正常小鼠中以SIINFEKL和poly (1C)进行PCI的分析
[0392] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以50yg SIINFEKL肽、 100yg TPCS24P10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫动物。在免疫后18小时以 LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以SIINFEKL五聚体、CD8和 CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0393] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0394] 2.SIIN 50:小鼠以50yg的SIINFEKL肽免疫。它们未进行照射。
[0395] 3.SIIN 50/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100yg TPCS2J9混合物免疫并进行照 射。
[0396] 4.SIIN 50/poly(IC):小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 10yg poly(IC)的混合物免 疫。它们未进行照射。
[0397] 5.SIIN 50/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg TPCS24P10yg的Poly (1C)的混合物免疫并进行照射。
[0398]图10显示了第1次(第7天)和第2次（第21天)免疫后实验组的平均值（总⑶8+细胞 中的抗原特异性CD44+细胞％)(误差条为平均值的标准误差）。可以看出，poly(IC)和PCI的 组合(第5组)产生了强免疫应答，而在其它任何组都没有观察到应答。poly(IC)+PC组合因 此产生了强协同效果。
[0399] 实施例9:正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)进行PCI的分析
[0400] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以lOOiig SIINFEKL肽/ 150yg TPCS2JP50yg poly(IC)(后者仅在第1次免疫中使用）的混合物在第0天和第14天免 疫动物。在免疫后18小时以LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样 以SIINFEKL五聚体、⑶8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。在第28天，处 死动物，收集脾脏并以SIINFEKL肽再刺激脾细胞并按照方法中所述通过ELISA进行分析。包 括以下实验组：
[0401] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0402] 2. 2XSIIN 100:小鼠在两次免疫中均以100yg的SIINFEKL肽免疫。它们未进行照 射。
[0403] 3. 2XSIIN 100/PCI:小鼠在两次免疫中均以 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2a 免疫，并进行照射。
[0404] 4. 1XSIIN 100/poly(IC)/lXSIIN 100:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽和 50yg P〇ly(IC)的混合物(第1次免疫)免疫;和100yg的SIINFEKL肽(第2次免疫)免疫。它们未进行 照射。
[0405] 5. 1XSIIN 100/poly(IC)/PCI;lXSIIN 100/PCI:小鼠以 100yg 的 SIINFEKL 肽、 150yg TPCS24P50yg poly(IC)的混合物(第 1次免疫)免疫;和 100yg的SIINFEKL肽和 150yg TPCS2j^混合物(第2次免疫)免疫。它们在两次免疫中均进行照射。
[0406]图11显示了第1次(第7天)和第2次(第21天)免疫后实验组的平均值(总⑶8+细胞 中的抗原特异性⑶44+细胞％)。可以看出，poly(IC)和PCI的组合(第5组)给出了非常好的 免疫应答，即使该组合仅用于第1次免疫而第2次免疫仅使用PCI时也是如此。
[0407]图12显示如图中所示以SIINFEKL肽进行再刺激或未进行再刺激的脾细胞中的平 均ELISA值。可以看出，当第5实验组(第1次免疫以PCI和poly(IC)组合进行;第2次免疫仅以 PCI进行）中进行的治疗引起了再刺激后干扰素-Y产生的显著提高时，在任何其它实验组 中未观察到此情况。
[0408] 实施例10 :MPLA或咪喹莫特效果的分析
[0409] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以200yg 0VA蛋白、lOOy g TPCS2a和50yg咪喹莫特或10yg MPLA-SM的混合物在第0天和第14天免疫动物。在免疫后 18小时以LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以SIINFEKL五聚 体、⑶8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0410] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0411] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它抹进行照射。
[0412] 3.0VA 200/PCI:小鼠以200yg 0VA和100yg TPCS2d^混合物免疫并进行照射。
[0413] 4.0VA 200/咪喹莫特:小鼠以200yg 0VA和50yg咪喹莫特的混合物免疫。它们未进 行照射。
[0414] 5.0VA 200/咪喹莫特/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P50yg咪喹莫特的混 合物免疫，并进行照射。
[0415] 6.0VA 200/MPLA:小鼠以200yg 0VA和10yg MPLA-SM的混合物免疫。它们未进行照 射。
[0416] 7.0VA 200/MPLA/PCI:小鼠以200yg 0VA、100yg TPCS24P10yg MPLA-SM的混合物 免疫，并进行照射。
[0417] 图13显示了第1和第2次免疫后实验组(每组5只动物，误差条是标准偏差）的平均 值(总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞的％ )。可以看出，对于咪喹莫特(第5组)和MPLA 佐剂(第7组），当均使用0VA蛋白作为抗原时，与仅使用佐剂实现的效果(分别为第4组和第6 组)相比与PCI组合引发了明显更好的免疫效果。
[0418] 实施例11:在正常小鼠中以SIINFEKL和poly(IC)进行PCI、第3次免疫后的记忆应 答
[0419] 如"材料和方法"中对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2a和10yg ?〇17(1〇的混合物在第0天和第14天免疫动物。通过 poly (IC)+PCI治疗在第51天以第3次免疫测试免疫记忆的产生。在免疫后18小时以 LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或 第6天(第3次免疫）的血样以SIINFEKL五聚体、CD8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞 术进行分析。包括以下实验组：
[0420] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0421] 2.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前两次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它们未进行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠进行照射。
[0422] 3.SIIN50Poly(IC)+PCI/SIIN 50PCI:在前两次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL 肽、l〇〇yg的TPCSdPlOyg的poly(IC)免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和100 yg的TPCS 2a免疫。小鼠在三次免疫中均接受照射。
[0423] 图14显示了三次免疫中每一次后实验组的值（总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+ 细胞％)。可以看出，P〇ly(IC)和PCI的组合引发了非常强的免疫应答，由第3次免疫导致应 答显著增加，即使仅以PCI进行第3次免疫时也是如此(第3组）。相反，当在前两次免疫中仅 采用poly(IC)时，实际上没有免疫应答，并且以poly(IC)+PCI进行第3次免疫未将免疫增强 至任何有效程度。将图11和图12中所示结果一同考虑，所示结果表明对于肽抗原，poly(IC) 和PCI的组合是必需的，并且足以引发免疫应答，但该免疫应答后续可仅以PCI进行增强。反 过来，单独的poly(IC)不能引发免疫应答，即使在以poly(IC)进行两次免疫后也不能引发 免疫应答，并且未观察到免疫应答，以p〇ly(IC)+PCI进行第3次疫苗接种尝试增强该应答没 有成功，表明单独的poly(IC)完全不能引发免疫应答。数据还显示以poly(IC)+PCI组合产 生的免疫应答是持久的，这是因为其可被在第2次免疫后的第37天给予的第3次免疫大大增 强。
[0424] 实施例12:正常小鼠中以HPV肽抗原和poly (1C)进行PCI的效果
[0425] 如"材料和方法"中对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以50yg HPV 或SIINFEKL肽抗原、100yg TPCS2JP10yg poly(IC)的混合物在第0天和第14天免疫动物。动 物如以下规定在第7、14和51天接受3次免疫。在免疫后18小时以LumiSource照明设备进行6 分钟照射。各次免疫后第8天(第1次免疫）、第7天(第2次免疫)或第6天(第3次免疫）的血样 以HPV或SIINFEKL五聚体、⑶8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以 下实验组：
[0426] 1.未治疗SIIN:小鼠未被免疫或照射。血样以SIINFEKL五聚体染色。
[0427] 2.未治疗HPV:小鼠未被免疫或照射。血样以HPV五聚体染色。
[0428] 3.SIIN50Poly(IC)/Poly(IC)+PCI:在前两次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽和 l〇yg的P〇ly(IC)免疫。它们未进行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的SIINFEKL肽、100yg 的TPCS 2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠进行照射。
[0429] 4. HPV 50:小鼠在所有三次免疫中均以50yg的HPV肽免疫。小鼠未被照射。
[0430] 5.HPV 50/PCI/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前两次免疫中，小鼠以50yg的HPV 肽和100yg的TPCS2a免疫。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、100yg的TPCS 24P10yg的 P〇 ly (1C)免疫。小鼠在所有三次免疫中均照射。
[0431] 6.HPV 50/Poly(IC)/HPV 50poly(IC)+PCI(第3次）：在前两次免疫中，小鼠以50yg 的HPV肽和10yg的poly(IC)免疫。它们未进行照射。在第3次免疫中，小鼠以50yg的HPV肽、 100y g的TPCS2JP1 Oyg的po 1 y (IC)免疫。小鼠进行照射。
[0432] 图15显示了三次免疫后实验组的（总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％ )。可 以看出，在第6组中，引起了HPV特异性免疫应答，其量级与在相同免疫条件下以SIINFEKL肽 (第3组)取得的免疫应答相同。这表明PCI和p 〇ly(IC)组合还可有效引起针对病毒和癌症相 关HPV E7抗原的免疫应答，并且PCI+Poly(1C)引起了针对长的肽抗原(35个氨基酸)的免疫 应答，这可能需要其以MHC I类呈递之前细胞内摄入和蛋白水解加工。与此相反的是 SIINFEKL和黑色素瘤肽抗原，它们可不经过加工就呈递。
[0433] 实施例13:照射时机的影响
[0434] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以200yg 0VA蛋白、150y g TPCS^PlOyg的poly(IC)在第0天和第14天免疫动物。在所有组中，TPCS2a在照射之前18 小时注射，而0VA抗原和poly (1C)或者在照射之前18小时与TPCS2Jg合注射，或者在照射前2 小时单独注射。以L u m i S 〇 u r c e照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以 SIINFEKL五聚体、CD8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验 组：
[0435] 1.未治疗:小鼠未免疫或照射。
[0436] 2.0VA 200:小鼠以200yg的0VA免疫。它们并未接受TPCS2a并且未进行照射。
[0437] 3.0VA 200 PCI(2h):小鼠在照射前18小时注射TPCS2a，并在照射前2小时以200yg 的OVA免疫。
[0438] 4.0VA 200 PCiaSh):小鼠在照射前 18小时以TPCSdPOVA免疫。
[0439] 5.0VA 200 PCI P(IC)(2h):小鼠在照射前18小时注射TPCS2a，并在照射前2小时以 200yg的0VA+10yg Poly(IC)免疫。
[0440] 图16显示了第1和第2次免疫后实验组(每组5只动物，误差条是标准偏差）的平均 值（总CD8+细胞中抗原特异性CD44+细胞的％ )，可以看出，当仅在照射前2小时施用抗原+ poly(IC)时，免疫应答被poly(IC)+PCI组合增强。
[0441 ] 实施例14:正常小鼠中以SIINFEKL肽和poly(IC)进行PCI的效果(通过三次免疫比 较PCI+poly(1C)和poly(1C))
[0442]如以上材料和方法中对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。如以下规定以50yg SIINFEKL肽和100yg TPCS2a和10yg poly(IC)的混合物在第0天、第14天和第42天免疫动 物。在免疫后18小时以Lumi Source照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第7天的血样以 SIINFEKL五聚体、CD8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验 组：
[0443] 1.未治疗SIIN:鼠未免疫或照射，血样以SIIN五聚体染色。
[0444] 2.SIIN/poly(IC):小鼠以50yg SIINFEKL肽和 10yg poly(IC)的化合物免疫三次。 它们未进行照射。
[0445] 3.SIIN/poly(IC)/PCI:小鼠以50yg SIINFEKL肽、100yg TPCS2jP10yg poly(IC) 的混合物免疫并进行照射。
[0446]图17显示了三个实验组中典型动物第3次免疫后的流式细胞术点状图，清楚表明 由poly(IC)+PCI组合引起了非常强的应答。
[0447] 图18显示了3次免疫中每一次后的平均值（总⑶8+细胞中抗原特异性⑶44+细胞 的％)。可以看出，PCI+Poly(IC)组合引发了非常强的免疫应答，导致第3次免疫后的血样中 有约30%的抗原特异性CD8T细胞。相比之下，仅以抗原和poly(IC)佐剂进行3次免疫只产生 了非常小的效果(第3次免疫后0.28%阳性细胞）。
[0448] 实施例15:正常小鼠中以HPV长肽抗原和poly (1C)进行PCI的效果
[0449] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。H P V 1 6 E 7序列 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR用作"长"肽抗原。以550yg HPV长肽抗原、100yg TPC&JPlOyg p〇ly(IC)(以下规定的p(IC))的混合物在第0天和第14天免疫动物。如以下规 定在第7和14天对动物进行2次免疫。在免疫后18小时以LumiSource照明设备进行6分钟照 射。每次免疫后第6天的血样以HPV五聚体、CD8和⑶44抗体染色，并按所述通过流式细胞术 进行分析。包括以下实验组：
[0450] 1.2 X HPV:小鼠以50yg HPV长肽免疫两次。小鼠未进行光照。
[0451 ] 2.2XHPV+p(IC):小鼠以50yg HPV长肽和10yg poly(IC)的混合物免疫两次。小鼠 未进行光照。
[0452] 3.2XHPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV长肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j^g 合物免疫两次。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0453] 4.1:册￥+口（1〇+卩(：1.2:冊￥+?(：1:小鼠以50吨册￥长肽、10辟口〇17(1〇和100辟 TPCS 2a的混合物免疫(第1次免疫），并以50yg HPV长肽和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次 免疫）。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0454] 5.1:HPV+PCI.2:HPV+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV长肽和 100yg TPCS2j^g合物免 疫(第1次免疫），并以50yg HPV长肽、10yg poly(IC)和100yg TPCS2a的混合物免疫(第2次免 疫）。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0455] 图19显示了两次免疫后实验组的（总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％)。可 以看出，与未采用PCI的实验组(第1和2组)相比，在第3组中（以PCI+p(IC)组合免疫两次）弓丨 发了强HPV特异性免疫应答，而在第4和5组中（以PCI+p(IC)组合免疫一次，以仅PCI免疫一 次)观察到了较弱但仍显著的免疫应答。这表明PCI和poly(IC)组合可有效引起针对病毒和 癌症相关HPV E7抗原的免疫应答，并且以该组合进行两次免疫更有效:一次该组合免疫，结 合一次仅以PCI进行的免疫。还表明对于HPV长肽抗原，当不与PCI组合使用时，p(IC)佐剂无 效。
[0456] 实施例16:正常小鼠中以HPV短肽抗原和poly (1C)进行PCI的效果
[0457] 如以上对正常小鼠疫苗接种所述进行该实验。HPV 16 E7 CD8表位RAHYNIVTF用作 "短"肽抗原。以50yg HPV短肽抗原、100yg TPCSdPlOyg poly(IC)(以下规定的p(IC))的混 合物在第〇天和第13天免疫动物。如以下规定在第7和13天对动物进行2次免疫。在免疫后18 小时以LumiSource照明设备进行6分钟照射。每次免疫后第6天的血样以HPV五聚体、CD8和 CD44抗体染色，并按所述通过流式细胞术进行分析。包括以下实验组：
[0458] 1.未治疗:小鼠未免疫后照射。
[0459] 2. 2XHPV短:小鼠以50ygHPV短肽免疫两次。小鼠未进行光照。
[0460] 3. 2XHPV短+p(IC):小鼠以50yg HPV短肽和10yg poly(IC)的混合物免疫两次。 小鼠未进行光照。
[0461 ] 4. 2XHPV短+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9混合物 免疫两次。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0462] 5. 2XHPV短+p(IC)+PCI:小鼠以50yg HPV短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2j9 混合物免疫两次。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0463] 6. 1:HPV 短+p(IC)+PCI.2:HPV 短+PCI:小鼠以 50yg HPV 短肽、10yg poly(IC)和 100yg TPCS2a的混合物免疫（第1次免疫），并且以50yg HPV短肽和100yg TPCS2a的混合物免 疫(第2次免疫）。小鼠在两次免疫中均进行照射。
[0464] 图20显示了两次免疫后实验组的（总⑶8+细胞中的抗原特异性⑶44+细胞％+/-SEM)〇
[0465] 可以看出，在以p(IC)+PCI组合免疫的两组(第5和6组）中引发了显著免疫应答，在 将该组合用于两次免疫的第5组中实现了更好的效果。相比之下，在仅采用p(IC)或仅采用 PCI进行两次免疫的组中，未观察到免疫应答(与未治疗组(第1组)和仅以抗原免疫的动物 (第2组)相比）。这表明PCI和poly(IC)组合可有效引起针对病毒和癌症相关HPV E7抗原（当 其作为短肽递送时）的免疫应答，并且与单独的P(IC)或单独的PCI相比，以p(IC)+PCI组合 进行两次免疫产生了强协同效果。
【主权项】
1. 一种在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分的方法，所述方法包括使所述细胞接 触所述抗原分子、光敏化剂、和TLR配体，并用有效活化所述光敏化剂的波长的照射所述细 胞，其中，所述抗原分子被释放到所述细胞的胞浆中，且所述抗原分子或其一部分随后呈递 在所述细胞的表面上。2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR1配体，优选三酰脂肽。3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR2配体，优选脂聚糖，优选脂多糖， 优选来自牙龈卟啉单胞菌。4. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR3配体，优选双链RNA分子，优选 Poly(I:C)〇5. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR4配体，优选脂多糖、例如来自埃 希氏大肠杆菌或明尼苏达沙门氏菌的脂多糖，或单磷酰脂A(MPLA)、例如来自明尼苏达沙门 氏菌的MPLA;优选MPLA。6. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR5配体，优选鞭毛蛋白。7. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR6配体，优选二酰脂肽。8. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR7配体，优选式（1)的咪唑并喹啉 化合物或其药学可接受的盐，其中，R:是氨基烷基，且心可选地取代有例如羟基，并且R2是烷基，且R2可选地间插有氧 或氮基团，其中，优选的是 Ri 是 N-CH2-C(CH3)2-R3; R2 是-ch2-x-ch2ch3 或氢原子； R3是0H或氢原子，并且 X是0或NH。9. 如权利要求8所述的方法，其中，所述咪挫并喹啉化合物选自雷西莫特、咪喹莫特和 嘎德莫特或其药学可接受的盐。10. 如权利要求8所述的方法，其中，所述TLR7配体是单链RNA分子，优选ssPolyU，优选 长度为20至200个核苷酸。11. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR8配体，优选ssPolyU分子。12. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR9配体，优选CpG寡核苷酸，CpG寡 核苷酸是6个至50个碱基的单链寡核苷酸，其包括至少一个CpG基序和各处于所述基序的3' 和5'侧的至少一个碱基。13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸包含长度为8至16个碱基的回文 序列。14. 如权利要求12所述的方法，其中，所述CpG寡核苷酸具有以下序列： 5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-S'或57-tccatgacgttcctgacgtt_3〇15. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR11配体或TLR12配体，优选抑制 蛋白。16. 如权利要求1所述的方法，其中，所述TLR配体是TLR13配体，优选长度为5至30个核 苷酸的RNA分子，其中，优选的是RNA分子包括序列CGGAAAGACC。17. 如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述抗原分子是能够刺激免疫应答 的分子，优选疫苗抗原或疫苗组分。18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述抗原呈递引起对免疫应答的刺激。19. 如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或离体进行。20. 如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述光敏化剂选自TPCS2a、AlPcS2a、 TPPS4 和 TPBS2a、优选 TPCS2a。21. 如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述抗原分子是肽，优选黑色素瘤肽 或人乳头瘤病毒(HPV)肽。22. 如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，所述细胞是抗原呈递细胞，优选树突 细胞。23. 如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述细胞同时、分别或依次地接触所 述抗原分子、光敏化剂和TLR配体。24. -种在受试者中产生免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用权利要求 1、17或21所述的抗原分子、权利要求1或20所述的光敏化剂、和权利要求1至16中任一项所 述的TLR配体，并用有效活化所述光敏化剂的波长的照射所述受试者，其中，产生了免疫应 答。25. 如权利要求24所述的方法，其中，所述方法是疫苗接种方法。26. 如权利要求24或25所述的方法，所述方法用于治疗或预防疾病、病症或感染，优选 癌症，优选黑色素瘤或与乳头瘤病毒相关的癌症。27. 如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物，优选猫、 狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，最优选的是受试者是人。28. 如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，所述抗原分子、光敏化剂和TLR配体 同时、分别或依次地施用于所述受试者。29. -种药物组合物，其包括权利要求1、17或21所述的抗原分子、权利要求1或20所述 的光敏化剂、和权利要求1至16中任一项所述的TLR配体，以及一种或多种药学可接受的稀 释剂、载剂或赋形剂。30. -种在表面上表达抗原分子或其一部分的细胞或细胞群，所述细胞可通过权利要 求1至23中任一项所述的方法获得，其中，优选的是所述细胞是树突细胞。31. -种药物组合物，其包括权利要求30所述的细胞或细胞群，以及一种或多种药学可 接受的稀释剂、载剂或赋形剂。32. 用于预防或治疗应用的权利要求30所述的细胞或细胞群、或权利要求29或31所述 的组合物。33. 用于刺激受试者体内免疫应答的权利要求30所述的细胞或细胞群、或权利要求29 或31所述的组合物，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接 种和/或用于治疗或预防癌症。34. 权利要求30所述的细胞群、或权利要求29或31所述的组合物在制备药物中的应用， 所述药物用于刺激受试者体内免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或 感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症。35. 如权利要求34所述的应用，其中，所述刺激、治疗或预防包括施用所述药物给所述 受试者。36. 用于预防或治疗应用的权利要求1、17或21所述的抗原分子、权利要求1或20所述的 光敏化剂、和权利要求1至16中任一项所述的TLR配体。37. 用于权利要求36所述应用的抗原分子、光敏化剂和TLR配体，其用于刺激受试者体 内免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/ 或用于治疗或预防癌症，其中，优选的是所述应用包括权利要求1至28中任一项所述的方 法。38. 用于权利要求36或37所述应用的抗原分子、光敏化剂和权利要求1至16中任一项所 述的TLR配体，其中，所述应用包括权利要求1至23中任一项所述的方法以制备细胞群，其 中，优选的是所述细胞是树突细胞。39. 用于权利要求38所述应用的抗原分子、光敏化剂和试剂，其中，所述细胞群将施用 给所述受试者。40. 权利要求1、17或21所述的抗原分子、和/或权利要求1或20所述的光敏化剂、和/或 权利要求1至16中任一项所述的TLR配体在制备药物中的应用，所述药物用于刺激受试者体 内免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/ 或用于治疗或预防癌症，其中，优选的是所述免疫应答通过权利要求24至28中任一项所述 的方法来刺激。41. 如权利要求40所述的应用，其中，所述药物包括能通过权利要求1至23中任一项所 述的方法获得的在所述细胞的表面上表达抗原分子或其一部分的细胞群，用于施用给所述 受试者。42. 如权利要求41所述的应用，其中，将所述抗原分子和/或光敏化剂和/或TLR配体用 于权利要求1至23中任一项所述的方法中，以获得用于制备所述药物的所述细胞群。43. -种产品，其包括权利要求1、17或21所述的抗原分子、权利要求1或20所述的光敏 化剂、和权利要求1至16中任一项所述的TLR配体作为组合制剂，以同时、分别或依次使用来 刺激受试者体内免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的疾病、病症或感染，优选用于 疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，或用于根据权利要求1至28中任一项所述的方法在细 胞的表面上表达抗原分子或其一部分。44. 一种试剂盒，其用于刺激受试者体内免疫应答，优选用于治疗或预防所述受试者的 疾病、病症或感染，优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症，或用于根据权利要求1至 28中任一项所述的方法在细胞的表面上表达抗原分子或其一部分，所述试剂盒包括： 第一容器，其包含权利要求1或20所述的光敏化剂； 第二容器，其包含权利要求1、17或21所述的所述抗原分子;和 第三容器，其包含权利要求1至16中任一项所述的TLR配体。45. -种用于在受试者体内产生免疫应答、优选治疗或预防所述受试者的疾病、病症或 感染、优选用于疫苗接种和/或用于治疗或预防癌症的方法，所述方法包括根据权利要求1 至23中任一项所述的方法制备细胞群，并随后将所述细胞施用给所述受试者。
【文档编号】C12N5/0784GK105873585SQ201480057929
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年8月28日
【发明人】A·霍格赛特, P·约翰森
【申请人】Pci生物技术公司