自体肿瘤疫苗和方法

自体肿瘤疫苗和方法
【专利摘要】提供了自体抗癌症疫苗以及制造和治疗的方法，其包括在免疫受损的(多个)动物中扩增个体患者衍生的肿瘤细胞以定量和定性地获得用于有效的疫苗生产和利用的足够材料，从而在肿瘤切除后的个体患者中引发针对微转移和/或复发的免疫反应。
【专利说明】
自体肿瘤疫苗和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及自体癌症疫苗以及用于产生和使用可注射疫苗剂量的方法，所述可注 射疫苗剂量包含用于个性化治疗的免疫原性和代谢活性但非致瘤性的细胞。
【背景技术】
[0002] Finke等人的2007年综述（Vaccine 2007;25(Suppl 2) :B97-109;PMID: 17916465) 区分了作为独立实体的主动免疫治疗"癌症疫苗"和采用免疫刺激剂或单克隆抗体的被动 免疫治疗。这一分析表明，使用预定的研究群体来评估表达选择的靶标的肿瘤的比例和表 达其的每个肿瘤中的细胞的比例是重要的。作者关注适当的抗原发现，想法是可以在不同 的肿瘤内和之间发现有意义的共性，即，可以表征和利用肿瘤间和肿瘤内的抗原均质性。
[0003] Wood等人（"The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers/'Science 2007)提出这样的问题："有多少基因在人类肿瘤中突变"？为了解决这 个问题，作者分析了 18,191个人类基因的20,857个转录物的序列。在典型的乳腺癌或结肠 直肠癌中，存在~80种DNA突变，其导致氨基酸改变。无论功能如何，所有这些突变蛋白质代 表肿瘤特异性抗原的候选物，因为它们表示与免疫系统先前识别为"自我"的个体基因蓝图 的有意义的区别。虽然乳腺癌和结直肠癌中的突变基因的数目是相似的，然而突变的具体 基因和类型是相当不同的。在个体肿瘤的约80种突变中，其中只有三种是常见的或有意义 地代表给定的肿瘤群体。甚至更重要的是，在显著数目的肿瘤中同时发现这三种突变的概 率是非常低的。
[0004] 因此，针对恶性疾病的高度有效的预防性或治疗性免疫反应需要可适应的系统。 这不可能通过预制的同种异体细胞或依靠少量"现成的"普通抗原的任何系统实现。需要能 够处理癌症多样性程度的组合物和治疗方法。
[0005] 虽然发现这些结果的测序技术是比较新的，然而现象学的数据早已证明，肿瘤异 质性一直是治疗的显著障碍。在1977年，Fidler等人(Science ,197:4306893-895)报道了在 移植瘤中发现了表型异质性。从恶性黑色素瘤细胞的亲本培养物体外衍生的克隆在同系小 鼠的肺中产生转移集落的能力变化很大。
[0006] 在此期间，本发明人和同事的调查（Hanna MG Jr等人，Cancer Res 38:204 (1978);Hanna M.G. Jr ?等人，Immunotherapy of Human Cancer,Raven Press( 1978) ,pp 1 l_129;Hanna M.G.Jr?等人，Immunobiology and Immunotherapy of Cancer, ff. D. T erry, Y.Yamamura，eds.，Elsevier/No;rth Holland(1979),pp 331-350;和Hanna M.G.Jr.等人， Cancer Immunol Immunother，7:165(1979))已经确定先天免疫系统具有接纳和对抗肿瘤 异质性的适应潜力，具有一定的限制。这些研究，在L10豚鼠中执行，表明在手术切除实体瘤 之后可以教育免疫系统以控制全身性肿瘤负荷。
[0007] 免疫系统不断地针对一系列的致命外来病原体，病毒和蛋白质提供保护。毫无疑 问，针对传染病的预防接种代表了现代医学的最重要进步之一。然而，这种成功需要以非常 特定的方式训练免疫系统的技术的进步。最有效的疫苗瞄准稳定的并且很少表现出随时间 变化的抗原变化的传染性病原体。因此，可以设计和广泛部署单一的产品，其解决全部范围 的给定疾病。与此相反，流感、丙型肝炎、艾滋病和癌症代表更加困难的挑战，因为它们是抵 制类似的单一疗法的高度适应的实体。
[0008] 自体癌症疫苗代表免疫培训的下一个演进，以抵抗恶性疾病。然而，该领域取得进 展的一个主要障碍是缺乏足够的接种疫苗材料来引发适当的抗肿瘤反应。对于许多癌症， 患者的原发性肿瘤往往太小从而不能提供足够数量的细胞来创建能够产生有效的免疫治 疗反应的疫苗。
[0009] 癌症疫苗主要用于治疗晚期、播散性疾病。我们现在了解到晚期肿瘤有通过创造 免疫抑制环境来逃避免疫检测的能力。在晚期肿瘤中经常发现免疫效应细胞;然而，它们表 现出"疲惫的(exhausted)"表型并且不起作用。因此，采用均质的工具来治疗晚期疾病的多 数癌症疫苗已在临床试验中失败。更有效的方法是瞄准手术后留下的微小残留病灶以根除 留下的细胞，否则其会继续增长并最终杀死患者。
[0010] 微转移瘤或肿瘤细胞接种是癌细胞的极小集合，其往往导致疾病复发。不幸的是， 通过常规方法在手术过程中检测不到这些细胞。这些病变通过分子技术，如聚合酶链反应 (PCR)检测，并且已经在54%的II期结肠癌患者的区域淋巴结中发现。后续分析已经确定无 PCR可检测转移瘤的患者具有91 %的经调整的5年生存率，而50 %的具有微转移瘤的患者将 在同一时间周期内死亡(P = 〇.02)。这是一个需要加以解决的显著的公共健康问题。
[0011]在手术切除后用于防止复发的第一个自体结肠癌疫苗是OncoVAX?。大约25% ~35%的诊断为II期(T3，T4A&B)结肠癌的患者将复发转移性疾病，尽管进行了积极的手术 切除。采用化疗药物的辅助治疗没有在这些患者中表现出显著的治疗益处。该患者特异性 疫苗目前正在由l^DA的特殊试验方案评价(Special Protocal Assessment)和快车道地位 (Fast Track designation)批准的III期试验中进行评价。OliCOVAX?是利用患者的活 的，代谢活跃的肿瘤细胞来调动机体的免疫系统以便预防手术后结肠癌复发的自体疫苗。 在四次注射方案(二次具有佐剂TICE-BCG，另两次没有)后，II期结肠癌患者的复发风险从 三分之一下降到十分之一 Jermorken等人，Lancet，353(9150)，1999。
[0012]患者特异性疫苗是相对于标准化疗和辐射物理疗法的显著改进。在现代化疗方案 中使用的细胞毒性剂不主动地区分正常和癌性细胞。这样的方法依赖于快速分裂的细胞对 DNA交联和微管抑制机制的固有敏感性。然而，快速分裂的正常细胞对于多细胞生物是关键 的，而且阻止这些过程导致免疫抑制和其他衰弱后遗症。即使所谓的靶向剂（贝伐单抗，西 妥昔单抗等)抑制也用于正常的体内平衡的致癌途径。在这两种情况下，目前的希望是肿瘤 专家将提供足够的毒药以在杀死患者之前杀死肿瘤。与此相反，自体肿瘤疫苗可以通过引 发只针对癌细胞上的肿瘤相关抗原的特异性免疫反应来发挥靶向效应。在最近的评价 OncoVAX?的III期试验中，需要BCG治疗停止的严重不良事件是极其罕见的（8/128， 6% ) Jermorken等人，Lancet ,353(9150)，1999。此外，一旦实现肿瘤特异性免疫，免疫记忆 通过持续监视;不由化疗剂提供的机制来保护患者。Weger de VA等人的关于OncoVAX? 的后续研究(Clin Cancer Res(2012年2月1日））已经证明，在最初治疗后的15年，相比于对 照，经OncoVAX?治疗的患者仍然具有改善的无复发存活。
[0013]大的、早期的、易接近的肿瘤是结直肠疾病的独特特征。所需要的是用于定量和定 性地产生足够的肿瘤材料以制备自体疫苗组合物的方法，以及癌症免疫治疗中的相关进 步，对于所有癌，包括具有过小的实体瘤以至于不能根据先前已知的方法制备有效的疫苗 的患者。

【发明内容】

[0014] 本发明提供患者护理和癌症死亡率的显著进步。在评价OncoVAX?的最初的试 验中，我们已确定，需要至少约3.5g的肿瘤来创建四个连续的剂量用于针对微小残留疾病 的有效免疫反应。不幸的是，当大部分癌症(黑色素瘤，乳腺癌等）已经发展到3.5g时，肿瘤 负荷通常是全身性的，免疫抑制的，因此不容易受到以前的治疗方式的影响。
[0015]此外，以往的研究显著低估了肿瘤内和肿瘤间异质性的程度，其阻碍了用于癌症 疫苗开发的抗原发现。通过将癌症作为均质疾病治疗，癌症免疫学家还未充分培训患者的 免疫系统来识别个体的独特的肿瘤的丰富的外来或"非自身"组分。本发明通过进一步包含 肿瘤异质性和延伸这种技术到其他类型的癌症，尤其是具有相对小尺寸的实体瘤，来增强 自体癌症疫苗技术，否则具有相对小尺寸的实体瘤将限制其产生足够的材料作为自体疫苗 用于有意义的治疗反应或用于相关的治疗方法。
[0016] 我们已发现，针对微小残留病和手术后复发的有效免疫反应，特别是在II/III期 结肠癌中，通常需要至少两个、三个、优选四个或更多个注射剂量的自体非致瘤性细胞。此 外，理想地，每个剂量应该含有在免疫治疗性治疗方案中施用的至少0.7~1.3 X 107个肿瘤 细胞。迄今为止，这已对可以用有效的自体癌症疫苗治疗的癌症患者的类型施加了物理限 制。基于在此所讨论的新技术，具有相对小的尺寸(〈3.5克）的患者来源的原发性肿瘤现在 可以以这样的方式扩展，其为有效的免疫原性反应提供足够的材料，同时保留源病变的异 质性。
[0017] 本发明的一个方面提供了制备可注射的，自体的，包含至少约1〇7个存活的，非致 瘤性肿瘤细胞的抗肿瘤疫苗的方法，其通过从癌症患者切除实体瘤以获得患者的实体瘤组 织的至少95%，其中所切除的肿瘤组织具有小于约3.5克的重量;消化所切除的肿瘤组织以 获得解离的肿瘤细胞;将所切除的肿瘤细胞移植到免疫受损的动物中；在所述动物中增殖 肿瘤细胞以获得扩增的肿瘤组织;从所述动物中收获扩增的肿瘤组织以获得收获的肿瘤细 胞，其中所收获的肿瘤组织(单独或来自多个移植体)具有至少约3.5克的重量;施加一剂y 辐射到所收获的肿瘤细胞致使所述细胞为非致瘤性的；以及将非致瘤性的细胞和注射用药 学上可接受的载体组合来制备含有至少约1〇 7个肿瘤细胞的可注射剂量。在一个方面中，扩 增的细胞与患者的实体瘤的肿瘤细胞具有至少85%的序列同源性。在另一个方面中，可注 射的剂量包含具有至少80 %的活力的肿瘤细胞。
[0018] 在另一种情况下，该方法包括用酶或酶的组合消化所切除的肿瘤组织以获得解离 的肿瘤细胞并混合所解离的肿瘤细胞以形成均质悬浮液。制造的方法还可以包括消化所收 获的肿瘤组织以获得解离的所收获的肿瘤细胞并混合解离的所收获的肿瘤细胞以形成均 质悬浮液。
[0019] 在一个方面中，移植到所述动物的肿瘤细胞包含95-100重量％的患者的实体瘤。 在另一个方面，从动物收获的肿瘤细胞包含95-100重量％的扩增的肿瘤组织。
[0020] 自体疫苗制造的方法可进一步包括移植所收获的肿瘤组织到第二免疫受损的动 物中，在第二动物中增殖肿瘤组织，并从第二动物中收获增殖的肿瘤组织以制备含有至少 约1〇7个肿瘤细胞的可注射剂量。
[0021] 在一个方面中，动物是大鼠。在另一个中，动物是最适宜已经接收治疗，以减少自 然杀伤细胞活性或具有重症联合免疫缺陷病(SCID)的无胸腺裸小鼠。在另一方面，当移植 组织具有约3.5至4克重时，收获所述移植组织。
[0022] 自体疫苗制造方法可以进一步包括在解离之前用一定浓度的消毒液处理所收获 的肿瘤并持续一段时间，这可提供抗微生物活性，同时尽量减少细胞毒性。在另一个方面， 该方法包括通过DNA或RNA测序，流式细胞仪分析，或蛋白质组分析表征所收获的细胞的抗 原特征，以保证患者的肿瘤的异质性已被保存下来。
[0023] 在又一个方面中，所述方法还包括对所收获的细胞以足以灭活微生物，消除致瘤 性和保存细胞的活力的量施加一剂Y辐射，以获得无菌，非致瘤性和免疫原性的肿瘤细胞。
[0024] 本发明进一步提供了用于在有需要的癌症患者中引发免疫反应以防止转移复发 的方法，其包括:从癌症患者切除实体瘤，以获得患者的实体肿瘤组织的至少95%，其中所 切除的肿瘤组织具有小于约3.5克的重量;消化所切除的肿瘤组织以获得解离的肿瘤细胞； 将肿瘤细胞移植到免疫受损的动物中；在所述动物中增殖肿瘤细胞以获得扩增的肿瘤组 织;从所述动物收获所扩增的肿瘤组织，其中所收获的肿瘤组织具有至少约3.5克的重量； 施加一剂Y辐射到所收获的肿瘤细胞致使所述细胞为非致瘤性的;将非致瘤性肿瘤细胞和 注射用药学上可接受的载体组合以制备包含至少约1〇 7个肿瘤细胞的可注射剂量，所述肿 瘤细胞与患者的肿瘤的细胞具有至少85%的序列同源性；以及对患者施用所述可注射剂 量，以引发针对所述癌症的复发的免疫原性反应。
[0025] 在另一个方面，用于引发免疫反应的方法进一步包括混合所收获的肿瘤细胞与注 射用药学上可接受的载体以制备至少四个可注射剂量，每个剂量含有至少约1〇 7个解离的 肿瘤细胞，所述肿瘤细胞与患者的所切除的肿瘤具有至少85%的序列同源性;和在足以引 发针对所述癌症的复发的免疫反应的治疗方案中施用所述至少四个剂量的每一个。在一个 优选的方面，所收获的肿瘤细胞与患者的肿瘤的细胞具有至少95%的序列同源性。
[0026] 在另一个方面，治疗方法进一步包括与一个或多个所述剂量一起，施用佐剂或免 疫刺激剂。
[0027]在用于引发免疫反应的方法的一个方面中，移植到动物的肿瘤包括95-100重量％ 的切除的实体瘤并且所收获的肿瘤组织包括95-100重量％的扩增的肿瘤组织。
[0028] 在另一个方面，用于引发免疫反应的方法进一步包括将一剂约150，000-200，000 拉德的Y辐射施用到肿瘤细胞，以使肿瘤细胞为无菌和非致瘤性的。
[0029] 在一个方面中，所述有需要的患者具有III期或更早期的癌症。在另一个中，所述 有需要的患者具有II期或更早期的癌症。在本发明的某些方面中，所述患者具有选自由结 肠癌、肾癌、黑素瘤、子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌或乳腺癌，或任何实体瘤亚型组成 的组的癌症。
[0030] 在特定方面中，所述患者具有结肠癌和在结肠镜检查过程中进行的组织切除。在 进一步的方面，该方法包括用含有洗涤剂的溶液洗涤所切除的肿瘤组织；用消毒剂处理所 切除的肿瘤组织以减少组织的微生物污染；以及用（多种)解离酶消化肿瘤组织，在至少一 种抗生素和抗真菌剂的存在下，以获得至少约1〇 7个解离的肿瘤细胞。
[0031] 此外，本发明还提供了用于在切除重量小于约3.5克的实体瘤的手术后对患者施 用的全细胞自体抗癌疫苗组合物，所述组合物包含:与所切除的肿瘤的细胞具有至少85 % 序列同源性的至少约1〇7个存活的非致瘤性肿瘤细胞;和用于注射的药学上可接受的载体； 其中当经由皮内注射对患者施用时，所述组合物产生免疫原性反应。在另一个方面，该组合 物包括至少四个剂量，每个剂量含有与所切除的肿瘤的细胞具有至少85%的序列同源性的 至少约10 7个存活的非致瘤性肿瘤细胞。在又一个方面中，所述疫苗包含与所切除的肿瘤的 细胞具有至少85%的序列同源性的至少10 8个存活的非致瘤性肿瘤细胞。在优选的方面中， 所述疫苗的肿瘤细胞与患者的原发性肿瘤细胞具有至少95%的序列同源性并且是无菌的， 非致瘤性的且至少80 %存活的。
[0032] 本发明还提供了用于制备含有至少约107个存活的，非致瘤性肿瘤细胞的可注射 自体抗肿瘤疫苗的方法，其包含(无异种移植）：从癌症患者切除实体瘤以获得患者的实体 瘤组织的至少95%，其中所切除的肿瘤组织具有大于3.5克的重量;用（多种)酶消化所有的 切除的肿瘤组织以获得解离的肿瘤细胞;混合所解离的肿瘤细胞以制备异质细胞的均质悬 浮液，其中悬浮液的任何等分试样包含来自患者的实体瘤的整套抗原物质;对肿瘤细胞的 均质悬浮液施加一剂Y辐射以致使所述细胞为非致瘤性的；以及将非致瘤性肿瘤细胞和注 射用药学上可接受的载体组合来制备含有至少约1〇 7个肿瘤细胞的可注射剂量。在另一个 方面，每一剂量中的非致瘤细胞与患者的肿瘤细胞具有至少98%的序列同源性。在另一个 方面，该方法还包括表征该细胞的抗原特征，以确保原发的肿瘤异质性已经得到了保留。
[0033] 根据进一步的方面，用于制备可注射自体抗肿瘤疫苗(无异种移植)的方法包括以 足以灭活微生物和致瘤性以及保存细胞的活力的量对细胞施加一剂Y辐射，以获得无菌 的，非致瘤性的和免疫原性的肿瘤细胞。
【具体实施方式】
[0034] 根据本公开内容的每个疫苗是从患者自身的原发性肿瘤构建的并有效地解决了 恶性实体瘤的遗传多样性或异质性。因此，通常用于开发有效的癌症疫苗的受监督抗原发 现过程以无监督的方式由患者的自身免疫系统处理，这最终提供了稳健的抗肿瘤反应。 [0035]有需要的患者包括已经经历或将接受用于切除实体瘤的手术的任何动物或人。当 实体瘤具有相对小的尺寸，例如约小于约3.0至3.5克，本文所讨论的技术是特别有用的。手 术切除后，在施用如本文所公开的自体疫苗之后防止微转移和/或复发的可能性。本技术适 用所有类型的癌症，包括上皮来源的癌，以及实体神经肿瘤，以及内皮细胞或间皮起源的癌 症，优选m期或更早期的疾病。本文的疫苗组合物和方法也可与免疫检验点抑制剂或标准 治疗的化疗药品相结合，特别是用于治疗更晚期的恶性疾病(III/IV期）。
[0036]将自体肿瘤疫苗和，更具体而言，OncoVAX?疗法，设计成激活患者对肿瘤相关 抗原的抵御，并且可以进一步增强自体肿瘤细胞的免疫原性。目前单独地为每个患者准备 OncoVAX，用于在手术切除后辅助治疗II期和III期结肠癌。产物含有两种不同的生物实体： (1)存活的但非致瘤性的自体癌症细胞和(2)新鲜冷冻的BCG细菌。前两个疫苗剂量包含1.0 X 107个存活的，代谢活性的，非致瘤性的，无菌的癌细胞，其与1.0 X 107菌落形成单位(CFU) 的新鲜冷冻的BCG混合，最终体积是0.2到0.4ml的无菌Hanks '平衡盐溶液(HBSS)。类似地制 备随后的两个疫苗剂量，但不加入BCG。本发明将自体肿瘤疫苗推广到这样的癌症患者，其 包括但不限于，结肠癌、肾癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌患者，其具有的肿瘤 对于先前已知的自体癌症疫苗疗法来说太小。
[0037] 根据本发明的一个方面的自体疫苗的每个剂量，包含至少约0.7~1.3 X 109，至少 0.7~1.3 X 108,或至少0.7~1.3 X 107个存活的，代谢活性的，非致瘤性的肿瘤细胞，每个剂 量与患者的原发性肿瘤的细胞具有至少约85%，90%，95%，或98~100%的序列同源性。在 某些实施方案中，在治疗期间施用至少三个，四个，五个或更多个剂量。如本文所讨论，在一 系列初始注射之后，在随后的时间，例如半年，可以在本发明的一些方面中施用加强剂量。 通过目前公开的方法，每个这样的剂量包含足够数量的肿瘤细胞，并且与任何以前的剂量 以及原发性肿瘤在表型，基因和/或抗原方面相同或相似，无论原发性肿瘤的大小如何。
[0038] 迄今，自体疫苗制造方法通常始于从患者切除的近似最小的1立方厘米的原发性 肿瘤，或约3.5克的肿瘤细胞。由于肿瘤之间和不同的患者之间，肿瘤是异质性的，并且在抗 原性，细胞构成和活力方面不同，应收集尽可能多的可用的肿瘤组织用于进一步的处理以 制备均质剂量的异质细胞。优选地，解离所有可用的肿瘤组织并将其共混或混合成均匀的 单细胞悬浮液，以在制造过程中在所有等分试样中均匀地保持所有的肿瘤抗原和细胞类 型。根据此前的技术，只有2约3.5g的原发性肿瘤用于制备疫苗。如果所收集的肿瘤组织的 重量为〈约3.5g，则如果可能的话，病理学家会通过获得所切除的原发性肿瘤的附加部分来 增加所提供的肿瘤的量。然而，如果肿瘤的称重显著大于约3.5克的所需最小值，则异质性 不一定被保留，并且所得的自体细胞的剂量将缺乏用于稳健反应的某些或全部的免疫必要 抗原。
[0039] 使用本发明的技术，可以扩增和处理具有任何质量的原发性肿瘤和肿瘤组织数 量，包括大于或小于3.5g，并且低至约2.0、1.0、0.5、0. lg或更低，从而为免疫治疗制备有效 的自体疫苗。
[0040] 因此，在一个方面，本发明提供了用于制造和使用OncoVAX?以及对于有效的 疫苗剂量和治疗方案太小的来自患者原发性肿瘤的许多其他的自体疫苗的方法。几种常见 癌以前不适合用于处理成有效的自体疫苗，由于诊断时肿瘤的受限尺寸。这些包括，但不限 于，肾癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、早期恶性黑色素瘤，以及具有相对 小的尺寸，即，小于3.5克的其他肿瘤(在此称为"小肿瘤"）。在许多癌症中，这种大小的肿瘤 足以转移和潜在致命地复发，但通常不足以用于处理从而为有效剂量和治疗方案制造疫苗 产品，如本文所讨论的。
[0041] 本发明的一个方面通过在免疫受损的动物宿主中移植和扩增患者的肿瘤细胞提 供了肿瘤细胞组合物和自体疫苗。不具有典型的宿主动物的通常的免疫选择过程的肿瘤细 胞的扩增提供了这样的手段，所述手段扩增自体疫苗，如Gtocomx?技术到产生小于3.5 克的实体瘤的大部分的致命癌的应用，同时利用自体肿瘤的基因组多样性来通过使用自体 疫苗剂量(无论是单独或与佐剂或化疗标准治疗的策略组合)防止复发。
[0042] 在本发明的一个实施方案中，将来自患者的细胞解离并混合在悬浮液中，以创建 异质细胞的均质混合物，使得组合物的任何等分试样代表其他，并反映原发性肿瘤的特定 的生物学特性(表型，基因组或抗原性）。此外，移植前和后的解离允许通过任何数量的生物 分析过程(包括但不限于种类特异性PCR，微阵列，R A-SEQ，全基因组深测序，流式细胞仪分 析等)分析以创建疫苗产品的悬浮液的任何等分试样在增殖过程中不经历基因组或抗原异 质性的转变。
[0043] 因此，根据本发明的疫苗产品通常由小于3.5g的切除的实体瘤制备，并且所得的 疫苗产品可用于存活的，非致瘤性的并且优选无菌的肿瘤细胞的总质量，这允许制备单独 的剂量，优选至少四个可注射的剂量，每剂含有至少约0.7~1.3 X107个存活的，非致瘤性 和无菌的肿瘤细胞。每个剂量可以进一步含有任何适当的佐剂，或免疫刺激剂，如BCG的任 何形式或菌株，或用于注射的任何合适的药学上可接受的载体。
[0044] 在一个特别优选的实施方案中，自体疫苗产品含有两种不同的生物实体：（1)来自 患者的原发性肿瘤组织的在动物宿主中增殖的存活的自体肿瘤细胞，和(2)新鲜冷冻的BCG 菌。第一，第二或后续疫苗剂量可以包含在终体积为例如0.2~0.4ml的无菌Hanks '平衡盐 溶液(HBSS)中的、与例如1.0 X 107菌落形成单位(CFU)的新鲜冷冻BCG混合的、至少约1.0 X 1〇7个存活的、代谢活性的、非致瘤性的、无菌的肿瘤细胞。随后的一个，两个，或更多的疫苗 剂量可类似地制备，但不加入BCG。这些剂量可以根据受控速率冷冻方法进行冷冻保存。在 一些实施方案中，将制备的患者剂量抽入标有适当的患者信息的注射器内。然后将封端的 注射器包装在绝缘容器中并递送到用于皮内施用疫苗到患者的地方。该疫苗通常在解冻细 胞的4小时内施用，通常使用三周诱导接种和六个月加强的方案，但是可以利用任何合适的 剂量和治疗方案，并且可以由患者护理提供者考虑本文的教导来确定。
[0045] 肿瘤细胞最初源自患者自身的实体瘤，其已被手术切除并加工成单细胞悬浮液， 然后可冷冻保存。使用无菌手术刀，一般将任何大块的肿瘤组织切成不小于1.5cm的片以有 助于运输过程中的快速冷却和养分有效性。由于肿瘤组织可能在制造过程中经受消毒，优 选避免将肿瘤切割成小于lcm的片。
[0046] 切除后，可以用（多种)解离酶消化肿瘤组织，典型地在至少一种抗生素和抗真菌 剂的存在下，以得到解离的肿瘤细胞。可以在例如左氧氟沙星、两性霉素B、Primaxin(亚胺 培南和西司他丁)和/硫酸庆大霉素的存在下进行肿瘤的解离，以减少例如结肠来源的肿瘤 所固有的内源性生物负荷。所解离的肿瘤细胞的单细胞悬浮液可以被冷冻并有活力地复苏 以便随后根据本文的教导作为异种移植物用于扩增。根据一个方面，从原发性相对小的肿 瘤衍生的任何和所有细胞用于异种移植，除了用于RNA-seq或异种移植前和后的生物分析 质量控制的其他方法的足够等分试样(诸如，例如，小于约1-5%的总细胞悬浮液）的细胞， 如本文所讨论的。
[0047] 本发明的一个方面利用重症联合免疫缺陷（SCID)小鼠动物宿主。也可使用各种其 它的免疫缺陷小鼠、大鼠、啮齿动物或其它免疫受损的动物，包括由于遗传缺陷而有缺陷的 那些，其可以是天然存在的或诱导的，诸如，例如裸鼠、Rag 1和/或Rag 2小鼠，以及已经与 这些小鼠杂交的小鼠。缺陷可能是，例如，由于重组中的遗传缺损，遗传缺陷胸腺，或有缺陷 的T细胞受体区域。诱导的免疫缺陷可能是施用免疫抑制剂，例如，环孢菌素，切除胸腺，或 减少NK活性的治疗的结果，所述治疗包括，但不限于，抗缺乏唾液酸基的GMI抗体治疗。各种 转基因的免疫缺陷动物是当前可用的或可以根据已知的技术开发。理想的是，免疫缺陷动 物是具有抑制淋巴细胞成熟的缺陷，特别是缺乏重排T细胞受体区域的能力的大鼠或小鼠。 在一个实施方案中，动物宿主是来自杰克逊实验室的NSG，NOD SCID伽玛(005557)小鼠，但 是可以使用任何合适的免疫缺陷或免疫受损的动物。
[0048] 合适的免疫缺陷动物包括啮齿动物，优选大鼠，小鼠，包括但不限于:可购自緬因 州，巴尔港的杰克逊实验室的NSG NOD SCID伽马，NOD SCID，BALB SCID，B6Rag，远交系裸 鼠，和自交系裸鼠；和可购自加利福尼亚州，霍利斯特的Char 1 e s R i ver实验室的无胸腺裸 鼠，BALB/c裸鼠，CD-I裸鼠，Fox ChaseS.CID.Beige，FoxChaseSCID?'，NIH_III裸鼠， NMRI裸鼠，NOD SCID，NU/NU裸鼠，OT II小鼠，RNU大鼠和SHC?小鼠。
[0049] 可以通过植入，诸如皮下植入，从患者，诸如患有II期或III期癌症或局部晚期或 转移性疾病的动物和人类患者，手术切除的解离的癌症外植体而在免疫缺陷的动物中建立 来自经消化的并优选均质和均匀的细胞悬浮液的肿瘤异种移植物。肿瘤细胞的植入位点可 以进入允许血液供应以到达异种移植物的任何皮下或其他位点，如宿主动物的侧翼。来自 原发性肿瘤以及来自淋巴结、肺、骨和其他器官转移部位的组织可以用于建立实体瘤异种 移植物。
[0050] -旦建立，增殖异种移植肿瘤并提供重量和体积增强的源材料以便进一步使用。 异种移植物优选保留如通过例如人阳求蛋白表达所确定的人表型，表达人癌症特异性抗原， 并保留反映原发性肿瘤的生长特性。本发明的这一方面提供了用于产生大量的肿瘤细胞以 便自体疫苗制造的方法。在一个实施方案中，用于从结肠镜检查患者扩增小的结肠肿瘤的 方法包括皮下植入解离悬浮液中的这些细胞到裸鼠 SCID或其他免疫缺陷动物，并允许植入 材料作为异种移植物生长到足够数量的细胞以便制备有效的自体疫苗，以保护患者免患复 发或具有相似的抗原特征的其他结肠病变。如本文所讨论，然后通过收获异种移植物和消 化细胞以便进一步处理来获得扩增的人癌细胞。
[0051] 皮下肿瘤能快速增长并且宿主动物通常在2-6周内处死。还提供了进一步增加癌 症细胞的数量的替代方法，如在第一轮异种移植没有产生足够量的肿瘤材料的情况下。异 种移植物可以在其他免疫缺陷动物中通过连续增殖进一步扩增，具有足够的样本被储存用 于长期评估基因组，蛋白质组或抗原性漂移。
[0052]因此，异种移植肿瘤组织的单细胞悬液可以用于通过连续传代接种其他免疫缺陷 动物，并且可以被冻结，并且可存活地复苏以便随后使用，诸如用于在原供体中治疗适应 症。异种移植肿瘤在其他动物中的连续传代可用于获得更大量的患者实体瘤细胞，这些实 体瘤细胞与原发性肿瘤在表型，抗原性以及免疫学方面相似或相同，并与原发性肿瘤的基 因组序列具有至少85%的序列同源性。本发明提供癌症异种移植物，其通过SCID裸小鼠或 其它合适的免疫受损动物宿主中的多个传代保持稳定的癌细胞表型。从异种移植肿瘤收获 的组织用于制备人或兽医患者肿瘤细胞的单细胞悬浮液。从消化的异种移植物制备的单细 胞悬浮液还保留了亲本肿瘤的生物学性质。单细胞悬浮液可以用于建立，例如，新的皮下肿 瘤。因此，本发明的方法包括将所收获的肿瘤组织移植到至少第二免疫受损动物中，在第二 动物中增殖肿瘤组织，并从第二动物收获增殖的肿瘤组织。肿瘤细胞可以在其他免疫受损 动物中传代3至5,至9,或甚至至10次或更多次。在优选的实施方案中，收获所有增殖的肿瘤 组织，使得随后制备的用于传代到其他免疫受损动物中或用于疫苗产品制备或质量控制测 试的单细胞悬浮液的等分试样包含患者的原发性肿瘤的整套抗原。
[0053]在本发明的一个方面中，移植到宿主动物中的原发性肿瘤细胞包含约95-100重 量％，优选为约98~100重量％的患者的实体瘤，以及从所述动物收获的肿瘤细胞包含约95 ~100重量％，优选为约98~100重量％的增殖的肿瘤组织。在一个实施方案中，用于疫苗生 产的各移植物和/或收获的材料包含约99重量％的现有的肿瘤材料，从而保持约1 %用于质 量控制的目的。优选地，将所收获的扩增的肿瘤细胞的每次接种或连续传代以及每次收集 解离成异质细胞的均质单细胞悬浮液从而使得每个等分试样和每个注射或异种移植物代 表原发性肿瘤的异质性。换句话说，优选地，在过程的每一个步骤保存原发性肿瘤的抗原异 质性，从而使疫苗含有患者所需的整套抗原，以便发展针对任何微转移和/或复发的稳健的 免疫原性反应。因此，本发明还提供了用于移植联合收获的肿瘤细胞的等分试样到至少多 个免疫受损的动物中，在多个动物中增殖肿瘤组织，并从多个动物收获增殖的肿瘤组织的 方法，其中从每个动物收获的组织，以及由此制得的疫苗产品与来自原发性肿瘤的整套细 胞在免疫学上相似或相同。
[0054] 在一个方面中，将原发性肿瘤细胞移植到免疫受损动物的皮肤下。肿瘤组织的移 植也可以在动物的肾被膜下，在动物的腹腔内，在骨髓中，或在任何其它合适的位置以使用 患者肿瘤在免疫缺陷动物中的扩增为自体全细胞肿瘤接种疫苗制备产生足够的肿瘤材料。
[0055] 如本文所讨论地增殖肿瘤细胞的数量后，在疫苗产品和自体全细胞疫苗的制备中 切除，解离和使用异种移植物。在进一步消化和解离之前，可以用含有去污剂的生理溶液洗 涤所收获的（多种)异种移植物，并且可以用一定浓度的消毒液洗涤所收获的肿瘤并持续一 段时间，其提供抗微生物活性同时最小化对人体细胞的细胞毒性。然后，在至少一种抗生素 和抗真菌剂的存在下，通常用（多种)解离酶消化扩增的肿瘤组织，以得到解离的肿瘤细胞 的悬浮液用于进一步的处理。
[0056] 然后，细胞悬浮液可以经受一剂例如约150,000-200,000拉德的y辐射以致使细 胞为非致瘤性的。辐射是优选的，但细胞冷冻时可能不一定适用。美国专利第5484596("下 称'596专利"）号提供了用于治疗具有可切除的实体瘤的人结肠癌患者以抑制复发和转移 形成的方法。该'596专利提及从人癌症患者手术取出结肠肿瘤组织，处理肿瘤组织以获得 肿瘤细胞，辐照肿瘤细胞使其为存活的但非致瘤性的，制备包含存活的非致瘤性的肿瘤细 胞的疫苗组合物并在癌症患者的免疫系统已经从手术恢复后皮内注射疫苗。如本文所教导 的，相同的方法可用于处理来自收获的异种移植物的扩增的肿瘤细胞，但是这样的方法不 限于结肠肿瘤。该' 596专利通过引用以其整体并入本文。
[0057]由于大肠内结肠肿瘤的来源，由'596专利的方法生产的癌症疫苗不是无菌的。为 了获得用于疫苗目的的有效的免疫原性细胞制剂，肿瘤细胞应该是存活和代谢活性的。因 此，致使细胞无菌的任何处理必须不会过度地损害免疫和临床功效所需的完整的活细胞的 基本的生物学特性。
[0058]美国专利7628996("下称'996专利"）提供了用于实现安全，无菌的肿瘤细胞组合 物的方法，而不会导致肿瘤细胞的免疫原性发生实质变化。这些目标不一定兼容，因为虽然 灭菌可以灭活微生物感染，它也可以负面地影响哺乳动物细胞;有效的消毒剂对微生物有 效，但是，在足够剂量时，也可能会损害哺乳动物细胞。辐射可以致使微生物无活性，但过量 的辐射也可以基本上改变哺乳动物细胞的免疫原性和随后的生物学性质。
[0059] 所述'996专利涉及化学和生物学手段的组合，其用于从肿瘤细胞去除和灭活生物 负担以获得无菌细胞组合物，所述无菌细胞组合物保持用于治疗性和预防性产品的生产的 活力和免疫原性。这种杀菌处理方法可用于各种各样的细胞类型;然而，据认为，其尤其可 用于灭菌用于制备癌症疫苗的实体瘤组织，包括，例如，'596专利的自体结肠癌疫苗。该' 996专利通过引用明确地以其全部并入本文。
[0060] 本发明还提供通过施用一个或多个剂量的、含足够量的从实体瘤衍生的存活的， 代谢活性的，但非致瘤性的癌细胞的无菌疫苗来治疗癌症和预防原发病复发和/或转移的 方法，所述无菌疫苗通过将扩增的肿瘤细胞和注射用药学上可接受的载体组合以制备可注 射的皮内剂量来制备，每个剂量优选含有至少约1〇 7个解离的肿瘤细胞，所述肿瘤细胞具有 通过台盼蓝排除法测定的至少80%的活力，因此在注入感兴趣的特定患者中时引发免疫原 性反应，通常为四个，五个或六个剂量的方案，任选地，这些中的一种或多种包括免疫佐剂 如BCG，其量如本文所示。
[0061]通过以下非限制性实施例说明本发明的上述和其它方面。
[0062] 实施例1
[0063] 患者原发性肿瘤细胞的采集:
[0064]预生产涉及用于自体疫苗的制造的源材料(肿瘤）的采集，因此，包括了疫苗生产 机构以外的所有的肿瘤处理。这通常包括手术切除肿瘤、分解(dissection)、病理加工和运 输肿瘤到制造机构。应按照有关收集和肿瘤处理的特定的协议来培训手术室和病理学人 员。在切除含肿瘤的结肠标本后，将切除的结肠放置在无菌袋或盆中。将在操作套件内处理 所切除的结肠。按照标准操作程序切开所切除的结肠并洗涤。在病理学家实施肿瘤分解之 后，准备肿瘤以便运输到生产机构。对于运输，可以将肿瘤放在肿瘤运输瓶中，其包含含有 庆大霉素的Hanks'平衡盐溶液(HBSS/G)。可以将肿瘤运输瓶装入含温度记录装置和冰袋的 运输箱中以确保维持规定的运输温度。
[0065]在生产过程中，应优选满足几个验收标准以继续处理。最小的肿瘤重量（约3.5g) 将确定是否启动肿瘤处理而不进行异种移植。如果是这样，为了获得含有原发性肿瘤的整 套抗原的疫苗，收获并解离大于3.5g的整个肿瘤以制备异质细胞的均质单细胞悬浮液。生 物物质的验收标准包括肿瘤细胞的数量和存活力，以及肿瘤细胞的同一性和效力。
[0066] 用HBSS/G洗涤肿瘤并将肿瘤转移到无菌培养皿中，在那里去除并丢弃肿瘤无关组 织(extraneous tissue from the tumor)。然后将肿瘤转移到含有消毒剂的瓶子中。在此 处理后，去除消毒液并用HBSS/G洗涤肿瘤。
[0067] 然后将肿瘤修剪成小块，其被转移到搅拌的解离烧瓶中。然后加入暖的解离介质， 其含有脱氧核糖核酸酶(DNase)和胶原酶。在36-38 °C下温育烧瓶35-45分钟。解离后，收集 含有细胞的上清液，然后将其过滤到离心管中。将细胞离心并将细胞沉淀重新悬浮在HBSS/ G中。将其他解离介质添加到剩余的肿瘤片段中并重复解离过程，总共三次解离。将来自三 次解离的细胞汇集在一个离心管中，并在2_8°C下再次离心。将细胞沉淀重新悬浮于冷冻保 护介质中；体积是基于所获得的存活的肿瘤细胞的数目以及所需的细胞密度/小瓶。为受控 速率冷冻准备最少9个和最多17个小瓶。在这个冷冻周期中，将细胞悬浮液从+4°C冷冻至-90°C，降低的速率是1°C/分钟，直到达到-40°C的温度。此过程导致细胞活力的成功低温保 存。然后将冷冻的肿瘤细胞保存在受控条件下的隔离区中，在温度< _ll〇°C的液氮的汽相 中。
[0068] 为移植准备原发性肿瘤细胞:
[0069]根据常规方法解冻冷冻保存的细胞。在运输到特定的无病原体动物机构的过程 中，将解冻的冻存细胞和新鲜产生的肿瘤悬浮液放在冰上。在注射之前，收获足够的悬浮细 胞的等分试样并储存用于异种移植前和后分析，以确保基因组和/或抗原异质性在该过程 的所有步骤中被保留。从肿瘤生成的所有小瓶用于注射，并且，每小瓶，将细胞通过20号针 头抽吸到l.〇-l〇ml注射器。用27-25号针头替换20号针头用于注射到免疫受损的小鼠内。月中 瘤细胞可以与基质胶或类似的蛋白质基质混合，以提高植入过程中或植入后的异种移植接 受率（take-rate)。
[0070] 移植肿瘤细胞到免疫受损的动物:
[0071] 将免疫受损的动物(例如，大鼠）保持在特定的无病原体条件下并按照IACUC准则 使用。在异种移植之前，用70%的乙醇在脊柱的两侧背外侧地消毒动物。每只动物，将一个， 两个或更多个i〇〇yl的肿瘤悬浮液彼此间隔开约1.5厘米地皮下注射到两侧的横向侧面内。 每天监测动物至少一次。
[0072] 将肿瘤细胞腹膜内移植到免疫受损的动物:作为皮下注射的替代，也使用腹腔内 注射肿瘤细胞到免疫受损的动物。使用70 %的乙醇腹侧地消毒动物。每只动物，腹膜内注射 lml的肿瘤悬浮液。每天监测动物至少一次。
[0073] 增殖和收获肿瘤细胞:
[0074] 2-8周后，肿瘤足够大以按照IRB批准和IA⑶C准则收获，如通过利用测径器测量的 肿瘤体积估计所评估的。处死异种移植动物，将其浸入70%乙醇中或用70%乙醇清洗，然后 无菌地去除肿瘤并且使肿瘤组织不接触动物的皮肤的外部。然后评估肿瘤的硬度以及通过 切割并通过细网轻轻按压组织或者通过施用如上所述地相同的解离方案将肿瘤分解成单 细胞悬浮液。然后在mss/G中重新悬浮同一原发性肿瘤衍生的所有肿瘤细胞并将其汇集到 一个合适的无菌容器中，采样前轻轻混合，计数，并通过台盼蓝排除试验评估细胞活力。然 后将细胞离心用于使用mss/G的最终洗涤，并重新悬浮在HBSS中，以达到每毫升10%活细 胞的最终细胞浓度。然后采集异种移植后的样品用于质量控制测试。然后将悬浮液以lml等 份试样转移到无菌冻存小瓶中，然后冷冻保存细胞直至进一步使用。
[0075] 在随后的使用中，所有的肿瘤细胞用于制备每剂含有至少107个细胞的疫苗产品， 或注射到一组新的免疫受损的动物中并增殖以产生额外的肿瘤细胞，如上所述地随后收获 这些额外的肿瘤细胞。
[0076] 辐射：
[0077] 从贮藏所取出增殖的和收获的肿瘤细胞的小瓶并用y放射源灭菌和辐射（200， 〇〇〇拉德）以致使肿瘤细胞为无菌和非致瘤性的。一个小瓶用于生物产品的质量控制测试。 八个小瓶包括四个患者剂量，并保持在液氮冷冻器的单独的隔离区中，直到所有的释放试 验(外观、肿瘤细胞数量和活力、纯度、同一性、效力、无菌性和内毒素含量）的成功完成。经 有资格的人释放生物产品之后，患者剂量以及BCG-起用于前两次接种，以及将所有适用的 文书运送到离患者最近的指定并预先批准的药房或实验室用于配制。
[0078] 后期生产和治疗方案:
[0079] 对于疫苗制备，从贮藏所取出两小瓶的无菌、非致瘤性肿瘤细胞以及必要时取出 一小瓶新鲜冷冻的BCG并在干冰上包装。小瓶附有疫苗配制程序并传送到药房用于配制。这 些细胞在设置在36-38°C下的加热块上解冻。前两次注射具有加入到细胞悬浮液中的BCG。 将剂量吸入到lmL注射器中，在冷块上包装，然后运给医师或护士用于对患者施用。配制剂 量的届期为四小时并从细胞的解冻开始。
[0080] 经皮内途径施用前三次疫苗接种，以一周的时间间隔，在手术后28到35天开始。前 两次注射中的每一次由与BCG( 1.0 X 107CFU)混合的解冻的辐照的肿瘤细胞(1.0 X 107±0.3 X107)组成。第三次注射具有辐照的肿瘤细胞，但不具有BCG。第四次和最后的疫苗接种，也 具有辐照的肿瘤细胞，但没有BCG，在术后6个月（II期结肠癌患者）或化疗完成之后一个月 (III期结肠癌患者)发生。
[0081] 质量控制测试:
[0082] 肿瘤细胞调查:显微镜测试以调查存活的肿瘤细胞，非存活的肿瘤细胞，和存活的 非肿瘤细胞。
[0083]同一性测定：荧光活化的细胞分选（FACS)以使用肿瘤特异性的人单克隆抗体 88BV59确定腺癌细胞的存在。
[0084] 基质关联的效力和同一性测定:FACS以计数对EpCAM和CEA反应的肿瘤细胞，EpCAM 和CEA是肿瘤相关抗原。
[0085] 纯度测定:FACS以显示在生物产品中>90%的活细胞是肿瘤细胞和/或淋巴细胞。
[0086] 无菌:进行测试以检测生物物质和生物产品中的微生物和真菌污染的存在。
[0087] 内毒素测定:进行测试以确定在生物产品中的内毒素水平。
[0088] 实施例2
[0089] DTH响应测量
[0090]进行I / II期研究(AS I -200 2-01)以评估与BCG混合的当前(非增殖的），无菌的自体 肿瘤细胞疫苗在患有II/III期原发性结肠腺癌的患者中的安全性和免疫原性。此外，旨在 展示对无菌疫苗制剂的免疫反应的该研究等同于在先前的临床试验中使用的非无菌制剂 的研究。
[0091]为了满足初级终点（在不具有BCG的第三次疫苗之后的48小时测量的DTH反应），患 者被认为具有对疫苗的阳性响应的情况是他/她达到至少5mm的硬结。在每次疫苗注射后监 测局部、区域和全身不良反应，并且在手术后3和6个月和第4次接种疫苗之后的90天进行全 面的安全评估，包括体检、体能状态、全血细胞计数且作差异比较、血液化学、CEA和尿检。 [0092] 在ASI-2002-01中处理和评估的所有15例患者具有DTH反应>5mm的免疫响应。此 外，用无菌疫苗治疗的15名患者中的13名（87%)具有至少10mm的DTH反应。在利用非无菌制 剂的先前试验(8701)中，对128例患者施用疫苗，其中87%经历至少1 Omm的DTH反应。然而， 利用无菌制剂，非特异性红斑的程度显着减少。红斑是体液反应，其减少大概反映生物负载 从当前无菌制剂中的去除。
[0093]因此，对无菌疫苗的免疫响应很可能比得上先前的非无菌产品。结果进一步表明， 对这种免疫实现的免疫原性响应针对肿瘤相关抗原而不是产物固有的污染。
[0094]第三次和第四次疫苗，其仅由肿瘤细胞(无BCG)组成，提供测量DTH的机会。DTH反 应是由初始疫苗接种赋予的细胞介导的免疫的程度的指标。疫苗注射后两天，由用于测量 硬结的标准方法一一笔方法在两个垂直直径测定注射部位处的硬结。
[0095] 实施例3
[0096] cwcomx同一性测定
[0097] 这个实施例描述了用于鉴定⑶66阳性肿瘤细胞在裸鼠中增殖后的百分比的方法， 通过流式细胞术其也是88BV59阳性的。
[0098] 材料和设备
[0099] 材料:试管12 X 75mm蓝色，带过滤器的100yl无菌移液头，带过滤器的lOOOyl无菌 移液头，OncoVAX? 同一性5EX-1 gG抗体，OUcoVAX? 同一性5EX-88BV59抗体， OncoVAX?同一性⑶66-PE抗体，固定/透化作用溶液试剂盒，无酚红的HB(1 X ) ;500ml和 纯水
[0100]设备：Beckman Coulter FC500流式细胞仪，Eppendorf 541f5D型离心机，冰箱GKx 7080，电子计时器，体积可调移液器。
[0101]程序：
[0102]样品制备
[0103] 对于每个样本，制备一组两个（2)管。管子被标以IgG3或88BV59。鉴定待分析的样 品（SUB/PRD)。第一管含有人5-EX IgG3和抗CD66-PE;第二管包含5-EX 88V59和抗CD66-PE。 将抗⑶66-PE的50yl的工作稀释液等分至每个管，随后是100yl充分混合的样品到每个管。 将管加盖，轻轻摇动以混合细胞和抗体，然后在15_30°C下孵育20-30分钟。然后将剩余的样 品储存在2-8 °C。
[0104] 然后制备Perm/洗涤缓冲液的1 X溶液。对于每个样品，加入0.3ml的lOXPerm/洗 涤和2.7ml的纯水。然后将混合物加盖并在离心管中轻轻地倒转混合。
[0105] 第一细胞洗涤和透化作用:将lml的HBSS加入到每个管中。然后将管轻轻摇动以混 合细胞和抗体，然后在15_30°C下以375-425g离心5-10分钟。然后将上清液吸出，不干扰沉 淀，然后将100^10丫1:〇;^1/〇71:〇?61'1]1溶液加入到每个管中。然后将沉淀重新悬浮，并在15-30°C下孵育20-30分钟。
[0106] 第二细胞洗涤和内染色:管是无盖的并将lml Perm/洗涤缓冲液加入到每个管中。 然后轻轻摇动管以悬浮细胞并在15-30 °C下以375-425g离心5-10分钟。然后吸出上清液，不 干扰沉淀，并将50yl的Perm/洗涤缓冲液加入到各管中并轻轻摇动以重悬沉淀。然后将用于 内染色的适当抗体加入到各管（l〇〇yl 5-EX IgG3到IgG3管以及100yl 5-EX 88BV59到 88BV59管）。将管轻轻摇动以混合细胞和抗体，然后在15-30 °C下孵育20-30分钟。
[0107] 第三细胞洗涤:管子是未封端的并将lml Perm/洗涤缓冲液加入到每管中。将管加 盖并轻轻摇动以悬浮细胞，然后在15-30°C下以375-425g离心5-10分钟。该管是无盖的并吸 出上清液，而不干扰沉淀。接着，将400iil的HBSS加入到每管中。将管加盖并轻轻摇动以悬浮 细胞。然后管被储存在2-8°C直到分析(高达1小时）。
[0108] 管分析:为前向和直角光散射而建立的标准圈门参数用于通过FACS来分析细胞。 纳入完整细胞并从光散射门排除死细胞和碎片。88BV59管用于确定⑶66+88BV59+细胞的百 分比。
[0109] 测定可靠性-分辨率:注意可观察的荧光变化以区分CD66+88BV59+染色的细胞和 CD66+IgG3+对照细胞。
[0110] 同一性百分比的计算：CD66和88BV59阳性(CD66+88BV59+)肿瘤细胞的百分比除以 是⑶66阳性细胞的部分并乘以100以确定同一性百分比。
[0111] 使用上述程序，在裸鼠内增殖后收获的人类结肠肿瘤细胞将显示基本上或完全的 同一性。
[0112] 实施例4 [0113] 效力测定
[0114]这个实施例描述了用于在裸鼠中增殖后通过流式细胞术鉴定和调查肿瘤细胞的 方法。
[0115] 设备:Beckman Coulter FC500流式细胞仪，冰箱GKx 7080,2-8°C，定时器，体积可 调移液器(P200，PI 000)，以及试剂和样品储存器。
[0116] 提交用于分析的样品将被储存在2-8°C，然后立即启动分析程序。
[0117] 样品制备：对于每个样品，制备三（3)个相同的重复。每管含有由抗EpCAM FITC， 抗-⑶6PE和抗⑶45PC5组成的〇nc〇VAX?效力抗体工作溶液。向每个重复管中加入15〇yl 的Onco VAX?效力抗体工作溶液。向每个管中加入l〇〇yl的充分混合的细胞样品。轻轻摇 动细胞和抗体以混合。将任何剩余的样品储存在2-8 °C下。将试管在RT下孵育2-30分钟。孵 育后，将400yl的DPBS加入到每个管中。然后涡旋带有Flow Count荧光球(珠）的容器。向每 个管中加入lOOyl的Flow Count荧光球。样品分析:应该纳入活细胞并从光散射门排除死细 胞和碎片。为了获得肿瘤和其他细胞的绝对计数，获取由Flow Count荧光球制造商提供的 分析证明书上指定的珠的数量。还获得在肿瘤区域中的肿瘤细胞的百分比和计数。还获得 在淋巴区域中的淋巴细胞的百分比和计数。
[0118] 结果的计算:为了确定样品效力（肿瘤细胞/瓶），平均肿瘤细胞计数/iil(区域K，表 B)乘以1000。如果必要的话，稀释因子也用于在样品制备过程中计算原始浓度。为了确定淋 巴细胞/小瓶，平均淋巴细胞计数AU(区域Ly，表B)乘以1000。如果必要的话，稀释因子也用 于在样品制备过程中计算原始浓度。为了计算复苏百分比，将平均肿瘤细胞计数添加到平 均淋巴细胞计数中并除以平均光散射门计数。
[0119] 使用上述程序，在裸鼠内增殖后收获的人类结肠肿瘤细胞将显示以下效力：
[0121] 实施例5
[0122] 从扩增的异种移植材料纯化人癌细胞
[0123]在收获和解离异种移植肿瘤后，可以纯化样品的异型生物质材料或污染物，即与 源动物相关联的活细胞或细胞碎片。Onco VAX?是自体疫苗，而且明显地可以充当疫苗 中的污染物的循环细胞、肿瘤相关基质以及任何其它细胞碎片仍然被免疫系统认为是"自 身的"。但是，在异种移植过程中，人癌细胞由源于小鼠的基质和血管支持。由于这些构成原 患者的外来物质，这些污染物代表比自衍生组织风险更大的不良事件。因此，在异种移植物 扩增之后，可以最小化对生物材料的跨物种反应性以减少潜在的过敏反应和药物诱发过敏 症的风险。一旦细胞已被解离成单细胞悬浮液，将混合物用缀合到单克隆抗体的磁性或非 磁性珠处理，所述单克隆抗体特异于起源的内皮细胞或造血细胞的小鼠生物标记(包括，但 不限于，小鼠特异性抗CD44和/或抗CD55)或一般抗原标记。在悬浮液中结合小鼠细胞后，将 样品离心分离，通过阴性选择富集人类肿瘤细胞。然后在Qnco VAX?同一性测定中量化 分离的纯度，并且针对原始肿瘤解离的均质样品测试所得的基因组指纹。
[0124] 实施例6
[0125] 在异种移植扩增之后人类癌细胞的表征
[0126] 根据本公开的疫苗产品OncoVAX?的临床疗效在于其包容和利用肿瘤异质性 的能力。导致与个体患者相关联的独特的抗原特征根本变化的增加其源材料的任何尝试增 加治疗失败的风险。因此，可以比较来自原始肿瘤(异种移植前）的细胞的代表性悬浮液和 富集人细胞之后的肿瘤植入物(异种移植后）以确保整个扩增过程的免疫原性连续性。各种 筛选方法可用于实现这种质量控制，包括但不限于，比较基因组杂交、染色体核型分析、单 核苷酸多态性(SNP)分析、短串联重复序列图谱分析、转录组(RNA- Seq)或基因组深度测序、 RA微阵列分析或流式细胞分析。异种移植后的肿瘤细胞的染色体、突变或基因表达特征中 的显著改变表示保留患者特异性异质性的失败。因此，在原发性肿瘤细胞的均质样品和异 种移植物增殖的肿瘤细胞的均质样品的RNA微阵列分析之后，异种移植物的细胞将呈现与 原发性肿瘤的细胞的显著的同源性，优选至少85%的序列同源性。
[0127] 因此，本发明包括肿瘤抗原的异质性，通过自体癌症疫苗，以及将该技术扩展到癌 症，包括具有相对小的尺寸的实体瘤，否则它们太小以致不能有效地作为原发性肿瘤用于 制造自体疫苗产品和相关的治疗方法。
[0128] 制造过程包括在免疫受损的动物中移植和增殖患者肿瘤细胞并从动物收获增殖 的细胞以制备足够量的疫苗组合物，其具有原发性肿瘤的生物学、表型、抗原性和免疫原性 特征。本发明还提供自体疫苗产品以及含有比患者的原发性肿瘤更大量的存活的肿瘤细胞 的组合物，其中，疫苗的肿瘤细胞具有与原发性肿瘤的细胞的至少85%的序列同源性并提 供了用于引发免疫反应，以通过消除个体，特定的癌症患者中的微小残留病来防止转移的 复发，其通过施用异质细胞产品和/或异种移植物扩增的、存活的、无菌、非致瘤性但免疫原 性的细胞的均匀混合物，以足以引发免疫反应以防止微转移和/或恶性疾病的复发的剂量 和方案。
[0129] 虽然若干上述实施例涉及结肠癌，然而本发明不限于此而仅由所附权利要求书的 范围限制。
【主权项】
1. 一种制备包含至少约1〇7个活的、非致瘤性肿瘤细胞的可注射的、自体抗肿瘤疫苗的 方法，其包括： 从癌症患者切除实体瘤以获得患者的实体瘤组织的至少95%，其中所切除的肿瘤组织 具有小于约3.5克的重量； 消化所切除的肿瘤组织以获得解离的肿瘤细胞； 将所切除的肿瘤细胞移植到免疫受损的动物中； 在所述动物中增殖所述肿瘤细胞以获得扩增的肿瘤组织； 从所述动物中收获扩增的肿瘤组织以获得收获的肿瘤细胞，其中所收获的肿瘤组织具 有至少约3.5克的重量； 施加一剂γ辐射到所收获的肿瘤细胞致使所述细胞为非致瘤性的；以及 将非致瘤性的肿瘤细胞和注射用药学上可接受的载体组合来制备含有至少约1〇7个肿 瘤细胞的可注射剂量。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所扩增的细胞与患者的实体瘤的肿瘤细胞具有至 少85 %的序列同源性。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，可注射的剂量包含具有至少80%的活力的肿瘤细 胞。4. 根据权利要求1所述的方法，其还包括用酶消化所切除的肿瘤组织以获得解离的肿 瘤细胞并混合所解离的肿瘤细胞以形成均质悬浮液。5. 根据权利要求3所述的方法，其还包括消化所收获的肿瘤组织以获得解离的所收获 的肿瘤细胞并混合解离的所收获的肿瘤细胞以形成均质悬浮液。6. 根据权利要求1所述的方法，其中，移植到所述动物的肿瘤细胞包含约95-100重量％ 的患者的实体瘤。7. 根据权利要求5所述的方法，其中，从动物收获的肿瘤细胞包含约95-100重量％的扩 增的肿瘤组织。8. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括移植所收获的肿瘤组织到第二免疫受损 的动物中，在第二动物中增殖肿瘤组织，并从第二动物中收获增殖的肿瘤组织以制备含有 至少约10 7个肿瘤细胞的可注射剂量。9. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物是大鼠。10. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物是已经接受治疗以减少自然杀伤细胞 活性或具有重症联合免疫缺陷病(SCID)的无胸腺裸小鼠。11. 根据权利要求1所述的方法，其中，当移植组织具有约3.5至4克重时将其收获。12. 根据权利要求1所述的方法，其还包括在解离之前用一定浓度的消毒液处理所收获 的肿瘤并持续一段时间，该处理提供抗微生物活性，同时尽量减少细胞毒性。14. 根据权利要求1所述的方法，其还包括通过RNA测序表征所收获的细胞的抗原特征， 以保证患者的肿瘤的异质性已被保存下来。15. 根据权利要求1所述的方法，其还包括对所收获的细胞以足以灭活微生物和致瘤性 并保存细胞的活力的量施加一剂γ辐射，以获得无菌、非致瘤性和免疫原性的肿瘤细胞。16. -种用于在有需要的癌症患者中引发免疫反应以防止转移复发的方法，其包括： 从癌症患者切除实体瘤，以获得患者的实体肿瘤组织的至少约95%，其中所切除的肿 瘤组织具有小于约3.5克的重量； 消化所切除的肿瘤组织以获得解离的肿瘤细胞； 将所述肿瘤细胞移植到免疫受损的动物中； 在所述动物中增殖所述肿瘤细胞以获得扩增的肿瘤组织； 从所述动物收获所扩增的肿瘤组织，其中所收获的肿瘤组织具有至少约3.5克的重量； 施加一剂γ辐射到所收获的肿瘤细胞致使细胞为非致瘤性的； 将非致瘤性肿瘤细胞和注射用药学上可接受的载体组合以制备包含至少约1〇7个肿瘤 细胞的可注射剂量，所述肿瘤细胞与患者的肿瘤的细胞具有至少85%的序列同源性；以及 对患者施用所述可注射剂量，以引发针对所述癌症的复发的免疫原性反应。17. 根据权利要求16所述的方法，其还包括将所收获的肿瘤细胞与注射用药学上可接 受的载体组合以制备至少四个可注射剂量，每个剂量含有至少约1〇 7个解离的肿瘤细胞，所 述肿瘤细胞与患者的所切除的肿瘤具有至少85%的序列同源性;和以足以引发针对所述癌 症的复发的免疫反应的治疗方案施用所述至少四个剂量的每一个。18. 根据权利要求17所述的方法，其中，所收获的肿瘤细胞与患者的肿瘤的细胞具有至 少95 %的序列同源性。19. 根据权利要求17所述的方法，其还包括与一个或多个所述剂量一起，施用佐剂或免 疫刺激剂。20. 根据权利要求16所述的方法，其中移植到所述动物的肿瘤包括约95-100重量％的 切除的实体瘤并且所收获的肿瘤组织包括约95-100重量％的扩增的肿瘤组织。21. 根据权利要求18所述的方法，其还包括将一剂约150,000-200,000拉德的γ辐射施 用到肿瘤细胞，以使肿瘤细胞为无菌和非致瘤性的。22. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述有需要的患者具有III期或更早期的癌症。23. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述有需要的患者具有II期或更早期的癌症。24. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述患者具有选自由结肠癌、肾癌、黑素瘤、卵 巢癌或乳腺癌组成的组的癌症。25. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述患者具有结肠癌并且在结肠镜检查过程中 进行所述切除。26. 根据权利要求25所述的方法，其还包括： 用含有洗涤剂的洗涤溶液清洗所切除的肿瘤组织； 用消毒剂处理所切除的肿瘤组织以减少组织的微生物污染；以及 在至少一种抗生素和抗真菌的存在下，用解离酶消化肿瘤组织，以获得至少约1〇7个解 离的肿瘤细胞。27. -种用于在切除重量小于约3.5克的实体瘤的手术后对患者施用的全细胞自体抗 癌疫苗组合物，所述组合物包含： 与所切除的肿瘤的细胞具有至少85%序列同源性的、至少约107个活的非致瘤性肿瘤细 胞;和 用于注射的药学上可接受的载体； 其中当经由皮内注射对患者施用时，所述组合物产生免疫原性反应。28. 根据权利要求27所述的组合物，其中，所述组合物包括至少四个剂量，每个剂量含 有与所切除的肿瘤的细胞具有至少85 %的序列同源性的、至少107个活的非致瘤性肿瘤细 胞。29. 根据权利要求27所述的组合物，其中，所述疫苗包含与所切除的肿瘤的细胞具有至 少85 %的序列同源性的、至少108个活的非致瘤性肿瘤细胞。30. 根据权利要求27所述的组合物，其中，所述疫苗的肿瘤细胞与患者的原发性肿瘤细 胞具有至少95 %的序列同源性。31. 根据权利要求27所述的组合物，其中，所述疫苗的存活的肿瘤细胞是无菌，非致瘤 性且至少80 %存活的。32. -种用于制备含有至少约107个活的、非致瘤性肿瘤细胞的可注射自体抗肿瘤疫苗 的方法，其包括： 从癌症患者切除实体瘤以获得患者的实体瘤组织的至少95%，其中所切除的肿瘤组织 具有大于3.5克的重量； 用酶消化所有的切除的肿瘤组织以获得解离的肿瘤细胞； 混合所解离的肿瘤细胞以制备异质细胞的均质悬浮液，其中所述悬浮液的任何等分试 样包含来自患者的实体瘤的整套抗原物质； 对肿瘤细胞的均质悬浮液施加一剂γ辐射以致使细胞为非致瘤性的；以及 将非致瘤性肿瘤细胞和注射用药学上可接受的载体组合来制备含有至少约1〇7个肿瘤 细胞的可注射剂量。33. 根据权利要求32所述的方法，其中，每一剂量中的非致瘤细胞与患者的肿瘤细胞具 有至少98 %的序列同源性。34. 根据权利要求32所述的方法，其还包括表征该细胞的抗原特征，以确保原发性肿瘤 异质性已经得到了保留。35. 根据权利要求32所述的方法，其还包括以足以灭活微生物和致瘤性以及保存细胞 的活力的量对细胞施加一剂γ辐射，以获得无菌，非致瘤性和免疫原性的肿瘤细胞。36. -种在有需要的癌症患者中引发免疫反应以防止转移的复发的方法，其包括对患 者施用根据权利要求32的可注射剂量以引发针对所述癌症的复发的免疫原性反应。
【文档编号】A61P35/04GK105873639SQ201480065157
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年9月25日
【发明人】迈克尔·G·小汉纳
【申请人】万科斯诺晋国际合作有限公司