穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减小症药物的应用
【专利摘要】本发明涉及一种治疗血小板减少症的药物的用途，具体涉及穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减少症的药物的应用。可通过添加药学上可接受的常规辅料，将穗花杉双黄酮制备成口服制剂或注射制剂。药效学试验表明穗花杉双黄酮能有效抑制因化疗药物导致的血小板减少和血小板减少性紫癜的治疗，疗效显著，毒副作用小。
【专利说明】
穗花杉双黄酬在制备治疗血小板减小症药物的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于药物技术领域，设及一种治疗血小板减少症的药物，具体地说，设及穗 花杉双黄酬在制备治疗血小板减小症的药物的应用。
【背景技术】
[0002] 血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质。 血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量，健康人血小板数 量为100 X 10 VL~300 X 1 oVl。血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排 斥等生理和病理过程中有重要作用。
[0003] 正常外周血小板计数< 10 0 X 10 Vl称为血小板减少症。因血小板减少而导致的出 血大约占临床出血性疾病的30%。一般情况下，血小板计数<20 XIOVl时，可出现自发性 内脏出血，烦内出血等致命性出血。血小板减少可W由多种原因引起，按病因分类主要有化 疗所致血小板减少症（。11日1]1〇1:11日拘9厂;[]1山1。日(11:111'〇1]113〇。八〇9日]11日，〔11')、免疫性血小板减 少性紫齋（idiopathic th;romboc5ftopenic pu巧ura，ITP)、脾功能亢进症等。由于血小板一 旦减少至病理状态，恢复较慢，临床上又没有特效药，因此如何解决血小板减少症是临床迫 切需要解决的难题。
[0004] 输注血小板是治疗血小板减少症的传统方法，但输注血液制品不仅有感染血源性 传播疾病的危险，而且反复输注可诱发患者发生同种异体免疫反应，从而降低输注效果，引 发其他严重不良反应。血小板保存时间短、高昂的输血费用和紧缺的血源更使得该种治疗 方法受到了较大的限制。
[0005] 治疗血小板减少症，除了传统的血液制品输注外，目前应用于临床的还有重组人 白介素-11 (rhIL-11)、重组人白介素-11衍生物（rhix-l lAla^)和重组人血小板生成素 (riiTPOKrh化-11虽然对血小板减少有不错的效果，但较高的不良反应发生率限制了其应 用，比如肌肉关节痛、结膜充血、下肢水肿、皮疹、屯、惇、屯、律失常、水肿、发热、注射局部疼 痛、头痛头晕、乏力等。
[0006] 重组人血小板生成素虽能有效地促进非造血系统肿瘤化疗后血小板生成，但对造 血系统肿瘤化疗后的血小板生成作用并不理想。临床研究中发现，rhTPO常见的副作用有发 热、乏力、肌痛、头痛、关节痛、呼吸困难、腹泻、肺栓塞，少数癌症患者在治疗中出现了血栓 栓塞，W及不可逆骨髓网状纤维增生等多种并发症或后遗症。
[0007] 中医认为血小板减少属于"发斑"、"血证"范畴，其病因在于热毒识盛，气不摄血， 致使血妄行或可能为肝实脾虚，肝木凌±，脾不统血而引发该病。不同病因导致的血小板减 少症的中医治疗方案有着明显区别。对于血小板减少性紫齋（ITP)，常用药物有江南卷柏 片、血小板胶囊、维血宁颗粒等。针对化疗后引起的血小板减少症，常用中药有人参、黄巧、 白术、当归、地黄、阿胶、鸡血藤、补骨脂、构杞子、女贞子、仙鹤草、花生衣等，也有些复方制 剂如复方皂抓丸、升板方等。
[000引江南卷柏（Selaginella Moellendorfii Hieron.)属于卷柏科 (Selaginellaceae)卷柏属（Selaginella)植物，别名石柏、岩柏草、黄痘卷柏，主要分布于 我国长江流域W及长江W南各地，北至秦岭山区。江南卷柏具有清热解毒、止血生肌、抗癌 等功能，临床上用于治疗原发性血小板减少性紫齋、肺炎、癌症、眼结膜炎、急性扁桃体炎和 乳腺炎等症。江南卷柏单味药制剂江南卷柏片临床适用于血热妄行所致的皮下紫擁，症见 皮肤出现散在青紫斑点或斑块，舌红、苔黄、脉数等，原发性血小板减少性紫齋见上述血热 症候者。但江南卷柏治疗原发性血小板减少性紫齋的活性成分尚不明确。为了掲示江南卷 柏治疗原发性血小板减少性紫齋的药效物质基础，本课题组对江南卷柏进行了较为系统的 化学成分研究，分离鉴定了穗花杉双黄酬(Amentof lavone)、栖双黄酬化ayaf lavone)、罗汉 松双黄酬A(F*odoca;rpusflavone A)、扁柏双黄酬化inokiflavone)等单体化合物。采用人巨 核细胞株Dami增殖分化的体外药效筛选模型考察分离得到的单体化合物对血小板生成的 影响，结果发现本植物分离得到的穗花杉双黄酬(0.5,2.5,12.5μΜ)具有促进巨核细胞增殖 分化、释放血小板入血的的作用，初步提示穗花杉双黄酬为传统中药江南卷柏促进血小板 生成的药效活性成分。为了进一步验证穗花杉双黄酬的促进血小板生成的药效活性，采用 注射卡销致BALB/c小鼠血小板减少模型，及原发免疫性血小板减少性紫齋小鼠模型等两种 药效试验模型，结果显示穗花杉双黄酬口服给药对卡销导致BALB/c小鼠血小板减少及原发 免疫性血小板减少性紫齋小鼠的血小板减少均具有明显的改善作用，具有升血小板、改善 血小板功能、及增加血小板聚集率等药效活性。安全性试验表明，W6.0g/kg剂量给SD大鼠 单次灌胃给药，穗花杉双黄酬最大耐受剂量为6 . Og/kg，未发现与药物有关的毒理学异常， 本品安全性较好。
[0009] 目前，已有少量穗花杉双黄酬用于抗癌、抗紫外线导致的皮肤损伤、治疗认知障 碍、降血糖、舒张血管等的报道。申请号为201510303792.4的专利申请中介绍，药物组合物 包括穗花杉双黄酬、当药苦巧、下香苦巧、猜牙菜巧，可W治疗肝癌、肺癌、胃癌。
[0010] 申请号为200910066695.2的专利申请中介绍，穗花杉双黄酬具有抗屯、肌缺血，可 用于治疗由屯、肌缺血等引起的屯、血管疾病。
[0011] 申请号为200910066524.X的专利申请中介绍，穗花杉双黄酬具有α-葡萄糖巧酶抑 制作用、降血糖作用和调血脂作用，可用于预防和治疗高血糖及高血脂症。
[0012] 申请号为2009100640581的专利申请中介绍，通过CC^致肝损伤小鼠模型体内实 验证实，穗花杉双黄酬能降低肝损伤小鼠的血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，达到保肝 降酶的作用。
[0013] 但是，上述现有技术并未报道将穗花杉双黄酬用于血小板减少症的治疗，更未公 开穗花杉双黄酬在治疗血小板减小症的应用。
[0014] W上所示穗花杉双黄酬的植物来源可W是卷柏科卷柏属江南卷柏 (S.Moellendo;rfii)、卷柏（S.Tamariscina)，垫状卷柏（S.pulvinata)等，也可 W是卷柏科 其他植物中分离，其来源也可W是化学合成，也可W是在某个黄酬类化合物的基础上进行 结构修饰或生物转化。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的在于提供一种穗花杉双黄酬在制备治疗血小板减小症的药物组合 物的用途。
[0016] 具体的，本发明设及一种治疗血小板减少症的药物组合物的用途，其中所述血小 板减少症包括由化疗药物所致的血小板减少、原发性和继发性血小板减少性紫齋、再生障 碍性贫血及骨髓增生异常综合症。
[0017] 进一步，本发明所述的血小板减少症为化疗药物所致血小板减少症。
[0018] 本发明提供了一种药物组合物，其包含穗花杉双黄酬和一种或多种药学上可接受 的药用赋形剂。
[0019] 本发明还提供了一种药物组合物，其含有有效治疗剂量的穗花杉双黄酬与其它药 物制成的制剂。其中，所述其它药物包括但不限于罗汉松双黄酬A^odoca巧usflavone A)、 栖双黄酬化ayaf lavone)、扁柏双黄酬化inokif lavone)等。
[0020] 本发明提供了一种药物组合物，其为由含有1%-99%的穗花杉双黄酬或其它可组 方的药物和99%-1 %的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。优选含有5%-50%的穗花 杉双黄酬或其它可组方的药物和95 % -50 %的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂。
[0021] 本发明通过添加药学尚可接受的常规辅料，将穗花杉双黄酬制备成口服制剂或注 射制剂，应用于临床治疗血小板减少症。
[0022] 进一步优选的，所述口服制剂为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、丸 剂、口服液体制剂当中的任何一种;所述的注射制剂为注射液或粉针剂。其中，口服制剂为 普通片剂、胶囊剂、分散片、口腔崩解片或缓释片;所述的注射制剂为注射液。
[0023] 本发明的技术效果:本发明首次发现了穗花杉双黄酬能够用于血小板减少症的治 疗。药效学试验证实穗花杉双黄酬能有效抑制因化疗药物导致的血小板减少和血小板减少 性紫齋的治疗，疗效显著，毒副作用小。
【附图说明】
[0024]
[0025] 图1:江南卷柏双黄酬类化合物对人巨核细胞株Dami细胞活性的影响
[0026] 与对照组比较，冲< 0.05，*冲< 0.01。
[0027] 图2 :MTT法检测江南卷柏双黄酬类化合物对Dami细胞的增殖作用 [002引与对照组比较，冲< 0.05，*冲< 0.01。
[0029] 图3:江南卷柏双黄酬类化合物对Dami巨核细胞集落生成的影响。
[0030] 图4:江南卷柏双黄酬类化合物对Dami巨核细胞多倍体的影响
[0031] 与对照组比较，冲<0.05，*冲<0.01。
[0032] 图5:江南卷柏双黄酬类化合物对Dami巨核细胞表面CD41表达率的影响
[0033] 与对照组比较，冲<0.05，*冲<0.01。
【具体实施方式】
[0034] W下是关于江南卷柏双黄酬类化合物的体外促进血小板生成的细胞活性筛选研 究，W及穗花杉双黄酬单体化合物的注射卡销致BALB/c小鼠血小板减少模型，及原发免疫 性血小板减少性紫齋小鼠模型的药效学试验研究。
[0035] 实施例1江南卷柏黄酬类化合物的体外细胞活性筛选
[0036] 1.1试验材料与仪器
[0037] 1.1.1试验材料
[0038] Dami细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司；RPMI-1640培养基，南京凯基生物科技 发展有限公司；胎牛血清，美国ScienCell公司；双抗(青霉素、链霉素)南京凯基生物科技有 限公司；台吩蓝，加拿大BioBasic有限责任公司；嚷挫蓝(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)，南京凯基生物科技发展有限公司;β-琉基乙醇，美国Amresco公司；姬姆萨(Giemsa)色 素，国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉，美国PeproTech公司；人血小板生成素化uman thrombopoietin，TPO)，美国PeproTech公司；CD41-FITC，美国BioLegend公司；舰化丙晚 (propidium iodide，PI)染料、RNA酶，美国Sigma公司；穗花杉双黄酬、栖双黄酬、罗汉松双 黄酬A、扁柏双黄酬等均从江南卷柏(S.Mollendo计ii)中分离得到，NMR，MS等波谱方法鉴定 结构，纯度均>95 %。
[0039] 1.1.2试验仪器：
[0040] 酶标仪，瑞±Tecan公司；倒置巧光显微镜，日本Nikon公司；FACS Calibar流式细 胞仪，美国抓公司。
[0041 ] 1.2试验方法
[0042] 1.2.1细胞培养及分组
[0043] RPMI-1640培养基中添加体积分数10%胎牛血清和1 %双抗配成完全培养基，于37 °C、5%C02、95%相对湿度条件下培养人巨核细胞株Dami，取对数生长期的细胞用于实验。 取穗花杉双黄酬、栖双黄酬、罗汉松双黄酬A、扁柏双黄酬等单体化合物分别溶解于二甲基 亚讽(DMS0)中，使储备液浓度为lOmmol/L，存放于-80°C冰箱中，使用时用完全培养基稀释 至所需浓度。细胞分组:按受试药在细胞培养液终浓度为0.5、2.5、12.5ymol/L分别与Dami 细胞共同培养，将完全培养基培养的细胞设为对照组。
[0044] 1.2.2台吩蓝染色实验检测细胞活性
[0045] 将按照1.2.1节方法常规培养4她的各组细胞悬液与质量分数0.4%的台吩蓝染液 按体积比9:1混合后，滴入计数板。静置Imin，使悬浮细胞下沉，在显微镜下计数。未着色的 为活细胞，呈蓝色的为死细胞。按照下式计算活细胞比例。
[0046] 活细胞比例（％ )=(细胞总数-死细胞数)/细胞总数X 100%
[0047] 1.2.3 MTT细胞增殖实验
[004引细胞达到对数生长期后按5X 104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔体积20化L， 每组设6个复孔。放入培养箱中常规培养4她后离屯、，弃去上清液，每孔加入20化质量分数 0.5 %MTT溶液，继续培养4h后弃去上清液，每孔加入150μΙ DMS0，在微量振荡仪上振荡 5min，于酶标仪上570nm波长处测定吸光度。
[0049] 1.2.4细胞集落培养实验
[0050] 取无菌离屯、管5支，按体积分数依次加入60%RPMI-1640培养基、10%β-琉基乙醇 α0mmol/L)、10%FBS、10%各组细胞悬液（调整细胞密度为104个/mL)、50ng/mLTP0，混匀 后在37°C条件下预热。取预热的琼脂迅速按10%体积分数加入到各组细胞悬液中，混匀后 接种于3.5cm培养皿上。数十分钟后待其凝固，放入培养箱中常规培养。5天后取出，在显微 镜下观察细胞集落生长情况，每个培养皿底米"字等分为8份，每份中选取两个视野，记 录每组集落数目之和，大于或等于10个细胞记为一个集落。
[00引]1.2.5细胞6161113日染色实验
[0052] 细胞常规培养2天后取各组细胞涂于载玻片上。待自然惊干后，于甲醇中固定 5min，然后在Giemsa染色液中浸染20min，流水冲洗后惊干，中性树胶封固并在显微镜下观 察，选取每张载玻片的4个顶角及载玻片中间共5个视野拍照。
[0053] 1.2.6流式细胞仪定量检测细胞DNA多倍体
[0054] 收集常规培养天的各组细胞于洁净的EP管中，调整细胞密度为1 X 106个/mL。细胞 固定15min后用体积分数70%乙醇通透细胞化，洗涂细胞两次，取lOOmL细胞悬液于流式细 胞上样管中，加入RNA酶，37°C条件下解育20min，再加入PI染料（对照组不加），避光作用 20min后每管加入憐酸盐缓冲液(PBS)至500mL，用流式细胞仪检测细胞DNA浓度分析其多倍 体生成情况。
[0055] 1.2.7流式细胞术测定细胞表面CD41含量
[0056] 流式细胞术细胞样本收集同1.2.6节，细胞洗涂两次后取lOOmL细胞悬液于流式细 胞上样管中，分别加入流式抗体CD41-門TC，每组设两个平行样并设IgG同型对照组。细胞与 抗体避光解育15min后，每管加入400mL PBS，在流式细胞仪上检测其表达情况。
[0057] 1.2.8数据分析
[0化引每项实验至少重复3次，数值采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，结果Wx +S 表示。多组均数的比较采用单因素方差分析(One-Way AN0VA)，两组间的比较采用t检验分 析。
[0化9] 1.3试验结果
[0060] 1.3.1江南卷柏双黄酬类化合物对人巨核细胞株Dami活性的影响
[0061] 各组细胞在培养箱中培养2d后，计算其活细胞比例，结果见附图1。2.5、12.扣Μ的 穗花杉双黄酬和12.5μΜ的罗汉松双黄酬A与细胞共同培养后，活细胞比例显著高于对照组， 其他双黄酬类化合物对细胞活性没有显著影响。
[0062] 1.3.2江南卷柏双黄酬类化合物对人巨核细胞株增殖能力的影响
[0063] 采用MTT法检测江南卷柏双黄酬类化合物对Dami细胞增殖能力的影响，如附图2所 示，0.5、2.5、12.5μΜ的穗花杉双黄酬和12.5ιχΜ的罗汉松双黄酬A与细胞共同培养后，可显著 增强dami细胞的增殖能力，其他双黄酬类化合物对细胞增殖能力没有显著影响。
[0064] 1.3.3江南卷柏双黄酬类化合物对Dami巨核细胞集落生成的影响
[0065] Dami巨核细胞集落培养结果见附图3，与对照组相比，0.5、2.5、12.5ιχΜ的穗花杉双 黄酬共同培养的细胞集落生成数目明显高于对照组，具有显著性差异(ρ<0.01)，其他双黄 酬类化合物各剂量组的细胞集落生成数目与对照组相比没有统计学差异。
[0066] 1.3.4江南卷柏双黄酬类化合物对Dami细胞DNA多倍体生成的影响
[0067] 如附图4所示，流式细胞仪检测细胞DNA多倍体数目结果显示，与对照组相比，12.5 μΜ穗花杉双黄酬与细胞共同培养后>8N细胞比例明显增加。其他双黄酬类化合物各剂量组 对巨核细胞多倍体的影响与对照组相比没有统计学差异。
[006引1.3.5江南卷柏双黄酬类化合物对Dami巨核细胞表面CD41表达量的影响 [0069]流式细胞术检测细胞表面CD41阳性表达率结果见附图5，与对照组相比，穗花杉双 黄酬（0.5、2.5、12.541)^个剂量组与细胞共同解育后表面〔041表达率明显增加（口< 0.01)。说明穗花杉双黄酬可增加细胞成熟度，其他双黄酬类化合物各剂量组与对照组相比 没有统计学差异。
[0070] 综上所述，巨核细胞增殖分化是血小板产生的前提，巨核细胞经过成熟、前血小板 的产生、细胞内外环境作用等一系列过程后最终将血小板释放到血液中。促进巨核细胞增 殖分化可W维持体内血小板活化调亡后数目的稳定。
[0071] 本研究首次发现穗花杉双黄酬能明显增强Dami细胞活性，细胞增殖能力也明显增 强，细胞Giemsa染色实验与细胞DNA多倍体检测结果分别定性、定量地说明了细胞在穗花杉 双黄酬作用下分化能力显著增强，与此同时细胞的成熟度也相应增加。因此，穗花杉双黄酬 能够在体外有效促进人巨核细胞的增殖分化。
[0072] 实施例2穗花杉双黄酬对注射卡销致BALB/c小鼠血小板减少模型的影响
[0073] 2.1试验材料与仪器
[0074] 2.1.1试验药品及配制方法：
[00对卡销注射液，规格100mg:10ml，齐鲁制药有限公司，批号：9080082ES，临用前用生 理盐水配成6.25mg/ml。
[0076] 注射用重组人白介素-ll(IL-ll)，规格100mg:10ml，齐鲁制药有限公司，批号： 201412061SM，临用前用生理盐水配成0.05mg/ml。
[0077] 试药穗花杉双黄酬，实验室自制，临用前用生理盐水配置成0.5、1.5、5mg/ml，用于 灌胃给药。
[007引 2.1.2试验仪器：
[00巧]血球计数板，上海求精生化试剂有限公司；0LYMPUS-CH普通光学显微镜，日本 OLYMPUS公司。
[0080] 2.1.3试验动物：
[0081 ] 清洁级BALB/C小鼠，雄性，体重24-28g，扬州大学比较医学中屯、，合格证号：SCXK (苏）2012-0004。
[0082] 2.2试验方法
[0083] 2.2.1动物分组及给药方法
[0084] 60只BALB/C小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型组、阳性药 比-11组、穗花杉双黄酬组低、中、高剂量组（10、30、100111肖/1^)。化疗前7天((1-7)，正常对照 组、模型组和阳性药化-11组分别灌胃给予生理盐水0.2ml/10g/d，穗花杉双黄酬低、中、高 组按0.2ml/10g体积分别灌胃给予10、30、lOOmg/kg/d穗花杉双黄酬混悬溶液，各组每天给 药，连续7天(d-7~d-1);化疗前最后1天灌胃后(d-1)，开始化疗，模型组、阳性药IL-11组和 穗花杉双黄酬低、中、高剂量组分别一次性腹腔注射125mg/kg卡销，正常对照组腹腔注射等 体积生理盐水;次日（dl)，正常对照组和模型组继续分别灌胃给予生理盐水0.2ml/10g/d， 阳性药化-11组按0.2ml/10g皮下注射化-11 0.25mg/kg/d，穗花杉双黄酬低、中、高组按 0.2ml/10g体积分别灌胃给予10、30、100mg/kg/d穗花杉双黄酬溶液，各组每天给药，连续14 天(dl~dl4)。
[0085] 2.2.2指标检测方法
[00化]2.2.2.1试验动物一般状况
[0087] 观察小鼠精神状况、活动及死亡情况。
[0088] 2.2.2.2试验动物体重变化
[0089] 于d-8、d-4、d-1、d3、d7、dl 0、dl 4称量体重，记录体重变化。
[0090] 2.2.2.3外周血小板计数
[0091] 各组动物分别于(1-8、(1-4、(1-1、(13、(17、(110、(114，尾部取血，参照徐叔云编写的1994 版《药理实验方法学》第1106~1107页方法，用血细胞计数板，手工计算外周血小板数量。
[0092] 2.2.2.4统计学方法
[0093] 统计描述用"平均值±标准差"（x±s)表示，多组间均值比较采用单因素方差分 析，组间两两比较采用LSD-t检验。
[0094] 2.3试验结果
[00巧]2.3.1试验动物一般状况
[0096] 造模前，各组小鼠毛色发亮，活动自如，行为、精神状态正常;造模后的小鼠毛色枯 橘，出现身体发软、扎堆、精神萎靡、眯眼、反应迟纯、软便等，阳性药IL-11组和穗花杉双黄 酬低、中、高剂量组的小鼠，行为及精神状态较模型组有所改善。
[0097] 2.3.2试验动物体重的变化
[0098] 各组试验动物化疗前后体重变化见表1。化疗前，正常对照组、模型组、阳性药IL- 11组、不同剂量的穗花杉双黄酬组，小鼠体重均正常增长，各组与空白对照组比较，均无显 著性差异。化疗后，模型组小鼠体重明显减轻，与正常对照组有显著性差异；阳性药IL-11组 小鼠在化疗初期体重明显减轻，化疗后第1〇、14天，体重趋于稳定，与模型组相比有显著性 提高;给予不同剂量的穗花杉双黄酬组小鼠在化疗初期体重明显减轻，化疗中、后期，体重 趋于稳定，并有所回升，其中高剂量组最为明显，与模型组相比体重显著性提高。
[0099] 表1试验动物体重的变化（x±s)
[0100]
[0101] 注:与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
[0102] 2.3.3外周血小板计数
[0103] 由表2可见，试验前各组动物的血小板计数无明显差异。化疗前，穗花杉双黄酬组 预给药一周后，中剂量和高剂量组小鼠的血小板计数明显高于正常对照组。化疗后，模型组 小鼠的血小板计数显著下降。阳性药IL-11组和穗花杉双黄酬低、中、高剂量组小鼠的血小 板计数均出现不同程度的回升，其中穗花杉双黄酬高剂量组效果最为明显。
[0104] 表2各组试验动物外周血小板计数的变化（XlOVUx ±s)
[0105]
[0106] 注:与模型组相比，*p<0.05,料p<0.01。
[0107] 2.4 结论
[0108] 由W上结果可知，分别连续21天灌胃给予10、30、100mg/kg穗花杉双黄酬溶液，可 W显著抑制化疗药物卡销导致的BALB/C小鼠外周血中血小板降低，其中30、100mg/kg剂量 组疗效优于〇.25mg/kg剂量的IL-11组。说明穗花杉双黄酬可W用于化疗导致血小板减少症 的治疗。
[0109] 实施例3穗花杉双黄酬对特发性血小板减少性紫齋的影响
[0110] 3.1试验材料与仪器
[0111] 3.1.1试验药品及配制方法：
[0112] 醋酸泼尼松片，规格:5mg/片，天津药业集团新郑股份有限公司，批号：150126,临 用前研成粉末，用生理盐水配成Img/ml的混悬液。试药穗花杉双黄酬，实验室自制，临用前 用生理盐水配置成〇.5、1.5、5mg/ml，用于灌胃给药。
[0113] 3.1.2试验仪器：
[0114] 血球计数板，上海求精生化试剂有限公司；0LYMPUS-CH普通光学显微镜，日本 OLYMPUS公司。
[0115] 3.1.3试验动物：
[0116] 清洁级BALB/C小鼠，雄性，体重18-22g，扬州大学比较医学中屯、，合格证号：SCXK (苏）2012-0004:健康普通级豚鼠，体重250-350g，青龙山动物繁殖场，许可证号：SYXK(苏） 2010-0006。
[0117] 3.2试验方法
[011引 3.2.1豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清的制备
[0119] 抗原的制备:取BALB/C小鼠断头取全血，肝素抗凝，800巧m离屯、lOmin后，取上层富 含血小板血浆(PRP)3000rpm离屯、lOminW沉淀血小板。用0.15moL/L pH7.4的憐酸盐缓冲液 (PBS)洗涂血小板，每次均W300化pm离屯、lOmin，弃去上层液体，连续3次。然后W〇.15moL/ LpH7.4PBS悬浮血小板，计数后备用。
[0120] 免疫方法:取上述制备好的BALB/C小鼠血小板分别与等量完全弗氏佐剂和不完全 弗氏佐剂混合成油包水型乳剂。取完全弗氏佐剂抗原于ο周皮下注射于豚鼠足掌、腹部、背 部、蔽窝等处，至少四点，每点〇.2mL。取不完全弗氏佐剂抗原于1、2、4周皮下注射于豚鼠足 掌、腹部、背部、蔽部等处，每次至少四点，每点〇.2mL。每次注射完后在注射点用舰酒消毒W 防感染。第五周乙酸麻醉豚鼠，股动脉取不抗凝全血，室溫放置化，然后置4 °C过夜，此时血 清已与血块分离，吸出血清，150化pm离屯、20min，取上清液即为豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗 血清(GP-APS)，胆存于-20°C冰箱中待用。
[0121] 抗血清(APS)效价的检测:参照化ISA法加 W改进，用国产冻干酶联A蛋白纯品代替 碱性憐酸酶-蛋白A酶标抗体，原理相同。
[0122] 抗血清(APS)的处理:将APS从-20°C中取出，于56°C水浴30min，用等量BALB/C小鼠 红细胞(5%)吸附至少两次，用生理盐水稀释成1:4的AI^待用。
[0123] 3.2.2动物分组及给药方法
[0124] 60只BALB/C小鼠，随机分为6组，每组10只，分别为:正常对照组、模型组、阳性药醋 酸泼尼松组、穗花杉双黄酬组低、中、高剂量组（10、30、100111肖/1^)。造模第5天((15)开始按 0.2mL/10g/d灌胃给药，至造模后第14天(dl4)。正常对照组、模型组灌胃生理盐水，阳性药 醋酸泼尼松组按20mg/kg剂量灌胃醋酸泼尼松混悬液，穗花杉双黄酬组低、中、高剂量组分 另峨10、30、100mg/kg剂量给药。
[0125] 3.2.3原发免疫性血小板减少性紫齋模型的建立
[01%] 于(11、(13、(15、(17、(19、(111、(113，正常对照组腹腔注射0.11111720旨生理盐水，其余5组 小鼠分别腹腔注射0. lmL/20g的1:4豚鼠抗血小板血清(APS)。
[0127] 3.2.4指柄;检测方法
[012引 3.2.4.1小鼠一般状况
[0129] 观察小鼠精神状况、活动及死亡情况。
[0130] 3.2.4.2 脾脏系数
[0131 ]于dl4给药后处死，剥取脾脏，用生理盐水冲洗，吸去水分，精密称量，计算脏器系 数，脾脏系数=脾脏质量/小鼠体重X 100 %。
[0132] 3.2.4.3外周血小板计数
[0133] 各组动物分别于造模前(do)、给药前(d4)、试验结束时(dl4)，尾部取血，参照徐叔 云编写的1994版《药理实验方法学》第1106~1107页方法，用血细胞计数板，手工计算外周 血小板数量。
[0134] 3.2.4.4统计学方法
[0135] 统计描述用"平均值±标准差"（x±s)表示，多组间均值比较采用单因素方差分 析，组间两两比较采用LSD-t检验。
[0136] 3.3试验结果
[0137] 3.3.1小鼠一般状况
[0138] 正常对照组小鼠反应灵活，毛色光亮，大便呈条状。模型组在造模后第3天出现软 便，大部分均表现出反应迟纯、虚弱、眯眼、竖毛、扎堆、体重减轻等症状，小部分消化道出 血、便血。各给药组与模型组小鼠比较，一般状况有所好转。
[0139] 3.3.2脾脏系数
[0140] 试验结束时，将各组试验小鼠处死、解剖后可见，各脏器未见明显异常。由表4可 见，与正常对照组相比，模型组小鼠的脾脏指数明显下升高。与模型组相比，阳性药醋酸泼 尼松组小鼠脾脏指数显著降低，接近正常水平;穗花杉双黄酬低、中、高剂量组小鼠的脾脏 指数有所降低，高剂量组具有显著性差异。
[0141] 表4各组试验动物脾脏指数比较（X ±s)
[0142]
[0143] 3.3.3外周血小板计数
[0144] 各组动物在造模前(do)、给药前(d4)、试验结束时(dl4)的外周血小板计数结果见 表5。由结果可见，造模前各组动物的血小板计数无明显差异。造模后，与正常对照组相比， 模型组、阳性药醋酸泼尼松组和穗花杉双黄酬低、中、高剂量组小鼠的外周血小板计数显著 下降。给药10天后，与模型组相比，阳性药醋酸泼尼松组、穗花杉双黄酬低、中、高剂量组小 鼠的外周血小板计数显著升高，其中穗花杉双黄酬高剂量组效果最为明显。
[0145] 表5各组试验动物外周血小板计数的变化（X ±s)
[0146]
[0147] 注：与正常对照组相比，胃p<0.001;与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p< 0.001。
[014引 3.4结论
[0149] 由W上结果可知，分别连续10天灌胃给予10、30、100mg/kg穗花杉双黄酬溶液，可 W显著抑制豚鼠抗BALB/C小鼠血小板抗血清导致的BALB/C小鼠免疫性血小板减少，其中 30、100mg/kg剂量组疗效优于20mg/kg剂量的醋酸泼尼松组。说明穗花杉双黄酬可W用于免 疫性血小板减少性紫齋的治疗。
[0150] 实施例4穗花杉双黄酬片剂的制备
[0151] 分别取穗花杉双黄酬、微晶纤维素、簇甲基纤维素钢、滑石粉、硬脂酸儀适量，分别 过80目筛网，备用。取过80目筛穗花杉双黄酬50g、微晶纤维素120g、簇甲基纤维素钢30g充 分混合均匀，加入适量水做粘合剂，过24目筛网制粒，放入60°C烘箱干燥2小时，过24目筛网 整粒，加入适量硬脂酸儀和滑石粉，混合均匀，压片，制成1000片，即得。规格:50mg，每次2 片，每日2次。
[0152] 实施例5穗花杉双黄酬注射剂的制备
[0153] 取穗花杉双黄酬lOg，加入适量0.9 %氯化钢溶液溶解后，加入适量增溶剂及稳定 剂，配制至10L，过滤，分装成每瓶1 OmL，热压灭菌，即得。规格：1 Omg: 10ml，每次1支，每日1 次，临用前用100ml生理盐水稀释，静脉滴注。
【主权项】
1. 穗花杉双黄酮在制备治疗血小板减少症药物组合物的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述血小板减少症包括由化疗药物所致的 血小板减少、原发性和继发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血及骨髓增生异常综合症。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:所述血小板减少症为化疗药物所致血小板 减少症。4. 根据权利要求1-3中所述的用途，其特征在于:所述药物组合物含有有效治疗剂量的 穗花杉双黄酮和一种或多种药学上可接受的药用赋形剂。5. 根据权利要求1-3中所述的用途，其特征在于:所述药物组合物含有有效治疗剂量的 穗花杉双黄酮与其它药物制成的制剂。6. 根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，其为含有1 %-99 %的穗花杉双 黄酮或其它可组方的药物和99%-1%的药用赋形剂制成的口服制剂或注射制剂;优选为含 有5 % -50 %的穗花杉双黄酮或其它可组方的药物和95 %-50 %的药用赋形剂制成的口服制 剂或注射制剂。7. 根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述的口服制剂选自于片剂、胶囊剂、 软胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、丸剂、口服液体制剂当中的任何一种。8. 根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述的注射制剂为注射液或粉针剂。9. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的片剂为普通片剂、分散片、□腔崩解 片或缓释片。10. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的注射制剂为注射液。
【文档编号】A61P7/06GK105878232SQ201511033033
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年12月31日
【发明人】汪豪, 熊非
【申请人】南京豪创药物科技有限责任公司