具有抑菌功效医用温敏水凝胶的制备方法
【专利摘要】本发明了公开了具有抑菌功效医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，以壳聚糖纳米银复合物、甘油磷酸钠为原料，制得在室温条件下为可流动胶体溶液，而在加热条件下，可转变为不流动的凝胶，即为含有纳米银的医用温敏水凝胶。本发明所得具有抑菌功效医用温敏水凝胶的制备方法科学，工艺简单，所得产品具有抑菌、促进创伤愈合、止血的作用，有良好的保湿、透气性，无细胞毒性，抑菌效果好，作用持久。
【专利说明】
具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及医药材料领域，特别是设及具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖是自然界唯一大量存在的碱性多糖，是甲壳素经脱乙酷化后形成的一种阳 离子多糖。壳聚糖广泛存在于节肢动物的外壳、真菌和酵母的细胞壁中，资源量非常丰富， 同时具有可生物降解性、良好的生物相容性、无毒、抑菌等特性，壳聚糖分子上具有大量的 径基和氨基，易被化学修饰，能与金属离子结合形成配合物，形成一系列新型壳聚糖衍生 物，具有了更多的生物学功能，因此在医学、生物学领域得到了深入的研究和广泛的应用。 银离子在早期就由于其优异的抗菌杀菌性能被人们所广泛关注，其在医药材料和抗菌材料 等领域具有广阔的应用前景。纳米银是W纳米技术为基础研制而成的新型抗菌产品，比Ag +具有更稳定的物理化学特性，纳米银由于量子效应、小尺寸效应，不易产生耐药性，加速伤 口的愈合，在医药材料和抗菌材料等领域具有广阔的应用前景。
[0003] 溫度敏感型水凝胶是指随着外界溫度的变化而产生刺激响应性的智能材料。溫度 敏感型水凝胶结构中具有一定比例的亲水和疏水基团，溫度的变化可W影响运些基团的疏 水作用和大分子链间的氨键作用，从而影响其形态变化。与合成高分子相比，天然高分子凝 胶具有低毒性、生物相容性和可降解性等优点。溫敏性壳聚糖水凝胶可根据溫度变化处于 不同物理形态。常溫下为液态，进入人体组织后，在体溫作用下凝胶化而固定在局部组织 中。壳聚糖只在酸性环境下保持溶液状态，当抑值升高到6.2时，壳聚糖溶液开始出现沉 淀，若加入甘油憐酸钢，该系统可在中性条件下保持溶液状态，该系统具有溫度敏感性，在 体溫W下保持溶液状态，溫度升高到体溫时可形成凝胶。它具有生物相容性好、体内降解时 间及凝固时间可调节控制等优点，在工程等领生物工程、医药领域已经得到广泛关注。
[0004] 授权公告号CN 104984401 A(申请号201510434128.3)的中国专利文献公开了一 种溫敏水凝胶/憐酸Ξ巧材料的制备方法，该方法步骤流程包括将溫敏水凝胶在低溫下溶 解、按一定比例加入憐酸Ξ巧粉体、混合材料随意塑形成任何想要的形状。公布号CN 103004757 A(申请号201210571657.4)的中国专利文献公开了一种多孔溫敏水凝胶缓释剂 及其制备方法。本发明W聚N-异丙基丙締酷胺多孔溫敏水凝胶为载体，在凝胶内负载上药 物，利用聚N-异丙基丙締酷胺的溫度敏感特性，来实现对药物的控制释放。当溫度低于水凝 胶的LCST时，药物释放很慢，而当溫度高于其LCST时，释放速率加快。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的 制备方法，该溫敏水凝胶W壳聚糖纳米银复合物、甘油憐酸钢为原料，制得在室溫条件下为 可流动胶体溶液，而在加热条件下，可转变为不流动的凝胶，即为医用溫敏水凝胶，并具有 良好的抑菌作用，抗菌谱广、无细胞毒性，高效低毒。
[0006] 本发明的技术方案是： 具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖和硝酸银粉碎，混合均匀后，研磨1-4小时，再加入还原剂巧樣酸钢，继续 研磨3-6小时(优选的：继续研磨4-5小时;更加优选的：继续研磨4.5小时），制成壳聚糖纳米 银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至醋酸溶液中，揽拌至完全溶解，得到质 量浓度为1-2%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入甘油憐酸钢溶液，快速揽拌 均匀并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至6.9-7.2; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成医用 溫敏水凝胶。
[0007] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤（1)壳聚糖与硝酸银的质量比为100: 0.01-0.1 (优选的：质量比为100:0.03-0.07;更加优选的：质量比为100:0.05)。
[0008] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤（1)继续研磨2-3小时(优选的：继续研磨 2.5小时）。
[0009] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤（1)还原剂巧樣酸与硝酸银的还原当量 比为1-2:1(优选的:还原当量比为1.5:1)。
[0010] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤(2)醋酸溶液的浓度为0.08-0.2mol/L (优选的:醋酸溶液的浓度为0.12-0.16mol/L;更加优选的:醋酸溶液的浓度为0.14mol/L)。
[0011] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤(2)壳聚糖纳米银复合物溶液的质量浓 度为1.2-1.8%(优选的:壳聚糖纳米银复合物溶液的质量浓度为1.5%)。
[0012] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤(3)加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖 纳米银复合物溶液体积的0.1-0.2倍(优选的：加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复 合物溶液体积的0.15倍）。
[0013] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤（3)甘油憐酸钢溶液的质量浓度为52- 60%(优选的：甘油憐酸钢溶液的质量浓度为54-58%;更加优选的甘油憐酸钢溶液的质量浓 度为56%)。
[0014] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤(3)调节抑值至7.0-7.1(优选的：调节抑 值至7.05)。
[0015] 所述的医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤(4)水浴锅恒溫加热的溫度为％-40°C (优选的:水浴锅恒溫加热的溫度为36-38 °C ;更加优选的:水浴锅恒溫加热的溫度为37 °C )。
[0016] 本发明提供的具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法科学，工艺简单，所得产 品具有抑菌、促进创伤愈合、止血的作用，有良好的保湿、透气性，无细胞毒性，抑菌效果好， 作用持久。除此之外，本发明的优良效果还表现在： 1. 本发明所得产品，同时具有纳米银和壳聚糖的特点和优势，不仅具备纳米银抗菌 性，还具备壳聚糖促进细胞生长，可减少瘤痕生成的作用； 2. 制备过程中W壳聚糖为载体制成壳聚糖纳米银复合物，壳聚糖作为纳米银的分散 剂和保护剂，使纳米银均匀、稳定的分布溫敏水凝胶体系中。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例和实验例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。
[0018] 实施例1具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖30g和硝酸银0.003g粉碎，混合均匀后，研磨1小时，再加入还原剂巧樣酸 钢0.003g，继续研磨3小时，制成壳聚糖纳米银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至浓度为0.08mol/L的醋酸溶液中，揽拌 至完全溶解，得到质量浓度为1%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入质量浓度为52%的甘油憐酸 钢溶液，加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的0.1倍，快速揽拌均匀 并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至6.9; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用34°C水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成 医用溫敏水凝胶。
[0019] 实施例2具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖30g和硝酸银0.0：3g粉碎，混合均匀后，研磨4小时，再加入还原剂巧樣酸钢 0.054g，继续研磨6小时，制成壳聚糖纳米银复合物； (2) 将步骤(1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至浓度为0.2mol/L的醋酸溶液中，揽拌至 完全溶解，得到质量浓度为2%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入质量浓度为60%的甘油憐酸 钢溶液，加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的0.2倍，快速揽拌均匀 并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至7.2; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用40°C水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成 医用溫敏水凝胶。
[0020] 实施例3具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖30g和硝酸银0.009g粉碎，混合均匀后，研磨2小时，再加入还原剂巧樣酸 钢0.009g，继续研磨4小时，制成壳聚糖纳米银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至浓度为0.12mol/L的醋酸溶液中，揽拌 至完全溶解，得到质量浓度为1.2%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入质量浓度为54%的甘油憐酸 钢溶液，加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的0.1倍，快速揽拌均匀 并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至7.0; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用36°C水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成 医用溫敏水凝胶。
[0021] 实施例4具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖30g和硝酸银0.021g粉碎，混合均匀后，研磨3小时，再加入还原剂巧樣酸 钢0.0378g，继续研磨5小时，制成壳聚糖纳米银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至浓度为0.16mol/L的醋酸溶液中，揽拌 至完全溶解，得到质量浓度为1.8%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入质量浓度为58%的甘油憐酸 钢溶液，加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的ο. 2倍，快速揽拌均匀 并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至7.1; (4)将步骤(3)所得溶液加入容器内，用38°C水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成 医用溫敏水凝胶。
[0022] 实施例5具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的制备方法，步骤如下： (1) 取壳聚糖30g和硝酸银0.015g粉碎，混合均匀后，研磨2.5小时，再加入还原剂巧樣 酸钢0. 〇21g，继续研磨4.5小时，制成壳聚糖纳米银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至浓度为0.14mol/L的醋酸溶液中，揽拌 至完全溶解，得到质量浓度为1.5%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入质量浓度为56%的甘油憐酸 钢溶液，加入甘油憐酸钢溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的0.15倍，快速揽拌均 匀并测量pH值，并用饱和的憐酸氨二钢溶液调节pH值至7.05; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用37°C水浴锅恒溫加热，待溶液不流动时，即形成 医用溫敏水凝胶。
[0023] 试验例1本发明所得具有抑菌功效医用溫敏水凝胶的抑菌性能测试： 1.药品和材料:壳聚糖(购于浙江金壳生物化学有限公司），壳聚糖纳米银复合物(实验 室自制）;硝酸银、甘油憐酸钢、憐酸氨二钢、冰醋酸(均为分析纯）;培养基:牛肉膏蛋白腺培 养基、沙氏培养基、血清培养基等。
[0024] 细菌:革兰氏染色阳性菌化+):金黄色葡萄球菌临床菌(聊城市中医医院提供）、金 黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923(聊城市人民医院提供）； 革兰氏染色阴性菌化-):大肠杆菌临床菌株、肺炎克雷伯菌临床菌株、阴沟肠杆菌临床 菌株、肺炎链球菌临床菌株、铜绿假单胞菌临床菌株(均由聊城市中医医院提供）;大肠杆菌 标准菌株ATCC25922、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853、流感嗜血杆菌临床菌株(均由聊城 市人民医院提供）； 真菌：白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌(均由聊城市中医医院提供）。
[002引2.试验方法:将保存的10种细菌菌种分别进行活化培养，待生长出单菌落后，用接 种环挑取少许菌体于装有9ml无菌生理盐水的试管内，振荡均匀，分别制备107c化/ml的悬 浮液。在无菌条件下，在90mm的培养皿中加适量的培养基，凝固后加100微升菌液，涂布均 匀，静置25min。将制备的各溫敏水凝胶样品分别做成直径为0.4cm的圆形，放置在固体培养 基上，同一培养皿上依次放置壳聚糖溫敏水凝胶、0.01%含纳米银溫敏水凝胶、0.025%含纳 米银溫敏水凝胶、0.05%含纳米银溫敏水凝胶，重复6次，细菌在37°C的恒溫培养箱中培养 24h;观察样品与培养基的接触面有无细菌生长，并测量抑菌圈的大小，采用SPSS vll. 5软 件统计分析，数据W均数±标准差(S ± S)表示。
[0026] 将保存的Ξ种真菌菌种分别进行活化培养，分别制备浓度为lX106cfu/ml的菌 液，其它操作同上，37Γ的恒溫培养箱中培养4她，观察样品与培养基的接触面有无细菌生 长，测量抑菌圈的大小。采用SPSS软件统计分析，计量资料W均数±标准差G±S)表示。
[0027] 3.结果分析： 四种不同纳米银含量的溫敏水凝胶对10种细菌的接触抑菌抑菌圈直径如表1所示： 表1各样品对10种细菌的接触抑菌抑菌圈直径(单位:cm;样品直径0.4cm)
注:样品1: ο. 05%含纳米银的溫敏水凝胶;样品2: ο. 025%含纳米银的溫敏水凝胶;样品 3:0.01%含纳米银的溫敏水凝胶;样品4:壳聚糖溫敏水凝胶。
[0028] 由表1可知，含纳米银的溫敏水凝胶及壳聚糖溫敏水凝胶均具有较好的接触抑菌 作用，样品与培养基的接触面均无细菌生长;且随着纳米银含量的增加，抑菌效果增强，说 明纳米银可增强壳聚糖溫敏水凝胶的抑菌作用。
[0029] 四种不同纳米银含量的溫敏水凝胶对巧巾真菌的接触抑菌抑菌圈直径如表2所示： 表2各样品对Ξ种真菌的接触抑菌抑菌圈直径(单位:cm;样品直径0.4cm)
注:样品1:0.05%含纳米银的溫敏水凝胶;样品2:0.025%含纳米银的溫敏水凝胶;样品 3:0.01%含纳米银的溫敏水凝胶;样品4:壳聚糖溫敏水凝胶。
[0030] 由表2可知，含纳米银的溫敏水凝胶及壳聚糖溫敏水凝胶对Ξ种真菌均具有较好 的接触抑菌作用，凝胶样品与培养基的接触面均无真菌生长，随着纳米银含量的增加，抑菌 作用增强。含纳米银的溫敏水凝胶对光滑念珠菌的的抑菌作用最明显，其次是白色念珠菌， 对克柔念珠菌的抑菌作用最弱。
[0031] 4.总结:含纳米银的溫敏水凝胶对W大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌，对W金黄 色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，对W白色念珠菌为代表的真菌，均具有较好的接触抑 菌作用，对细菌的抑菌作用优于对真菌的抑菌作用；随着纳米银含量的增加，抑菌作用增 强，纳米银增强了壳聚糖溫敏水凝胶的抑菌作用。
[0032] 试验例2本发明所得具有抑菌功效医用溫敏水凝胶(实施例5)的性能测定： 1.低临界溶解溫度化CST)的测定： 采用差示扫描量热仪进行测定，称取本发明所得医用溫敏水凝胶，在室溫下达到平衡 溶胀状态，W5°C/min的升溫速率进行测试，测试的溫度范围为20-40°C。
[0033] 测试结果显示，本发明所得产品的低临界溶解溫度为32°C，说明当溫度逐渐升高 时，水凝胶的溶胀比下降，当达到或高于32°C时，水凝胶即会发生相转变。
[0034] 2.初始凝胶化时间测定： 将本发明所得水凝胶在室溫下充分溶胀，取2ml的样品注入10ml的离屯、管内，分别放入 不同溫度梯度的恒溫水浴锅内，并开始计时，每隔一段时间倾斜或倒转试管，当离屯、管倒置 80s后，溶液不再流动为标准判定为形成凝胶，将该时间作为初始凝胶化时间，记录溫度和 初始凝胶化时间。
[0035] 试验结果： 表3不同溫度对初始凝胶时间的影响
由表3可知，在36-38Γ范围内，初始凝胶化的时间最短，说明本发明所得产品相转变的 最佳时间为37Γ，在人体正常体溫环境下，可有效提高相转变效率，实际应用效果好。
[0036] 应当指出的是，【具体实施方式】只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技 术方案不限于上述实施例，还可W有很多变形。本领域的普通技术人员，W本发明所明确公 开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。
【主权项】
1. 具有抑菌功效医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，以壳聚糖纳米银复合物、甘 油磷酸钠为原料，制得在室温条件下为可流动胶体溶液，而在加热条件下，可转变为不流动 的凝胶，即为医用温敏水凝胶;具体步骤如下： (1) 取壳聚糖和硝酸银粉碎，混合均匀后，研磨1-4小时，再加入还原剂柠檬酸钠，继续 研磨3-6小时(优选的：继续研磨4-5小时;更加优选的：继续研磨4.5小时），制成壳聚糖纳米 银复合物； (2) 将步骤（1)所得壳聚糖纳米银复合物加入至醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，得到质 量浓度为1-2%的壳聚糖纳米银复合物溶液； (3) 向步骤(2)所得壳聚糖纳米银复合物溶液中，逐滴加入甘油磷酸钠溶液，快速搅拌 均匀并测量pH值，并用饱和的磷酸氢二钠溶液调节pH值至6.9-7.2; (4) 将步骤(3)所得溶液加入容器内，用水浴锅恒温加热，待溶液不流动时，即形成医用 温敏水凝胶。2. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1)壳聚糖与硝 酸银的质量比为100:0.01-0.1(优选的：质量比为100:0.03-0.07;更加优选的：质量比为 100:0.05)。3. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)继续研磨2-3 小时(优选的:继续研磨2.5小时）。4. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1)还原剂柠檬 酸与硝酸银的还原当量比为I-1.8:1(优选的:还原当量比为1.4:1)。5. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)醋酸溶液的 浓度为〇. 08-0.2mol/L(优选的:醋酸溶液的浓度为0.12-0.16mol/L;更加优选的：醋酸溶液 的浓度为〇.14mol/L)。6. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)壳聚糖纳米 银复合物溶液的质量浓度为1.2-1.8%(优选的：壳聚糖纳米银复合物溶液的质量浓度为 1·5%)〇7. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)加入甘油磷 酸钠溶液的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的〇. 1-0.2倍(优选的:加入甘油磷酸钠溶液 的量为壳聚糖纳米银复合物溶液体积的〇. 15倍）。8. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)甘油磷酸钠 溶液的质量浓度为52-60%(优选的:甘油磷酸钠溶液的质量浓度为54-58%;更加优选的甘油 磷酸钠溶液的质量浓度为56%)。9. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)调节pH值至 7.0-7.1 (优选的：调节pH值至7.05)。10. 如权利要求1所述的医用温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(4)水浴锅恒温 加热的温度为34-40°C(优选的：水浴锅恒温加热的温度为36-38°C ;更加优选的：水浴锅恒 温加热的温度为37 °C)。
【文档编号】A61P17/02GK105878280SQ201610220024
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月11日
【发明人】桑青, 秦东风, 李高青, 崔凯
【申请人】聊城大学