载cxcr4小分子rna聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒的制作方法

文档序号:10521764阅读:466来源:国知局
载cxcr4小分子rna聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种载CXCR4小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒及其制备方法,其特征在于以聚酰胺一胺型树枝状聚合物为载体,CXCR4小分子RNA与聚酰胺树枝状聚合物按1∶0.73(质量比),形成聚酰胺树枝状聚合物CXCR4小分子RNA交联复合物,微球粒径在25℃时平均粒径为176.5纳米。所得纳米微粒粒径小,对小分子RNA包裹率高,携带量大,增加细胞转染率,具有小分子干扰技术高效、特异的优点。疾病治疗中用于抗肾癌治疗,提高基因抗肾癌治疗效果。
【专利说明】
载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新型药物剂型,具体为载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物 纳米微粒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 基质细胞衍生因子-1 (stromal ceU-derived factorl, SDF-1)是趋化因子家族 的一个新成员,其唯一受体趋化因子受体4(chemokine receptor4, CXCR4)广泛表达在许 多组织和器官上。近几年来国内外有关研究表明SDF-1/CXCR4生物学轴在肾癌细胞的转 移、调亡等方面发挥着重要的作用。CXCR4的过度表达,可W促进肾癌细胞的增殖,而抑制 CXCR4的表达则可W起到诱导肾癌细胞调亡的效果,并对肾癌的转移起到抑制的作用。
[0003] 反义技术是近年肿瘤治疗研究的一种有效基因治疗手段,对于封闭有害基因表 达,阻断肿瘤发生发展具有重要价值。在各种反义手段中,新近出现的核糖核酸干扰(RNA interference, RNAi)技术尤其引人注目,是指由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达的过程,具有特异、高效的特点,作为新兴的基因 阻断技术,将在人类基因功能研究、基因治疗方面具有巨大的应用前景。而shRNA是核糖核 酸干扰技术中最关键的效应分子。
[0004] 纳米技术作为一口新兴学科已交叉渗透到其它众多学科领域,在生物医药领域的 最突出表现在于其作为药物载体具有广阔的应用前景。最近国外采用聚醜胺-胺型树枝状 聚合物(PAMAM den化imers)较W往采用的聚乳酸-居基己酸共聚物(PLGA)等纳米载体比 较具有携带量更大、透膜能力更强、缓释性更好、对人体无害等多方面的优点,但迄今国内 外均未见聚醜胺-胺型树枝状聚合物携带CXCR4小分子RNA的报道。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于W 7代佑7)的聚醜胺-胺型树枝状聚合物作为载体,将其与 CXCR4小分子RNA相结合,制备出载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒。该纳 米微粒可较大的提高小分子RNA的携带量、转染率,增强小分子RNA的祀向特异性,且对人 体无毒,较好的提高了 CXCR4小分子RNA抗肾癌治疗效果。
[0006] 本发明提出的上述载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒具体制备步 骤如下:
[0007] 精密提取1 0D小分子RNA离必,用45微升的超纯水稀释,得到溶液A ;取15微升 7代聚醜胺-胺型树枝状聚合物(G,代PAMAM demlrimers)溶液用30微升超纯水稀释得溶 液B ;取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C ;取A溶液1微升,C溶液5微升,加入15微升 无血清培养基中,使CXCR4小分子RNA与聚醜胺-胺型树枝状聚合物的质量比为1 : 0. 73, 在室温下赔育10分钟,即得载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒。
[0008] 本发明的纳米药物是W聚醜胺-胺型树枝状聚合物为载体,与CXCR4小分子RNA 相互交联形成纳米微粒。该种纳米微粒平均粒径在25°C为176. 5纳米,且在体外可较好的 保护小分子RNA免受破坏。
[0009] 上述微粒的载体为7代聚醜胺-胺型树枝状聚合物。
[0010] 上述微粒的携带物为CXCR4小分子RNA。
[0011] 上述纳米微粒具有携带RNA量大,保护性好等优点,可提高小分子RNA的转染率。
[0012] 本发明中,所用的纳米载体可W是各代聚醜胺树形分子其中的一种(包括Gi、G2、 G3、G4、Gs、G6 等)。
[0013] 本发明中,所用的媒介为无血清培养液。
[0014] 本发明研制的载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒,其平均粒径在 25°C为 176. 5 纳米。
[0015] 本发明研制的载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒,其携带RNA 的量可通过调节CXCR4小分子RNA与聚醜胺-胺型树枝状聚合物的质量比进行调整,W 1 : 0.73的比例可达到完全包裹。
[0016] 目前,国际上携带小分子RNA的研究多偏重于W脂质体、病毒为载体,本发明研制 的纳米微球具有W下优点;1、新型纳米载体聚醜胺-胺型树枝状聚合物属于非生物材料, 对人体细胞无毒,也没有免疫原性,不会引起机体免疫反应;2、与病毒载体不同,无遗传毒 性与细胞毒性;3、由于其特殊的树枝状结构(具有极大的比表面),携带小分子RNA量大; 4、纳米载体与小分子RNA相结合后,可较好的保护小分子RNA片断不被RNA酶降解;5、新型 纳米载体可明显提高小分子RNA转染率,提高胞内浓度;6、小分子RNA技术具有特异、高效 的特点,可明显抑制生存素基因的表达;7、该载体系统可缓慢的释放药物,维持有效的药物 浓度;8、与质粒、病毒等介导的载药体系比较,具有较好的体外可操控性。
【具体实施方式】
[0017] W下通过试验进一步阐明本发明所述药物的有益效果。
[0018] 试验例1.载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒对肾癌细胞(A498) 的抑制作用
[0019] 采用Μ?Τ法观察载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒对肾癌细胞增 殖的抑制作用。本实验共分Η组:第1组CXCR4小分子RNA溶液(其浓度分别为0. 1、1. 0、 10 μ mol/L),第2组载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒溶液(其CXCR4小 分子RNA实际浓度与第1组对应相同),第3组聚醜胺树枝状聚合物溶液(其质量与第2 组对应相同),每组设3复孔,W不加药物组为空白对照。分别在加药后2地,4她,7化加 入MTT溶液继续培养4h后,去除上清液后,加入DMS0 150 μ 1/孔,震荡、溶解,于570皿波 长处测定吸光度值(Α570),并计算抑制率,抑制率=(1-实验组平均Α570/对照组平均 Α570)Χ100%。结果见表 1。
[0020] 表1不同浓度的CXCR4小分子RNA及载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物 纳米微粒对肾癌Α498细胞生长的影响
[0021]
[0022] 通过MTT实验可W表明,载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒可W 明显抑制A498细胞的增殖,且随着药物作用时间的延长,药物浓度的增加,其抑制效果越 明显。此外,在相同的药物浓度及同样的作用时间下,载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚 合物纳米微粒对A498细胞的抑制作用要超过CXCR4小分子RNA组。
[0023] 试验例2. RT-PCR检测载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒转染后 A498细胞CXCR4 mRNA的表达
[0024] 采用RT-PCR法观察载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒转染A498 细胞后对CXCR4 mRNA表达的抑制作用。将A498细胞按5 X 10^皿接种到培养皿内,在每 个培养皿内分别加入Η组药物(第一组;lOumo/L的CXCR4小分子RNA溶液,第二组;含相 同CXCR4小分子RNA浓度的载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒溶液,第Η 组:与第二组同质量的聚醜胺树枝状聚合物完全培养液),经过4化培养后,收集细胞,提取 细胞总RNA及逆转录cDNA操作,数据采用仪器自带软件(ΑΒΙ Prism 7300)进行分析,每个 样品的祀基因的相对mRNA表达水平按W下公式计算;相对mRNA表达=2 100%,Act 值=祀基因 Ct值-GAPDH Ct值。结果见表2。
[00巧]表2 Η组细胞CXCR4 mRNA表达的RT-PCR检测结果 [0026]
[0027] RT-PCR检测结果表明载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒组与 CXCR4小分子RNA组的mRNA表达分别为1. 24%和3. 06%,前者CXCR4 mRNA的表达为后者 的 40. 5%。
[0028] 本发明的目的在于W 7代佑7)的聚醜胺-胺型树枝状聚合物作为载体,将其与 CXCR4小分子RNA相结合,制备出载CXCR4小分子RNA聚醜胺树枝状聚合物纳米微粒。该纳 米微粒可较大的提高小分子RNA的携带量、转染率,增强小分子RNA的祀向特异性,且对人 体无毒,较好的提高了 CXCR4小分子RNA抗肾癌治疗效果。在疾病治疗中可用于抗肾癌治 疗,提高基因抗肾癌治疗效果。
【主权项】
1. 一种载CXCR4小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒,其组成包括聚酰胺一胺 型树枝状聚合物、CXCR4小分子RNA,其特征在于以聚酰胺一胺型树枝状聚合物为载体,使 CXCR4小分子RNA与聚酰胺一胺型树枝状聚合物的质量比为1 : 0. 73,形成聚酰胺树枝状 聚合物生存素小分子RNA交联复合物,微球粒径在25°C时平均粒径为176. 5纳米。2. 根据权利要求1所述的一种载CXCR4小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒,其 特征在于由如下步骤制备: 取IOD CXCR4小分子RNA离心,用45微升的超纯水稀释,得到溶液A ; 取15微升第7代聚酰胺一胺型树枝状聚合物溶液用30微升超纯水稀释得溶液B ; 取B溶液1微升稀释到15微升得溶液C ; 取A溶液1微升,C溶液5微升,加入15微升无血清培养基中,使CXCR4小分子RNA与 聚酰胺一胺型树枝状聚合物的质量比为1 : 0.73,在室温孵育lOmin,即得载CXCR4小分子 RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒。3. 根据权利要求1所述的一种载CXCR4小分子RNA聚酰胺树枝状聚合物纳米微粒在疾 病治疗中用于抗肾癌治疗。
【文档编号】A61K47/48GK105879055SQ201410631214
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月11日
【发明人】董勤
【申请人】董勤
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