抗凝剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗凝剂成分。特别地，抗凝剂能够有效地防止鱼血凝结。抗凝剂包括氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物以及磷酸盐缓冲液。
【专利说明】
抗凝剂
技术领域
[0001]本发明涉及一种用于防止血凝结的成分。
【背景技术】
[0002]研究暖水硬骨鱼种的免疫学的基本方法是有限的。相比于冷水鱼种对热带暖水鱼只有很少了解。(Lin等2005)。冷水鱼和暖水鱼之间的差异之一是血凝结的时间(Feeney等1972 ;Kawatsul986)，这在较暖水温的鱼中更迅速(Hussl993)。而且，暖水海洋鱼相比于暖水淡水鱼经受的血凝结更迅速。由于病菌的传播在较暖水系统中更剧烈，因此暖水鱼需要进化这种迅速血凝结机制以防止疾病通过打开的伤口感染。
[0003]因而至关重要的需要有效的抗凝剂，以防止血凝结、聚集以及最终降解。因为能够保护血细胞的形态和功能，所以血的抗凝非常重要。这对许多水产研究是至关重要的，诸如性别确定分析、血清和健康分析、疾病识别、疫苗评估、细胞谱系标记发展以及酶或者内分泌测试。
[0004]对于人血来说，多个抗凝试剂已经建立用于不同的应用，这些应用除了其他的以夕卜，包括诊断样本的保存。肝素、柠檬酸钠溶液以及乙二胺四乙酸(EDTA)在实验室设定中通常是可获得的。EDTA已经应用为螯合剂以及抗凝剂，主要是为了诊断关于医疗和手术测量顺序的血测试的目的。
[0005]存在许多报导抗凝剂的公开物。在授权的US专利US4090977中公开了一种用于保存全血的渗透平衡的抗凝剂混合物，其包括EDTA的游离酸形式的添加物，其升高红细胞比容值，具有低于红细胞比容值的对应盐量，优选EDTA的碱金属盐，以这样的比率，使得红细胞比容值在抗凝剂浓度的较宽范围内相当于鲜血或者肝素化血的红细胞比容值。
[0006]在另一授权的US专利US6277556中公开了一种用于捐赠者全血的新柠檬酸盐基抗凝剂，其提供了良好的血小板产量以及细胞形态，显著降低了血浆分离置换法程序期间捐赠者皮肤感觉异常的风险。主要柠檬酸盐抗凝剂成分包括的柠檬酸与柠檬酸盐的比率大于大约30 %。抗凝剂与全血混合以提供抗凝血混合物，其包含的柠檬酸浓度大于大约5.0mM,总柠檬酸盐浓度小于大约20mM，以及初始血pH小于大约6.75。血小板富集产品包括PRP以及从根据本发明收集的血制备的PC，呈现更好地血小板产量以及在存储上更好的血小板形态。但是，关于抗凝剂的公开物种没有一个报道了能够防止血凝结在热带鱼中。
[0007]因此，需要提供一种有效防止鱼血凝结的抗凝剂成分。
【发明内容】
[0008]根据本发明的第一方案，提供了一种抗凝剂成分，其包括氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物以及磷酸盐缓冲液。
[0009]有利地，抗凝剂能够有效地防止鱼血凝结。
[0010]有利地，抗凝剂对鱼血细胞生理学是等渗的。
【附图说明】
[0011 ]图1a示出了商用肝素血收集管和抗凝剂的抗凝血能力。
[0012]图1b示出了用包含肝素以及EDTA的磷酸盐缓冲液稀释十倍的血的抗凝血能力。
[0013]图2示出了血细胞的MGG染色法。
[0014]图3a示出了白血球的活细胞的微观视图。
[0015]图3b示出了经过LPS刺激菌落的形成。
[0016]图3c示出了经过PHA刺激菌落的形成。
【具体实施方式】
[0017]本发明涉及一种用于防止鱼血凝结的抗凝剂成分。抗凝剂成分包括氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物以及磷酸盐缓冲液。
[0018]磷酸盐缓冲液由钠磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的组合制成。磷酸盐缓冲液的量的范围为0.008mM至0.012mM。钠磷酸氢二钠的量的范围为9.0111]\1至10.51111，而磷酸二氢钾的量的范围为1.5mM至2.5mM。
[0019]氯化钾的范围为2.0mM至3.0mM。氯化钠的范围为130mM至140mM。EDTA的范围为ImM至2mM。柠檬酸三钠二水合物的范围为0.1OmM至0.12mM。
[0020]抗凝剂的pH的范围为pH7.2至pH7.5。成分的渗透压度的范围为280m0sm至320m0smo
[0021]EDTA和柠檬酸三钠二水合物功能为螯合剂。螯合剂激活钙离子，钙离子是凝结过程的关键因素，因此防止血的凝结。此外，具有前述浓度的EDTA和柠檬酸三钠二水合物在罗曼斯基染色法中将不创建制造物，并且能够最小化血细胞的聚集或者退化。
[0022]有利地，抗凝剂等渗于血细胞生理学，并且还不干涉血细胞形态和功能。
[0023]有利地，抗凝剂不影响血细胞活性。
[0024]有利地，抗凝剂增强免疫血细胞的恢复。
[0025]抗凝剂还能够用来防止人血、两栖动物血或者爬虫类动物血的凝结。
[0026]本发明还涉及用于防止血凝结的试剂盒(kit)。试剂盒包括抗凝剂和缓冲液。抗凝剂包括氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物以及磷酸盐缓冲液。
[0027]本发明还进一步涉及一种用于制备抗凝剂的方法。
[0028]方法包括:第一，溶解氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物、钠磷酸氢二钠和磷酸二氢钾于去离子水中以形成混合物。第二，调节混合物的PH至预定pH，第三，消毒混合物。可替换地，能够使用蒸馏水溶解氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物、钠磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。
[0029]通过下文的例子将更详细解释本发明。提出的例子仅图示了本发明的优选实施例，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
[°03°]制备抗凝剂
[0031 ] EDTA、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、钠磷酸氢二钠和柠檬酸三钠二水合物溶解于800mL的去离子水中。利用HCl调节pH至7.4，然后添加去离子水以获得IL的总体积。在液体周期中通过高压灭菌法以103421帕斯卡(1.05kg/cm2)消毒抗凝剂20min。
[0032]收集鱼血
[0033]具有的体重范围为750_1100g的八只褐点石斑鱼(棕点石斑鱼)和两只鞍带石斑鱼杂交种获取于马来西亚Ketam岛附近。用50mg/L的甲烷磺酸三卡因(MS222 ,Aldrich，USA)麻痹鱼。用70 %酒精消毒鱼的身体表面。擦掉多余粘液。在收集鱼血之前用清水冲洗液冲洗蝶翼输液器。针首先注入鱼的尾静脉。通过轻轻拉动注射器的活塞抽吸血以创建压力。抽吸的血的每个部分应该立即用5倍的抗凝剂溶液稀释。在时间间隔内轻轻搅动稀释的血直到离心分呙。
[0034]正如从图1a中看到的，在本研究(管2)中，在被开发的抗凝剂稀释的石斑鱼血中未观察到血的凝结，而石斑鱼血凝结在商用肝素血收集管(管I)中。正如在图1b中看到的，利用十倍稀释的肝素缓冲液(管3)或者EDTA缓冲液(管4)继续凝结的石斑鱼血。
[0035]经由May-GriinwaId Giemsa(MGG)形态学评价染色法以及活性测试
[0036]制作血涂片并且用甲醇固定，接着在May-Griinwald溶液中保温5min并且在10%Giemsa溶液中保温1min。在正置显微镜(BX51 ,Olympus)下滑动检查。使用彩色电親合照相机(U-CMAD-2;01ympus)从每次滑动中从随机区域中选取至少20个图像。执行台盼蓝排斥试验以确定细胞总数和细胞活性。
[0037]如图2所示，利用MGG染色法能够识别包括红血球、淋巴细胞、血小板、单核白血球以及嗜中性白血球的石斑鱼外周血细胞中的各种细胞类型。未观察到细胞形态的制造物或者异常。红血球是具有稍微染色或者不染色细胞质的椭圆形。在石斑鱼外周血中小以及大淋巴细胞在大量白血球中被发现，其特征在于大尺寸原子核以及较少细胞质。利用其大原子核以及嗜碱性细胞质单核白血球能够区别于其他白血球。细胞质与单核白血球的原子核的比率相对于淋巴细胞较大。基于其芯轴形状和冷凝原子核能够识别血小板。嗜中性白血球是另一大白血球，其特征在于其在外围的偏心原子核。在抗凝血中细胞活性大于98%。
[0038]主要细胞培养
[0039]在Imin的红血球的等渗裂解之后，获得白血球。在包含Leibovitz-15培养基(Sigma,USA)、5(^1^-2-11161^&。1:061:11&1101(3丨81]1&，1]34)和10%胎牛血清的细胞培养基中培养白血球(56°C加热去活30min;Paa，Austria)。50万白血球被添加至每96个微孔板中，在90PL培养介质和1yL有丝分裂溶液中。在加湿室中以室温保温培养48h。有丝分裂溶液包含SOOygml—1的大肠杆菌，055:B5脂多糖(LPS;Sigma，USA)或者lOygml—1的植物凝血素(PHA-M;Sigma，USA)。使用完整的培养基而不是使用有丝分裂溶液作为控制。通过台盼蓝排斥试验确定活性细胞的数量。使用倒置相差显微镜(CK40 ,Olympus)观察增殖细胞菌落。
[0040]正如在图3a中看到的，来自单个抗凝血中的白血球成功维持在体外培养中。正如分别在图3b和图3c中看到的，经过LPS或者PHA刺激，白血球增殖并且观察到细胞菌落。
[0041]如上所述，很显然，可以以许多方式改变本发明。这种变化将视为在本发明的范围内，并且所有这种修改对本领域技术人员来说是显而易见的，并且在以下权利要求的范围内。
【主权项】
1.一种抗凝剂成分，包括氯化钾、氯化钠、EDTA、柠檬酸三钠二水合物以及磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述磷酸盐缓冲液钠是磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。3.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述氯化钾的量的范围为2.0mM至3.0mM。4.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述氯化钠的量的范围为130mM至140mM。5.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述EDTA的量的范围为ImM至2mM。6.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述柠檬酸三钠二水合物的量的范围为0.10mMS0.12mMo7.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述磷酸盐缓冲液的量的范围为0.0OSmM至0.012mM。8.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述成分的pH的范围为pH7.2至pH7.5。9.根据权利要求1所述的抗凝剂成分，其中，所述成分的渗透压度的范围为280m0sm至320m0smo
【文档编号】G01N33/48GK105899203SQ201480072604
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】马哈·阿卜杜拉, 宗·朱·明, 玛丽安娜·诺·沙姆斯丁, 法蒂玛赫·迈德·尤索夫, 莱斯莉·坦·蒂安格·伦格
【申请人】马来西亚博特拉大学