使用cbp/连环蛋白的抑制剂治疗肝纤维化的制作方法

使用cbp/连环蛋白的抑制剂治疗肝纤维化的制作方法
【专利摘要】本公开一般地涉及α?螺旋模拟结构并具体地涉及作为β?连环蛋白的抑制剂的α?螺旋模拟结构。本公开还涉及肝纤维化，包括与肝炎相关的肝纤维化、与乙型肝炎感染相关的肝纤维化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗中的应用，以及包含这样的α螺旋模拟β?连环蛋白抑制剂的药物组合物。
【专利说明】使用CBP/连环蛋白的抑制剂治疗肝纤维化
[0001] 相关申请的交叉参考 本申请是2013年10月18日提交的美国临时申请号61/892,606的实用会话(utility conversation)。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒化BV)引起的肝脏的感染性炎症疾病。该感染通 常是无症状的，但是慢性感染可W导致肝脏的癒痕形成并最终导致肝硬化，而运通常在多 年W后才变得明显。在一些病例中，患有肝硬化的人将会继续发展成肝衰竭、肝癌或威胁生 命的食管和胃的血管曲张。
[0003] 肝纤维化的发展是慢性乙型肝炎病毒感染的自然史中的一个关键性的事件。纤维 化是运一疾病的发病率和死亡率的主要原因，并且导致慢性感染的个体的一定百分比的肝 代偿失调、肝细胞癌和死亡的发展。
[0004] 非酒精性的脂肪性肝炎或NA細是一种常见的、通常是"沉默的"肝病。它类似于酒 精性的肝病，但是却发生在几乎不或者不饮用酒精的人中。NASH的主要特征是肝脏中的脂 肪，W及炎症和损伤。患有NASH的大部分人感觉良好，并且没有意识到他们有肝脏问题。然 而，NASH可W是严重的并且可W导致肝硬化，其中肝脏被永久性地损伤和形成癒痕并且不 再能够适当地工作。NASH可W缓慢地恶化，导致癒痕形成或"纤维化在肝脏中出现和累 积。随着纤维化加重，肝硬化也在发展；肝脏变得形成癒痕、硬化，并且不能正常工作。
[0005] 肝纤维化通过肝脏中的纤维组织的累积而表征和定义。纤维癒痕组织的形成是针 对损伤的正常身体应答，但是在纤维化中，运一愈合过程却是错误的。当肝细胞（功能性的 肝细胞）由于被病毒感染、大量酒精消耗、毒素、创伤或其它因素而损伤时，免疫系统被激活 W修复损伤。肝细胞的损伤或死亡(坏死)刺激炎性免疫细胞释放细胞因子、生长因子和其 它化学物质。运些化学信使引导肝脏中的支持细胞(称为肝脏星状细胞)活化并产生胶原、 糖蛋白（诸如纤连蛋白）、蛋白聚糖类和其它物质。运些物质在肝脏中储存，导致细胞外基质 (非功能性结蹄组织）的聚集。与此同时，分解或降解胶原的过程受损。在健康的肝脏中，基 质组织的合成(纤维发生)和分解(纤维溶解)是平衡的。当过度的癒痕组织聚集的速度快于 其可W被分解和从肝脏中移除的速度时，发生纤维化。
[0006] Wnt/β-连环蛋白信号传递新近作为先驱而呈现，运归因于其在人生物学的许多方 面中的关键性的角色。运一信号传递途径在胚胎发生、器官发生和维持组织和器官内环境 稳态中，W及在病理学状况诸如癌症和其它人病症诸如炎性病症和纤维化中具有作用。在 肝脏中，其牵设若干生理学事件，诸如发育、再生和生长。然而，该途径的异常活化也在肝脏 的多种不同的肿瘤中显现，并且最近的研究开始鉴别出其在其它肝脏病理学状况中的作 用。它通过调节各种基础的细胞事件，包括分化、增殖、存活、氧化应激、形态发生等对肝脏 生理学和病理学做出贡献。
[0007] Wnt/β-连环蛋白信号传递的作用在星状细胞中也变得越发明显。尽管β-连环蛋白 在星状细胞的细胞-细胞接触中的表达是未知的，但最近已经在肝再生的过程中报道有细 胞核和细胞质的β-连环蛋白。星状细胞活化在多种病况中牵设于肝纤维化中，包括酒精性 脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎，并且是代谢性肝病的结果。诸多研究现在 开始观察Wnt/β-连环蛋白信号传递在星状细胞活化中的作用。最近，休眠的和活化的大鼠 肝星状细胞的DNA微列分析显示在非经典的Wnt途径中设及的基因的上调，但不存在β-连 环蛋白活化。尽管运需要进一步表征，但是检查所有Wnt和frizzled基因的存在与否的另一 个研究显示其在活化或休眠的星状和枯否细胞中的总体表达没有差异。然而，该研究鉴别 了Fzb (sFRPl)仅在活化的细胞中存在，运暗示了Wnt信号传递在星状或枯否细胞活化中的 调节（Thompson, M.和Monga, S., Hepatology 45: 1298-1305, 2007)。
[0008] 肝星状细胞化sc)的活化(肝纤维化中的一个关键性的事件)是由弱化的成脂转 录所的导致的。最近的研究观察了是否Wnt信号传递促进了"抗成脂的巧SC的活化和肝纤 维发生（化eng J.等人，Am. J. F*hysiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294:G39- G49, 2008)。在运些研究中，通过定量PCR检查了培养活化的来自正常大鼠的HSC和胆汁渺 积的大鼠肝的HSC的Wnt, Frizzled (Fz)受体和共同受体的表达。Wnt信号传递通过细胞 核β-连环蛋白和T细胞因子(TCF)启动子活性评估。通过腺病毒载体转导Dickkopf-1 (D化- 1)(一种Wnt共同受体括抗剂）W评价Wnt括抗对小鼠中的HSC的培养活化和胆汁渺积性肝纤 维化的作用。与休眠的HSC相比，在培养活化的HSC中，经典的（Wnt：3a和10b)和非经典的 (Wnt4和5a) Wnt基因、Fz-1和2和共同受体[低密度脂蛋白受体相关蛋白化RP)6和Ryk]的 信使RNA增加了大约3-12倍。细胞核β-连环蛋白水平和TCF DNA结合在活化的HSC中显著增 加。
[0009] TCF启动子活性受Wntl刺激但却受化化by(-种阻断β-连环蛋白与TCF相互作用 的蛋白）抑制和受Dkk-1抑制。D化-1增强过氧化物酶体增殖子活化的受体-丫（PPAR- 丫）-驱 动的PPAR应答元件(PPRE)启动子活性(一种关键的成脂转录参数）、消除激动剂刺激的收 缩，并恢复培养中的HSC静默。D化-1的高表达增加了培养的HSC的调亡。Wnt和Fz基因的表 达也在从实验性的胆汁渺积性肝纤维化分离的HSC中被诱导，并且Dkk-1表达改善小鼠中 的运一形式的肝纤维化。由此，已经鉴别出了HSC活化中的抗成脂的Wnt信号传递，W及Wnt 括抗对肝纤维化的治疗潜力（化eng J.等人，Am. J.曲ysiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294:G39-G49, 2008)〇

【发明内容】

[0010] 本公开提供了通过施用β-连环蛋白信号传递的抑制剂治疗肝纤维化，包括与肝炎 相关的肝纤维化、与乙型肝炎感染相关的肝纤维化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。 本公开还提供了 α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂化合物，和包含β-连环蛋白的抑制剂的组合 物。
[0011] 在一个实施方案中，本发明的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂化合物包括4-(((6S， 9S，9aS)-1-(苄基氨基甲酯基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基)八氨-1H-化 嗦并[2，1-C ] [ 1，2，4]Ξ嗦-6-基）甲基)苯基二氨憐酸醋或(6S，9S，9aS)-N-苄基-6-(4-?基 苄基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基）八氨-1H-化嗦并[2，l-c][l，2,4]S 嗦-1-甲酯胺。
[0012] 附图简述 附图1.用化合物A治疗减少ΝΑ甜大鼠模型中的纤维化。
[0013] 附图2.天狼星红染色的肝切片的代表性显微照片。
[0014] 公开内容详述 已经开发了非肤化合物，其模拟在生物活性的蛋白或肤中发现的反向转角的二级结 构。例如，美国专利号5,440,013和公开的？(：1'申请号胖094/03494、胖001/002104巧抓001/ 16135Α2各自公开了构象限制性的、非肤的化合物，其模拟反向转角的Ξ维结构。此外，美 国专利号5,929,237及其部分继续美国专利号6,013,458公开了构象限制性的化合物，其模 拟生物活性的肤和蛋白的反向转角区域的二级结构。对于反向转角模拟物，W02007/056513 和W02007/056593中已经公开了构象限制性的化合物，其模拟生物活性的肤和蛋白的α-螺 旋区域的二级结构。
[0015] 本公开提供了新颖的化合物、药物组合物和治疗肝纤维化的方法。发明人已经确 定，抑制β-连环蛋白信号传递是治疗纤维化性肝病的一个有效的途径。
[0016] 本发明的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂的结构和化合物公开于W0 2010/044485、 W0 2010/128685、W0 2009/148192和US 2011/0092459,其中任一篇通过引用W其整体并入 本文中。现在已经发现运些化合物可用于治疗肾纤维化。
[0017]本发明的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂的优选结构具有下式(I):
其中 Λ 是-CHR7-, 其中 R7是任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基、任选取代的环烷基烷基或任选取 代的杂环烷基烷基； G 是-NH-、-NR6-或-0- 其中 R6是低级烷基或低级締基； r1 是-fci-RiD; 其中 Ra是任选取代的低级亚烷基和 RW是任选取代的二环稠合芳基或任选取代的二环稠合杂芳基； 尺2是-(〇))-畑-肺-尺2*\ 其中 肺是键或任选取代的低级亚烷基；和 rw是任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和 R3是Cl-4烷基。
[0018] 运些化合物尤其可用于预防和/或治疗肝纤维化。
[0019] 本发明的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂的更优选的结构在上述式（I)中具有下述 取代基： Λ 是-CHR7-， 其中 R7是任选被径基或Cl-4烷基取代的芳基烷基； G 是-NH-、-NR6-或-0- 其中 R6是Cl-4烷基或Cl-4締基； r1 是-fci-RiD; 其中 Ra是Cl-4亚烷基和 rw是任选被面素或氨基取代的二环稠合芳基或二环稠合杂芳基； 尺2是-(〇))-畑-肺-尺2*\ 其中 肺是键或Cl-4亚烷基；和 rw是芳基或杂芳基；和 R3是Cl-4烷基。
[0020] 运些化合物尤其可用于预防和/或治疗肝纤维化。
[0021] 本发明的最优选的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂如下： (6S，9S)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-2,9-二甲基-8-(糞-1-基甲基)-4,7-二氧代八氨- 1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-2-締丙基-N-苄基-6-(4-?基苄基)-9-甲基-8-(糞-1-基甲基)-4,7-二氧代 八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-9-甲基-8-(糞-1-基甲基)-4,7-二氧代六氨化嗦并 [2，1-。][1，2,4]嗯二嗦-1(6^-甲酯胺， (6S，9S)-8-((2-氨基苯并[d]嚷挫-4-基）甲基)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-2,9-二甲 基-4，7-二氧代八氨-1H-化嗦并[2，1-C] [ 1，2，4]Ξ嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-?基苄基）-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基）八 氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-2-締丙基-N-苄基-6-(4-?基苄基)-9-甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲 基)八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酯基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基)八 氨-1H-化嗦并[2，1-(3][1，2,4]^嗦-6-基）甲基)苯基二氨憐酸醋， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酯基)-2,9-二甲基-8-(糞-1-基甲基)-4,7-二氧代八氨- 1H-化嗦并[2，1-C ] [ 1，2，4 ] Ξ嗦-6-基）甲基)苯基二氨憐酸醋， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酯基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基)八 氨-IH-化嗦并[2，1 -c ] [ 1，2，4 ] Ξ嗦-6-基）甲基)苯基憐酸钢， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酯基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(糞-8-基甲基)八氨- 1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-6-基）甲基)苯基憐酸钢， (6S，9S)-2-締丙基-6-(4-?基苄基)-9-甲基-4,7-二氧代-N-((R)-1-苯基乙基)-8- (哇嘟-8-基甲基)八氨-lH-化嗦并[2，l-c][l，2,4]Ξ嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-2-締丙基-6-(4-?基苄基)-9-甲基-4,7-二氧代-N-((S)-1-苯基乙基)-8- (哇嘟-8-基甲基)八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-? 基-2,6-二甲基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8- 基甲基)八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-8-(苯并[b]嚷吩-3-基甲基)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二 氧代八氨-1H-化嗦并[2，1-C] [ 1，2，4]Ξ嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-8-(苯并k][l，2,5]嚷二挫-4-基甲基)-Ν-苄基-6-(4-? 基苄基)-2,9-二甲 基-4，7-二氧代八氨-1H-化嗦并[2，1-C] [ 1，2，4]Ξ嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-8-(异哇嘟-5-基甲基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代八 氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺， (6S,9S)-N-苄基-8-( (5-氯嚷吩并[3,2-b]R比晚-3-基）甲基)-6-(4-? 基苄基)-2,9-二 甲基-4，7-二氧代八氨-1H-化嗦并[2，1-C] [ 1，2，4]Ξ嗦-1-甲酯胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嗯嘟-5-基甲基)八 氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺，和 (6S，9S)-6-(4-^基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基)-N-(嚷吩-2- 基甲基)八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺。
[0022] 运些化合物尤其可用于预防和/或治疗肝纤维化。
[0023] 在一个最优选的实施方案中，所述化合物是： 4-(((6S，9S，9aS)-1-(苄基氨基甲酯基）-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲 基)八氨-1护化嗦并[2，1-(：][1，2,4]^嗦-6-基）甲基)苯基二氨憐酸醋（化合物4)，或 (6S，9S，9aS)-N-苄基-6-(4-?基苄基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基） 八氨-1H-化嗦并[2，1-。][1，2,4]^嗦-1-甲酯胺。
[0024] 运些化合物尤其可用于预防和/或治疗肝纤维化。
[0025] 尽管不希望受到限制，运些化合物在治疗运些病况中的有效性部分地基于运些化 合物通过抑制环状AMP应答-元件结合蛋白（CBP)阻断TCF4/i3-连环蛋白转录途径，由此改 变wnt途径信号传递(已经发现运会改善结果)的能力。
[0026] "β-连环蛋白抑制剂"是运样的物质：其可W减少或防止0-连环蛋白活性。0-连环 蛋白活性包括向细胞核迁移、与TCF (Τ细胞因子)转录因子结合，W及共活化TCF转录因子 诱导的TCF祀基因的转录。巧-连环蛋白抑制剂"还可W干扰CBP和β-连环蛋白的相互作用。 因此，β-连环蛋白抑制剂抑制或减少CBP/β-连环蛋白信号传递和CBP/β-连环蛋白信号传递 途径的活性，包括减少一个或多个下游信号传递事件。
[0027] 本文公开的是用于治疗肝纤维化的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂化合物。
[0028] 如本文中所用，"肝纤维化"被限定为肝内的结蹄或癒痕组织的过度累积。肝纤维 化中的结蹄/癒痕组织的累积相比于正常健康肝脏中的结蹄组织水平是过度的。该纤维化 经常伴随肝组织的坏死和/或炎症。特别地，在正常肝中的储存维生素 A的肝星状细胞 化SCs)通过急性和慢性肝损伤被转化成肌纤维母细胞，通过细胞外基质诸如胶原、蛋白聚 糖或透明质酸的合成和迁移的增加快速地增殖和合成过量的结蹄组织，运导致刺激肝纤维 化的进展[Frie血an 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 8681 (1985) Gressner 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 222 (1988) Gressner 等人，J. Hepatol.，22: 28 (1995)LCBP/连环蛋白信号传递可W诱导肝星状细胞的增殖和发育， 从而在诱导细胞外基质诸如胶原的过度生产和过度累积中发挥作用。
[0029] 术语"肝炎"是指肝的炎症。该炎症通常与免疫细胞向肝组织中的浸润有关。肝炎 可W是急性的，持续小于六个月，或者是慢性的，持续长于六个月。如果没有逆转的话，肝炎 将会进展成纤维化，形成过量的结蹄/癒痕组织并可W进一步进展成肝硬化，其中癒痕组织 的发展代替了正常的实质，阻断了通过器官的口静脉血流并扰乱正常的肝功能。
[0030] 在急性肝炎的肝样本的组织学检查中，损伤(异常组织区域)主要含有弥散的窦状 的和口静脉的单核浸润物(淋己细胞、浆细胞、枯否细胞)和肿胀的肝细胞。嗜酸性的细胞是 常见的。通常会存在肝细胞再生和胆汁渺积（小管胆汁堵塞）。也可能会出现桥连的肝坏死 (连接两个或更多个口静脉区段的坏死区域）。可W有一些小叶状的杂乱排列。尽管可W发 生淋己细胞在口静脉区域的聚集，但运些情况通常即不是常见的也不是主要的。急性肝炎 与肝纤维化的关联性不强，但也可W通过本发明的方法来治疗。
[0031] 在慢性肝炎中，肝的炎症根据W下因素来评估:致病媒介（如果已知的话)和基于 炎症程度的等级、片状或桥连的坏死(界面肝炎）和纤维化的阶段。组织学检查可W掲示与 急性肝炎等同的或更严重的浸润的损伤、增加的小叶状的杂乱排列、增加的淋己细胞在口 静脉区域的聚集和增加的纤维化和/或肝硬化。
[0032] 术语"乙型肝炎"是指乙型肝炎病毒（一种单链RNA病毒，其具有含有脂质的包 膜，并且被认为是黄病毒科的成员）的感染。该术语涵盖了所有形式的乙型肝炎，包括急性 乙型肝炎和所有形式的慢性乙型肝炎（例如，慢性活动性乙型肝炎和慢性持续性乙型肝 炎)。
[0033] 脂肪性肝炎（也称之为脂肪肝疾病）是一种类型的肝病，其特征在于肝的炎症， 同时伴有肝中的脂肪累积。脂肪在肝中的沉积被称为脂肪变态，并且所有运些构成了脂肪 肝变化。当与过度酒精摄取无关时，其被称作非酒精性脂肪性肝炎或NASH,并且是非酒精性 脂肪肝病的进展形式。脂肪性肝炎可W进展成肝硬化，并且现在认为NASH是未得到解释的 肝硬化的常见原因（至少在西方社会中）。在NASH中，脂肪在肝中累积并最终导致癒痕组织。 运一类型的肝炎似乎与糖尿病、蛋白营养不足、肥胖、冠状动脉疾病和用皮质类固醇药物治 疗有关。本文公开的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂化合物可W治疗脂肪性肝炎。
[0034] ΝΑ細可W在评分系统上评级，所述评分系统组合了若干组织学特征：坏死、多形 核白细胞浸润、马洛里小体和澄清。该评分系统也可用于在一般意义上诊断肝炎。采用四级 别评分系统，每一特征从0-2进行评分，总分从0-8(Mathu;rin Ρ,等人Gastroenterology 110:1847-53 (1996); Bedossa P,等人 Alcohol Clin. Exp. Res. 12:173-8 (1988)): ΝΑ甜可W在从化unt评分改编的4级别评分系统上进行评级(Angulo P. N.化gl. J. Med. 346(16):1221-31, 2002): 0级：评分=0，无 ΝΑ細；1级：评分=1-2，轻度/轻度脂肪变 态：主要是大泡性，包含至多66%的小叶，气球样变：偶然观察到；3区肝细胞，小叶炎 症：分散的和轻度的急性炎症（多形核白细胞细胞)和偶然的慢性炎症（单核细胞），口静 脉炎症：无或轻度；2级：评分=3-4,中度的：脂肪变态：任何程度；通常混合的大泡性 和微泡性，气球样变：明显的并且存在于3区中，小叶炎症：可W注意到与气球样变的肝 细胞、细胞外周纤维化联合出现的多形核白细胞细胞；可见轻度的慢性炎症，Π 静脉炎症： 轻度的至中度的；3级：评分=5-8,严重的脂肪变态：通常包含>66%的小叶（全小叶性）； 通常混合的脂肪变态，气球样变：主要在3区；显著的小叶炎症：分散的急性和慢性炎 症；多形核白细胞细胞可W集中于3区气球样变区域和窦周纤维化；口静脉炎症：轻度的 至中度的。
[0035] 如本文中所用，"治疗"是指尝试改变被治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干 预，并且可W在临床病理学过程中进行。治疗的治疗性作用包括但不限于限制、预防疾病复 发、缓和症状，消除疾病的任何直接或间接的病理学后果，降低疾病进展的速率，缓和或减 轻疾病状态，W及豁免或改善的预后。
[0036] 如本文中所用，术语"治疗有效量"和"有效量"可互换地使用W指本发明的组合物 的量:其足W导致肝纤维化或其一种或多种症状的发展或发病的预防，增强或改善另一种 治疗的效果，和/或缓和肝纤维化的一种或多种症状。对于遭受肝纤维化的对象，优选的治 疗有效量是有效减少纤维化和/或改善肝功能的量。
[0037] 可W在一个或多个剂量中将治疗有效量施用给患者，所述剂量足W减轻、缓和、稳 定、逆转或减缓疾病的进展，或者W其它方式减轻疾病的病理学后果，或者减轻疾病的症 状。所述缓和或减轻不需要是持久的，但却可W是在一定时间范围（至少一个小时，至少一 天，或者至少一周或更长）内。有效量通常由医生按照个案情况确定，并且属于本领域的技 术人员的技能范围内。当确定实现有效量的适当剂量时，通常会考虑若干因素。运些因素包 括患者的年龄、性别和体重、被治疗的病况、所述病况的严重程度、W及施用途径、剂型和方 案W及所期望的结果。
[0038] 如本文中所用，术语"对象"和"患者"可互换地使用并且是指动物，优选哺乳动物 诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长类动物(例如猴和人），并且最优 选是人。
[0039] 本文所述的α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂可用于预防或治疗疾病。具体而言，本公 开提供了预防性和治疗性的治疗有(或易感)肝纤维化风险的对象的方法。因此，本方法为 预防和/或治疗对象中的肝纤维化而提供，所述方法通过向有此需要的对象施用有效量的α 螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂。例如，在致力于改善一种或多种肝纤维化病况的因素的努力 中，对象可W被施用α螺旋模拟β-连环蛋白抑制剂。
[0040] 本发明还涵盖运样的方法，其中在组合疗法中给予所述化合物。即，所述化合物可 W与可用于治疗肝炎和皿V感染的其它药剂联合(但分开)使用。在运些组合疗法中，所述化 合物将通常W1-100 mg/kg体重/日的每日剂量与其它药剂联合给予。其它药剂将通常W临 床上使用的量给予。然而，具体的给药方案由医生使用合理的医学判断来确定。
[0041] 适合于设及与本文公开的抑制性化合物的组合疗法的组合物和方法的化合物的 一些实例包括但不限于下述：ICG-001 ; Ω IFN IFN-. ω . Intarcia Therapeutics ; BILN-2061 丝氨酸蛋白酶抑制剂 Boehringer Inge化eim Pharma KG, Ingelheim, Germany; Summetrel antiviral Endo Pharmaceuticals Holdings Inc., Chadds Ford, PA;罗扰素 A IFN-.α,2a F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel，Switzerland;派罗欣聚 乙二醇化IFN-.α.2a F. Hoffmann-La Roche LTD, Basel, Switzerland;派罗欣和SP坐 核骨聚乙二醇化IFN- F. Hoffmann-La Roche .a.2a/ribavirin LTD，Basel， Switzerland;聽悉HCV IgG F. Hoffmann-La 民oche immunosuppressant LTD, Basel, Switzerland;惠福仁成淋己细胞样IFN- GlaxoSmitliKline pic, ·α·η1 Uxbridge, UK; Albuferon - .a.白蛋白 IFN-.a.2b Human Genome Sciences Inc.，Rockville, MD; Levovirin利己韦林ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA; IDN-6556 半脫天冬酶抑制 剂 Idun Pharmaceuticals Inc·，San Diego, CA; IP-501 抗纤维化剂Indevus Pharmaceuticals Inc.， Lexington, MA; Actimmune INF-, γ . InterMune Inc.， Brisbane, CA;干复津A IFN a-1 InterMune Pharmaceuticals Inc.，Brisbane, CA; ISIS 14803反义ISIS Pharmaceuticals Inc, Carlsbad, CA/Elan Phamaceuticals Inc.，New York, NY; JTK-003 R 服p 抑制剂 Japan Tobacco Inc·，Tokyo, Japan;派罗 斤义和Ceplene 聚乙二酉享化IFN-.a.2a/ Maxim Pharmaceuticals immune modulator Inc.， San Diego, CA; Ceplene免疫调节齐l」Maxim Pharmaceuticals Inc.， San Diego, CA; Civacir HCV IgG Nabi免疫抑制剂BioPharmaceuticals Inc·，Boca Raton, FL 内含子 A和曰达仙IFN-.α.2b/.α.l-民egΘnΘ民x thymosin Biopharmiceuticals Inc.， Bethesda， MD/ SciClone Pharmaceuticals Inc, San Mateo, CA; Levovirin IMPDH抑制剂 民ibapharm Inc.， Costa Mesa, CA; Viramidine 民ibavirin Prodrug 民ibapharm Inc.， Costa Mesa, CA; Heptazyme核酶Ribozyme Pharmaceuticals Inc·，Boulder, CO;内含 子A IFN-.a.2b Schering-Plou組 Coi^poration, Kenilwoi'th, NJ; PEG-内含子聚乙二醇 化IFN-.a.2b Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ;民ebetron IFN-.a.2b/ 利己韦林Schering-Plough Coloration，Kenilworth，NJ;利己韦林利己韦林Schering- Plough Coi^poration, Kenilworth, NJ; PEG-内含子/利己韦林聚乙二醇化IFN- Schering-Plough .α. 2b/ribavirin Corporation, Kenilworth, NJ; Zadazim免疫调节 剂SciClone Pharmaceuticals Inc.，San Mateo, CA;利比IFN-.β.la Serono, Geneva, Switzerland; IFN-.β.和EMZ701 IFN-.β.和EMZ701 Transition Therapeutics Inc·， Ontario, Canada;己他布林（T67) ·β·-微管蛋白抑制剂 Tularik Inc·，South San Francisco，CA;美泊地布IMPDH抑制剂 Vertex Pharmaceuticals (VX-497) Inc·， Cambridge, MA;替控瑞韦NS3 丝氨酸蛋白酶 Vertex Pharmaceuticals (VX-950, LY- 570310) inhibitor Inc.， Cambridge， MA/ Eli Lilly and Co. Inc.， Indianapolis， IN; Omniferon天然IFN-.a. Viragen Inc·，Plantation, FL Χ?1-6865 (Χ?1-002)单 克隆抗体XTL BioPharmaceuticals Ltd.，Rehovot，Israel。
[0042] 肝纤维化的治疗是指施用本文所述的化合物或组合^治疗患有肝纤维化的对象。 肝纤维化的治疗的一种结果是减少结蹄组织的形成。肝纤维化的治疗的另一种结果是减少 炎症和免疫细胞的浸润。肝纤维化的治疗的仍另一种结果是减少肝组织坏死。肝纤维化的 治疗的仍另一种结果是改善肝功能。
[0043] 本文所述的α螺旋模拟目-连环蛋白抑制剂可W被惨入至药物组合物中^用于单独 地或组合地施用给对象来治疗或预防本文所述的病症。这样的组合物通常包括活性剂和药 学上可接受的载体。本文所使用的术语"药学上可接受的载体"包括与药物施用相容的盐 水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。补充性的活性化 合物也可W渗入至所述组合物中。
[0044] 可W采用任何适合的施用途径W给哺乳动物，尤其是人提供有效剂量的本文所述 的化合物。例如，可W采用口服、直肠、局部、胃肠外、眼、肺、鼻等途径。剂型包括片剂、糖锭、 分散体、混悬剂、溶液、胶囊、乳膏、软膏、气雾剂等。
[0045] 所采用的活性成分的有效剂量可W根据所采用的特定化合物、施用途径、被治疗 的病况和被治疗的病况的严重程度而变化。运样的剂量可W经由本领域技术人员容易地确 定。
[0046] 当治疗或控制肝纤维化和/或本文所述的化合物所适应的其它疾病时，令人满意 的结果通常在当本文所述的化合物W约0.01毫克至约100毫克/千克的动物体重的每日剂 量施用时获得，所述剂量优选W单次每日剂量或W每日2-6次的分份剂量或W缓释形式给 予。对于大多数大型哺乳动物而言，总的每日剂量为约1.0毫克至约1000毫克。在70 kg成人 的情况下，总的每日剂量将通常为约1毫克至约500毫克。对于特别有效的化合物而言，成人 的剂量可W低至0.1 mg。在一些情况下，每日剂量可W高达1 gram。剂量方案可W在该范围 内调节或者甚至在该范围W外，从而提供最佳的治疗应答。
[0047] 口服施用将通常使用片剂或胶囊剂进行。片剂和胶囊剂中的剂量的例子为0.1 mg、0.25 mg、0.5 mg、l mg、2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、40 mg、50 mg、 100 mg、200 mg、250 mg、300 mg、400 mg、500 mg和750 mg。其它口服形式也具有相同或类 似的剂量。
[0048] 本文还描述了药物组合物，其包含本文所述的化合物和药学上可接受的载体。本 文所述的药物组合物包含本文所述的化合物或药学上可接受的盐作为活性成分，W及药学 上可接受的载体和任选的其它治疗性成分。如果施用前药的话，药物组合物还可W包含前 药或其药学上可接受的盐。
[0049] 所述组合物可W适合用于口服、直肠、局部、胃肠外(包括皮下、肌内和静脉内）、眼 (眼部）、肺(鼻或口腔吸入)或鼻施用，尽管在任何给定的情况下最适合的途径将取决于被 治疗的病况的性质和严重程度和取决于活性成分的性质。它们可W方便地W单位剂型的形 式呈现并且可W通过药学领域公知任何一种方法来制备。
[0050] 在实际用途中，根据常规的药物混合技术，可W将本文所述的化合物作为活性成 分与药物载体W紧密混合的方式组合。载体可W采用各种形式，运取决于期望用于施用的 制剂的形式，例如口服或胃肠外(包括静脉内）。在制备作为口服剂型的组合物中，可W采用 任何常用的药物介质，诸如，例如，水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂、着色剂等(在口服液体 制剂诸如，例如，混悬剂、馳剂和溶液剂的情况下）;或载体，诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释 剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等(在口服固体制剂诸如，例如，粉末、硬和软胶囊和片 剂的情况下），其中固体口服制剂相对于液体制剂而言是优选的。
[0051] 由于其施用的容易性，片剂和胶囊剂代表最有利的口服剂量单位形式，在此情况 下采用固体药物载体。如果需要的话，可W通过标准的水性或非水性技术将片剂包衣。运样 的组合物和制剂应当含有至少0.1%的活性化合物。活性化合物在运些组合物中的百分比当 然可W变化，并且可W方便地在所述单位的重量的约2%至约60%之间。活性化合物在运样 的治疗上有用的组合物中的量为获得有效剂量的量。活性化合物也可W作为例如液体滴剂 或喷雾剂鼻内施用。
[0052] 片剂、丸剂、胶囊剂等也可W含有粘合剂，诸如西黄著胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明 胶；赋形剂诸如憐酸二巧；崩解剂诸如玉米淀粉、马铃馨淀粉、海藻酸；润滑剂诸如硬脂 酸儀；和甜味剂诸如薦糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质 W外，它可W含有液体载体诸如脂肪油。
[0053] 各种其它物质可W作为包衣或者为了改变剂量单位的物理形式而存在。例如，片 剂可W用虫胶、糖或两者进行包衣。除了活性成分W外，糖浆或馳剂可W含有薦糖作为甜味 剂，尼泊金甲醋和丙醋作为防腐剂，染料和矫味剂诸如樓桃或相橘香料。
[0054] 本文所述的化合物也可W胃肠外施用。运些活性化合物的溶液或混悬剂可W配制 在水中，所述水适当地与表面活性剂或表面活性剂的混合物(诸如径丙基纤维素、聚山梨醋 80W及中链和长链脂肪酸的单和二甘油醋)混合。分散体也可W制备在甘油、液体聚乙二醇 及其在油中的混合物中。在通常的胆存和使用条件下，运些制剂含有防腐剂W防止微生物 的生长。
[0055] 适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末，后者用于用前 临时制备无菌注射溶液或分散体。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是处于容易 注射程度的流体。在制造和胆存的条件下，它必须是稳定的，并且必须被防腐W避免微生物 诸如细菌和真菌的污染作用。载体可W是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例 如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇）、其合适的混合物和植物油。 实施例
[0化6] 实施例1.材料和方法 缩写： ALT:丙氨酸氨基转移酶 a-SM:a-平滑肌肌动蛋白 BCA:二哇嘟甲酸 cDNA:互补 DNA 肥:苏木精和曙红 HFD:高脂肪饮食 Hyp:径基脯氨酸 MMLV-RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 NAFLD:非酒精性脂肪肝病 NAS:NA化D活性评分 NASH:非酒精性脂肪性肝炎 NTP:核巧Ξ憐酸 化IpO:核糖体蛋白，大，P0 RT-PCR:逆转录聚合酶链反应 QD:每日一次 SD:标准差 SPF:无特定病原体 TG:甘油Ξ醋 ΤΙΜΡ-1:金属蛋白酶-1的组织抑制剂。
[0057]动物.C57I3L/6J 小鼠（15-天怀孕母鼠）得自化arles River Laboratories Japan (Kana邑awa, Japan)。丰良据Japanese Pharmacological Society Guidelines for Animal Use圈养和护理在该研究中使用的所有动物。在溫度（23 ± 2°C)、湿度（45 ± 10%)、光照（12-小时人造光照和黑暗循环；光照从8:00到20:00)和空气交换的受控条件下 将动物饲养在SP的受备中。在实验室中维持高压(20 ± 4 Pa)W防止设备的污染。将动物圈 养在聚碳酸醋笼KN-600 (Pfetsume Seisakusho, Japan)中，每笼最多4只小鼠。将灭菌的 PULMA^i (Material Research Center, Japan)用作垫层，并每周换一次。提供随意享用 的灭菌的固体HFD，其被放在笼的顶部的金属盖中。从装配有橡胶塞子和吸管的水瓶提供随 意享用的纯净水。水瓶每周一换，清洁并在高压蓋中灭菌和重新使用。通过刻在耳环上的数 字鉴别小鼠。每个笼子标记有特定的鉴别代码。
[0化引测试物质.测试物质化合物A(为β-连环蛋白抑制剂4-(((6S，9S，9aS)-1-(节 基氨基甲酯基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代-8-(哇嘟-8-基甲基)八氨-1H-化嗦并[2，1-C ] [ 1， 2,4]Ξ嗦-6-基）甲基)苯基二氨憐酸醋）和媒介物(憐酸盐缓冲盐水，pH 7.6)储存在4°C。 在即将施用之前用媒介物稀释化合物A。替米沙坦（MICARDIS?)购自Boehringer Inge化eim GmbH并溶解在纯净水中。
[0059] NA甜的诱导.通过W下方法在40只雄性小鼠中诱导NA甜:在出生后2天单次皮下 注射200 yg链脈霉素（Sigma-Aldrich, USA)并在4周龄后喂养高脂肪饮食（册D，57 kcal%脂肪，cat# Η抑32，化EA化pan, Japan)。在9周龄时将小鼠随机分配至5个8只小 鼠的组中。将用正常饮食(cat# CE-2,化EA化pan)喂养(不用链脈霉素处理）的八只雄性 同胞仔用作正常组。
[0060] 药物施用途径.W0.11 pL/hr (2.64 μL动物/天）的输注速率将化合物A和媒 介物通过用渗透累(ALZET累，cat# 1004，DURECT Co巧oration, USA)连续皮下输注施 用。在治疗开始(第0天)时，W基于个体的体重确定的浓度将测试物质溶液填充至渗透累 中。通过口服途径W10 mL/kg体重的体积施用替米沙坦。
[0061] 治疗剂量.mg/kg/天(低剂量)或3 mg/kg/天(高剂量)的剂量连续输注化合 物AdWIO mg/kg体重的剂量每日一次地施用替米沙坦。
[0062] 全血和血清生物化学的测量.在全血中使用Life化eck化IDIA，化pan)测量非 禁食血糖。对于血清生物化学，在无抗凝剂的聚丙締管中收集血液，并在室溫下保持30分 钟，随后在4°C保持1小时。然后将血液样品在4°C下在1，000 xg离屯、15分钟。收集上清液并 胆存在-80°C下直至使用。通过即JI DRI-CHEM 7000 (Fujifilm,化pan)测量血清ALT和 TG水平。
[0063] 肝径基脯氨酸含量的测量.为了定量肝径基脯氨酸含量，将冷冻的肝样品（35-45 mg)通过如下的碱-酸水解方法进行处理：将肝用100%丙酬脱脂，风干，在65°C下溶解于2N 化0H中，并在12rC下在高压蓋中处理20分钟。将裂解的样品（400化）用400化6N HC1 在121°C下酸水解20分钟，并用400 pL含有10 mg/血活性炭的4N化0H中和。向样品中加 入AC缓冲液(2.2M乙酸/0.48M巧樣酸，400 pL)，随后离屯、W收集上清液。为了构建径基脯 氨酸的标准曲线，W16 pg/mL为起始制备反式-4-径基-L-脯氨酸(Sigma-Aldrich)的系列 稀释液。将制备的样品和标准品（各400化）与400 yL氯胺Τ溶液（Wako Pure畑emical Industries,化pan)混合并在室溫溫育25分钟。然后将样品与化rlich氏溶液(400 pL) 混合并在65°C加热20分钟W显色。在将样品在冰上冷却并离屯、W除去沉淀物之后，在560 nm测量每一上清液的光密度。从径基脯氨酸标准曲线测量径基脯氨酸的浓度。肝样品的蛋 白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific, USA)确定，并用于将测量的 径基脯氨酸值标准化。径基脯氨酸水平被表达为yg/mg总蛋白。
[0064]肝TG含量的测量.肝总脂质提取物用Folch氏方法(Folch J.等人，J. Biol. 化em. 1957; 226 (1): 497)从右叶获得。将肝在氯仿-甲醇(2:1，v/v)中匀浆化，并在室 溫溫育过夜。在用氯仿-甲醇-水(8:4:3, v/v/v)洗涂后，将提取物蒸发至干燥，并且溶解在 异丙醇中。肝TG水平通过甘油Ξ醋E-测试(Wako Pure化emical Indushies)测量。当TG 含量超过检测限时，将提取物2-至4-倍稀释在异丙醇中。
[00化]组织病理学分析.对于肥染色，从在Bouin氏溶液中预先固定并用Lillie-Mayer 氏苏木精（Muto Pure Chemicals, Japan)和曙红溶液（Wako Pure Chemical Industries)染色的肝组织的石蜡块切制切片。根据Kleiner (Kleiner DE.等人， Hepatology, 2005 (41) :1313)的标准计算NAFID活性评分（NAS)。为了将胶原沉积可视 化，将Bouin氏固定的肝切片使用苦天狼星红溶液(Waldeck Gm地& Co., Germany)染色。 对于定量分析，围绕中央静脉使用数码照相机(DFC280, Leica, Germany) W200倍放大获 取天狼星红染色的切片的亮视野图像，并使用ImageJ软件（ImageJ,化tional Institute of Health, USA)ii量5个视野/切片中的阳性区域。
[0066] 定量RT-PCR.根据制造商的说明书使用RNAiso (Takara Bio,化pan)从肝样品 中提取将RNA。使用在20 yL的终体积中含有4.4 mM MgC12 (Roche, Switzerland)、40 U R化se抑制剂（Toyobo，化pan)、0.5mMdNTP(Promega，USA)、6.28μM随机六聚物 (Promega), 5 X 第一链缓冲液（PromegaKlO ml 二硫苏糖醇（Invitrogen, USA)和200 U 匪LV-RT (Invitrogen)的反应混合物逆转录1 pg的RNA。反应在37°C进行1小时，随后在99 °C进行5分钟。使用实时PCR DICE和SYBR预混物Taq (Takara Bio)进行实时PCR。为了计 算相对mRNA表达水平，将每个基因的表达标准化至参照基因36B4 (基因符号：化IpO)的表 达。PCR-引物集合和板布局的信息描述在表1中。
[0067] 统计分析.使用Bonferroni多重比较检验在Prism 4软件（Graph化d Software, USA)上进行统计分析。P值< 0.05被认为是统计上显著的。结果表达为平均值± SD。
[0068] 实施例2.实验设计和处理 研究组.治疗计划的概述提供在表1中。
[0069] 组1:正常.从第9-12周龄，给8只正常小鼠喂养随意享用的正常饮食而无任何治 疗。
[0070] 组2:疾病对照.从第9-12周龄，给8只NA甜小鼠喂养随意享用的Η抑而无任何治 疗。
[0071] 组3:替米沙坦.从第9-12周龄，给8只ΝΑ細小鼠口服施用补充有替米沙坦 10 mg/kg每日的剂量)的纯净水。
[0072] 组4:媒介物.从第9-13周龄，通过经由渗透累W0.11 pL/hr的速率连续输注给8 只NASH小鼠皮下施用媒介物(憐酸盐缓冲盐水）。
[0073] 组5:化合物A低剂量.从第9-13周龄，通过经由渗透累mg/kg/天的剂量连 续输注给8只NASH小鼠皮下施用补充有化合物A的媒介物。
[0074] 组6:化合物A高剂量.从第9-13周龄，通过经由渗透累W3 mg/kg/天的剂量连续 输注给8只NASH小鼠皮下施用补充有化合物A的媒介物。
[0075] 表1.治疗计划的概述 _^^^
* W0.11 μ1/虹（2.64 μ1/动物/天)的速率连续输注。
[0076] 动物监测和处死.每天监测活力、临床迹象和行为。在药物施用前每日记录体重。 在每次施用后大约60分钟，观察到小鼠的显著的毒性、垂死和死亡的临床迹象。通过在乙 酸麻醉下直接屯、脏穿刺(Wako化re Qiemical Industries)驱血法处死物。
[0077] 实施例3.结果 天狼星红染色.与正常组相比，来自疾病对照组的肝切片显示了肝小叶中屯、周围区域 中的增加的胶原沉积。与正常组相比，纤维化区域(天狼星红-阳性区域)的百分比在疾病对 照组中显著增加（正常：0.27 ± 0.05%，疾病对照：1.09 ± 0.27%)。与疾病对照组相 比，纤维化区域在替米沙坦组中显著减少(替米沙坦：0.50 ± 0.10%)。在媒介物组和化合 物A低-剂量组(媒介物：1.02 ± 0.33%，化合物A低-剂量：0.82 ± 0.31%)之间的纤 维化区域没有显著差异。参见表2。如附图1中可见，与媒介物组相比，化合物A高-剂量组的 纤维化区域显著减少（化合物A高-剂量：0.67 ± 0.21%)。天狼星红-染色的切片的显微 照片展示在附图2中。
[0078] 体重变化和一般状况.除了替米沙坦组外，在治疗期间所有组的体重都逐渐增 加。在整个治疗期间，疾病对照组的平均体重低于正常组。从第6天到第21天(处死）（除第7 天外）替米沙坦组的平均体重显著低于疾病对照组。在治疗期间，媒介物组和化合物A低- 剂量或高-剂量组之间的平均体重没有显著差异。在整个治疗期间，在任一动物中没有观察 到一般状况的恶化。
[00巧]处死当天的体重.疾病对照组的处死时的平均体重显著低于正常组(正常：26.3 ± 0.8 g，疾病对照：23.0 ± 1.2 g)。与疾病对照组相比，替米沙坦组显示了平均体重 的显著下降（替米沙坦：20.0 ± 1.3 g)。媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂量组之间 的平均体重没有显著差异(媒介物：22.9 ± 2.9 g，化合物A低-剂量：22.6 ± 2.6 g， 化合物A高-剂量：23.7 ± 1.1 g)。
[0080] 肝重和肝/体重比.与正常组相比，疾病对照组的平均肝重显著增加(正常：1128 ± 44 mg,疾病对照：1867 ± 183 mg)。与疾病对照组相比，替米沙坦组显示了平均肝重 的显著下降（替米沙坦：1376 ± 80 mg)。媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂量组的平 均肝重之间没有显著差异(媒介物：1870 ± 418 mg，化合物A低-剂量：1803 ± 219 mg，化合物A高-剂量：2024 ± 159 mg)。与正常组相比，疾病对照组的肝/体重比显著增 加 (正常：4.3 ± 0.2%，疾病对照：8.1 ± 0.6%)。与疾病对照组相比，替米沙坦组显示 了肝/体重比的显著下降（替米沙坦：6.9 ± 0.7%)。媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂 量组的肝/体重比之间没有显著差异(媒介物：8.1 ± 1.1%，化合物A低-剂量：8.0 ± 0.8%，化合物A高-剂量：8.5 ± 0.6%)。
[0081 ] 全血血糖.与正常组相比，疾病对照组的血糖水平显著增加（正常：198 ± 30 mg/化，疾病对照：682 ± 63 mg/化）。与疾病对照组相比，替米沙坦组的血糖水平显著增 加(替米沙坦：880 ± 39 mg/化）。媒介物组和化合物A低-剂量组之间的血糖水平没有显 著差异(媒介物：605 ± 134 mg/化，化合物A低-剂量：677 ± 36 mg/化）。与媒介物组 相比，化合物A高-剂量组的血糖水平有增加倾向（化合物A高-剂量：791 ± 54 mg/化)。
[0082] 血清ALT.与正常组相比，疾病对照组的血清ALT水平有增加倾向（正常：22 ± 4 U/L，疾病对照：38 ± 8 U/L)。疾病对照组和替米沙坦组或媒介物组和化合物A低-剂量 或高-剂量组之间的血清ALT水平没有显著差异（替米沙坦：35 ± 6 U/L，媒介物：58 ± 29 U/L，化合物A低-剂量：45 ± 17 U/L，化合物A高-剂量：49 ± 17 U/L)。
[0083] 血清TG.与正常组相比，疾病对照组的血清TG水平有增加倾向（正常：137 ± 22 mg/化，疾病对照：558 ± 256 mg/化）。疾病对照组和替米沙坦组的血清TG水平之间没有 显著差异（替米沙坦：843 ± 609 mg/化）。媒介物组和化合物A低-剂量组之间的血清TG 水平没有显著差异(媒介物：391 ± 175 mg/dL，化合物A低-剂量：815 ± 754 mg/ 化）。与媒介物组相比，化合物A高-剂量组的血清TG水平增加(化合物A高-剂量：1145 ± 580 mg/化）。
[0084] 肝径基脯氨酸含量.与正常组相比，疾病对照组的肝径基脯氨酸含量有增加倾向 (正常：0.74 ± 0.22 yg/mg,疾病对照：1.09 ± 0.42 yg/mg)。疾病对照组和替米沙坦 组或媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂量组的肝径基脯氨酸含量之间没有显著差异 (替米沙坦：0.95 ± 0.25 pg/mg，媒介物：0.79 ± 0.19 pg/mg，化合物A低-剂量： 0.90 ± 0.26 yg/mg，化合物 A 高-剂量：0.95 ± 0.22 yg/mg)。
[00化]肝TG含量.与正常组相比，疾病对照组的肝TG含量显著增加（正常：8.8 ± 3.8 mg/g,疾病对照：67.7 ± 17.7 mg/g)。与疾病对照组相比，替米沙坦组显示了肝TG 含量的显著下降（替米沙坦：30.6 ± 5.6 mg/g)。媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂 量组的肝TG含量之间没有显著差异(媒介物：58.8 ± 26.9 mg/g，化合物A低-剂量： 64.8 ± 25.6 mg/g，化合物 A 高-剂量：67.8 ± 24.0 mg/g)。
[0086] 肥染色和NAFLD活性评分.来自疾病对照组的肝切片显示了严重的微泡性和大 泡性脂肪沉积，肝细胞气球样变和炎性细胞浸润。与运些观察相一致地，与正常组相比，疾 病对照组的NAS显著增加(正常：0.0 ± 0.0，疾病对照：5.1 ± 1.1)。与疾病对照组相 比，替米沙坦组显示了脂肪沉积、肝细胞气球样变和炎性细胞浸润的显著改善，具有NAS的 显著降低（替米沙坦：2.6 ± 1.2)。与媒介物组相比，在化合物A低-剂量组中，小叶炎症 得到改善。在媒介物组和化合物A高-剂量组的皿-染色的切片之间没有发现明显差异。与 媒介物组相比，NAS在化合物A低-剂量和高-剂量组中降低倾向（媒介物：5.9 ± 1.0,化 合物A低-剂量：4.8 ± 0.9,化合物A高-剂量：5.1 ± 0.6)。
[0087] 基因表达分析. TIMP-1.与正常组相比，疾病对照组的TIMP-1 mRNA表达水平显著上调(正常：1.00 ±0.25，疾病对照：7.04±2.13)。与疾病对照组相比，替米沙坦组的1'這?-11111?^4表 达水平有下调倾向（替米沙坦：4.10 ± 1.18)。媒介物组和化合物A低-剂量或高-剂量组 的TIMP-1 mRNA表达水平之间没有显著差异(媒介物：7.74 ± 4.15,化合物A低-剂量： 5.35 ± 2.82,化合物 A 高-剂量：6.73 ± 2.23)。
[008引 a-SMA.与正常组相比，疾病对照组的a-SMA mRNA表达水平有上调倾向（正常： 1.00 ± 0.60,疾病对照：2.43 ± 1.33)。疾病对照组和替米沙坦组的a-SMA mRNA表达 水平之间没有显著差异(替米沙坦：1.83 ± 0.36)。与媒介物组相比，化合物A低-剂量组 的a-SMA mRNA表达水平有下调倾向（媒介物：3.19 ± 1.81，化合物A低-剂量：1.88 ± 0.60)。媒介物组和化合物A高-剂量组的a-SMA mRNA表达水平之间没有显著差异(化 合物A高-剂量：2.23 ± 1.23)。
[0089] 3型胶原.与正常组相比，疾病对照组的3型胶原mRNA表达水平显著上调（正常： 1.00 ± 0.16，疾病对照：2.27 ± 0.35)。与疾病对照组相比，替米沙坦组的3型胶原 mRNA表达水平有下调倾向（替米沙坦：1.73 ± 0.33)。与媒介物组相比，化合物A低-剂 量组的3型胶原mRNA表达水平显著下调（媒介物：3.09 ± 1.51，化合物A低-剂量： 1.93 ± 0.37)。与媒介物组相比，化合物A高-剂量组的3型胶原mRNA表达水平有下调倾 向（化合物A高-剂量：2.22 ± 0.46)。
[0090] 化合物A低-剂量组显示了纤维化相关基因（3型胶原，TIMP-1和a-SMA)的表达水 平的显著下降或下降倾向，而化合物A高-剂量组显示了肝组织学的纤维化区域的显著减 少。参见，表3。
[0091] 实施例4.综述和讨论 运些结果显示了化合物A对肝脏具有抗纤维化作用。低剂量组还显示了肝中的小叶炎 症减少，NAS有下降趋势。运指示了除了抗纤维化作用之外化合物A对脂肪性肝炎的抗炎作 用。施用W化合物A为代表的β-连环蛋白抑制剂的运些抗纤维化和抗炎活性的协同作用在 肝纤维化的纤维发生前阶段可W是特别有效的。
【主权项】
1用于、治疗月干?千维化的治士??廿IR_4左TX疋? 士 |17电1女||/^入編甘具有下式(I) ·其中： A 是-CHR7-， 其中R7是氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基烷 基、任选取代的杂芳基烷基、任选取代的环烷基烷基、任选取代的杂环烷基烷基、任选取代 的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环烷基； G 是-NH-、-NR6-、-〇-、-CHR6-或-C (R6) 2_， 其中R6独立地选自任选取代的烷基、任选取代的烯基和任选取代的炔基； R1是任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基、任选取代的环烷基烷基或任选取代 的杂环烷基烷基； R2 是-W21-W22-Rb-R20, 其中W21是-(CO)-或-(SO2)-; W22是键、-〇-、-NH-或任选取代的低级亚烷基；Rb是键或 任选取代的低级亚烷基；和R2t3是任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任 选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环烷基或任选取代的杂环烷基；和 R3是任选取代的烷基、任选取代的烯基或任选取代的炔基； 或其药学上可接受的盐。2.权利要求1的化合物，其选自： (6S，9S)-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-2,9-二甲基-8-(萘-1-基甲基)-4,7-二氧代八氢-IH-R比嗪并[2, l_c][l，2,4]二嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-2-烯丙基-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-9-甲基-8-(萘-1-基甲基)-4,7-二氧代 八氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-9-甲基-8-(萘-1-基甲基)-4,7-二氧代六氢吡嗪并 [2，1-。][1，2,4]噁二嗪-1(6!〇-甲酰胺， (6S，9S)-8-((2-氨基苯并[d]噻唑-4-基）甲基）-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-2,9-二甲 基-4，7-二氧代八氢-IH-吡嗪并[2，1-c] [ 1，2，4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-羟基苄基）-2,9-二甲基-4，7_二氧代-8-(喹啉-8-基甲基）八 氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-2-烯丙基-N-苄基-6-(4-羟基苄基）-9-甲基-4，7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲 基)八氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酰基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲基)八 氢-IH-吡嗪并[2，I-c ][ I，2，4]三嗪-6-基）甲基)苯基二氢磷酸酯， 4-(((65,95)-1-(苄基氨基甲酰基)-2,9-二甲基-8-(萘-1-基甲基)-4,7-二氧代八氢-IH-吡嗪并[2，I-C ][ 1，2，4]三嗪-6-基）甲基)苯基二氢磷酸酯， 4-(((6S，9S)-1-(苄基氨基甲酰基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲基)八 氢-IH-吡嗪并[2，I-C ][ 1，2，4]三嗪-6-基）甲基)苯基磷酸钠， 4-(((65,95)-1-(苄基氨基甲酰基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(萘-8-基甲基)八氢-IH-吡嗪并[2，l-c][l，2,4]三嗪-6-基）甲基)苯基磷酸钠， (6S，9S)-2-烯丙基-6-(4-羟基苄基)-9-甲基-4,7-二氧代-N-( (R)-I-苯基乙基）-8-(喹啉-8-基甲基)八氢-IH-吡嗪并[2，l-c][l，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-2-烯丙基-6-(4-羟基苄基)-9-甲基-4,7-二氧代-N-( (S)-I-苯基乙基）-8-(喹啉-8-基甲基)八氢-IH-吡嗪并[2，l-c][l，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-羟基-2，6-二甲基苄基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲基)八氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (63,93)-8-(苯并[13]噻吩-3-基甲基)-1苄基-6-(4-羟基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二 氧代八氢-IH-吡嗪并[2，1-c] [ 1，2，4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-8-(苯并[c][l，2,5]噻二唑-4-基甲基)-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-2,9-二甲 基-4，7-二氧代八氢-IH-吡嗪并[2，1-c] [ 1，2，4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-8-(异喹啉-5-基甲基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代八 氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S)-N-苄基-8-( (5-氯噻吩并[3，2-b]吡啶-3-基）甲基)-6-(4-羟基苄基)-2,9-二 甲基-4，7-二氧代八氢-IH-吡嗪并[2，1-c] [ 1，2，4]三嗪-1-甲酰胺， (6S，9S) -N-苄基-6- (4-羟基苄基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代-8-(喹噁啉-5-基甲基)八 氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺，和 (6S，9S)-6-(4-羟基苄基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲基)-N-(噻吩-2-基甲基)八氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺。3. 权利要求1的化合物，其选自： 4-(((63,93,9&3)-1-(苄基氨基甲酰基)-2,9-二甲基-4,7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲 基)八氢-IH-吡嗪并[2，1-〇][1，2,4]三嗪-6-基）甲基)苯基二氢磷酸酯， 或(6S，9S，9aS)-N-苄基-6-(4-羟基苄基)-2，9-二甲基-4，7-二氧代-8-(喹啉-8-基甲 基)八氢-IH-吡嗪并[2，1-(：][1，2,4]三嗪-1-甲酰胺。4. 药物组合物，其包含权利要求1、2或3的化合物。5. 治疗肝纤维化的方法，包含给有此需要的患者施用有效量的权利要求1、2或3的化合 物。6. 权利要求5的方法，其中肝纤维化由乙型肝炎感染引起。7. 权利要求5的方法，其中肝纤维化由非酒精性脂肪性肝炎（NASH)引起。
【文档编号】C07F9/6561GK105899211SQ201480057194
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月17日
【发明人】小路弘行, 小田上刚直
【申请人】小路弘行, 小田上刚直