大肠杆菌病用疫苗的制作方法

大肠杆菌病用疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种大肠杆菌病防治剂，其包含：志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白。
【专利说明】
大肠杆菌病用疫苗
技术领域
[0001] 本发明设及对大肠杆菌病具有预防和治疗效果的防治剂。
【背景技术】
[0002] 微生物病原体存在通过几种机制中的一种机制感染宿主的情况。运些微生物病原 体有时会通过皮肤的外伤侵入，有时也会与粘膜表面发生相互作用。通过该机制起作用的 细菌病原体和病毒病原体最初会与粘膜表面接触，并附着于粘膜表面，接着，进行集落化或 被派伊尔氏淋己集结(Peyer's patches)及其它淋己滤泡上的上皮中的被特殊化的吸收细 胞(M细胞)吸收(take up)。 抗感染有机体的特异性毒性决定子的分泌型IgA(sIgA)抗体在粘膜免疫性方面起重要 作用。在许多情况下，通过刺激抗感染有机体的相关毒性决定子的粘膜sIgA水平的产生，从 而能防止粘膜表面的初期感染。分泌型IgA能通过阻碍附着和/或集落化，中和表面作用毒 素或者防止宿主细胞的侵入，从而防止与病原体的粘膜表面的初期相互作用。
[0003] 猪浮肿病高发于断乳后，被大肠杆菌感染所引起。在猪浮肿病的预防和治疗中使 用抗生素，但从食品安全和出现耐性菌的担忧方面来看，迫切需要确立替代抗生素的预防 方法。然而，现在没有有效用于浮肿病的疫苗。大肠杆菌性腹泻发病于哺乳期和刚断乳后。 虽然市售有给予母猪型的哺乳期用疫苗，但其不能覆盖母体抗体开始用尽的断乳期的腹 泻，且在市场上并未销售有断乳期腹泻用的疫苗。认为若有能同时预防运些疾病的经口给 予型疫苗则非常有用。
[0004] 专利文献1中记载了将拟南芥培养细胞和窝宦子叶片断进行转化，W使糖链修饰 被抑制的被改变的浮肿病毒素 B亚基（Stx2eB)瞬时表达。然而，将在转化体中所产生的 Stx2eB再作为疫苗实际使用时的性能并没有得到确认。 专利文献2中公开了用于W下的技术:在基因重组植物中，将猪浮肿病疫苗抗原和大肠 杆菌性腹泻病抗原连接并使其高蓄积。然而，专利文献2中，还残留着确认该重组植物是否 能作为疫苗进行实际利用的问题。另外，专利文献2中并未探讨（1)大肠杆菌不耐热性毒素 B 亚基化TB)和Stx2eB的融合顺序、W及(2)附加于LTB的N-结合型糖链分别对植物细胞内的 抗原蓄积和疫苗性能的影响。 非专利文献1中，使用基因重组大肠杆菌表达和纯化Stx2eB-LTB融合抗原，并对其性能 进行评价。然而，并未进行作为宿主使用草替或窝宦等植物的性能评价。另外，也未研究LTB 和Stx2eB的融合顺序对植物细胞内的抗原蓄积、疫苗性能所产生的影响。进一步地，对于 Stx2eB-LTB融合抗原，虽确认了 Stx2e毒素预防效果，但并未进行从LT毒素预防的观点的评 价。此外，对动物的给予通过注射(添加有佐剂)进行，但未确认作为更简便且低成本的方法 经口给予(无佐剂添加）中的免疫诱导的有无。 现有技术文献 专利文献
[0005] 专利文献1:日本专利特开2012-19719号公报 专利文献2:国际公开W02009/133882号小册子 非专利文献
[0006] 非专利文献l:Ran et al. .Veterinary Microbiology 127(2008)209-15

【发明内容】
发明要解决的问题
[0007] 本发明的课题在于:针对包含大肠杆菌不耐热性毒素亚基化T)和浮肿病毒素亚基 (Stx2e)的大肠杆菌病防治剂，使植物细胞内的抗原蓄积和防治(疫苗效果、免疫增强效果 或治疗效果)性能最佳化。 解决问题的手段
[000引为解决上述问题，本发明人经专屯、研究，结果发现:包含大肠杆菌不耐热性毒素 B 亚基化TB)和浮肿病毒素 B亚基(Stx2eB)的大肠杆菌病防治剂，与单独使用各自的亚基的情 况相比，其在猪浮肿病和大肠杆菌性腹泻的双方面预防中具有更高的效果。 另外，本发明人发现，通过在大肠杆菌不耐热性毒素 B亚基化TB)的90位Asn残基上附加 N-结合型糖链，从而能进行植物细胞内的高效生产，且作为防治剂(疫苗效果、免疫增强效 果或治疗效果)有效。 如此，本发明人完成本发明。
[0009]也就是说，本发明如下所述。 (1) 一种大肠杆菌病防治剂，其特征在于，包含:志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性 毒素亚基的融合蛋白。 (2) 如（1)记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基通过 肤接头融合。 (3) 如（1)或(2)记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基 均为B亚基。 (4) 如（3)记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基的B亚基的73位天冬酷胺(Asn)残基变 更为丝氨酸(Ser)。 (5) 如(3)或(4)记载的防治剂，其中，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基上附加有糖链。 (6) 如（5)记载的防治剂，其中，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基的90位天冬酷胺 (Asn)残基上附加有N-结合型糖链。 (7) 如（1)~(6)中的任一项记载的防治剂，其中，志贺毒素的C末端侧上融合有大肠杆 菌不耐热性毒素。 (8) 如（1)~(6)中的任一项记载的防治剂，其中，志贺毒素的N末端侧上融合有大肠杆 菌不耐热性毒素。 (9) 如（1)~(8)中的任一项记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导针对大肠杆菌易热 毒素的抗体的蛋白质抗原或免疫增强剂。 (10) 如(9)记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导IgA的蛋白质抗原或免疫增强剂。 (11) 如(9)记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导IgG的蛋白质抗原或免疫增强剂。 (12) 如（1)~（11)中的任一项记载的防治剂，其中，大肠杆菌病为大肠杆菌性腹泻。 (13) 如（12)记载的防治剂，其中，大肠杆菌病是猪浮肿病和大肠杆菌性腹泻运两种疾 病。 (14) 一种饲料，其特征在于，包含（1)~（13)中的任一项记载的防治剂。 (15) -种防治非人类的动物的大肠杆菌病的方法，其特征在于，向非人类的动物给予 通过包含DNA构建物的重组载体进行转化后的可食用植物，所述DNA构建物包含编码志贺毒 素的亚基和大肠杆菌易热毒素的亚基的融合蛋白的DNA。 (16) -种用于防治大肠杆菌病的融合蛋白，其特征在于，其为志贺毒素的亚基和大肠 杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白。 (17) -种用于制造大肠杆菌病防治剂的融合蛋白的应用，其特征在于，所述融合蛋白 为志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白。 发明效果
[0010] 本发明的大肠杆菌病防治剂，与现有技术文献所记载的疫苗相比，植物细胞内的 抗原蓄积和防治(疫苗效果、免疫增强效果或治疗效果)性能显著得到改善。 通过本发明的大肠杆菌病防治剂，能同时预防猪浮肿病和大肠杆菌性腹泻。 本发明中，由于使可食植物中蓄积蛋白质抗原并经口给予，因此，能期待省成本化、省 力化W及通过降低家畜应激而获得的生产率提高。 本发明的大肠杆菌病防治剂能预防大肠杆菌病的症状或者能进行治疗。将本发明的大 肠杆菌病防治剂给予健康状态的非人类的动物时，能期待疫苗效果和作为免疫增强剂的效 果。
【附图说明】
[0011] [图1 ]显示本发明的大肠杆菌病防治剂表达用构建物。
[图2]显示使用了半乳糖柱的融合蛋白的纯化（电泳照片）。
[图3]显示窝宦中的融合蛋白质的蓄积(电泳照片）。
[图4]显示将转化植物经口给予后的小鼠血清的抗IgG抗体效价。
[图引显示将转化植物经口给予后的小鼠血清的抗IgA抗体效价。
[图6 ]显示将转化植物经口给予后的小鼠肠道洗涂液的抗IgA抗体效价。
[图7]显示将转化植物经口给予后的兔血清的抗IgG抗体效价推移。
[图引显示由转化植物的经口给予所产生的猪浮肿病预防效果。（A)表示时间表。采用 每组3头猪进行实验。阴性对照中，给予空载体窝宦。(B)表示临床评分。从攻击第一天(25日 龄)开始，累计至剖检日（34日龄）。数据表示3头猪的平均值和标准偏差。（C)表示从攻击第 一天至剖检日的增加体重比例（W攻击首日作为基准）。数据表示3头猪的平均值和标准偏 差。健康猪没有给予窝宦和攻击。
【具体实施方式】
[0012] 本发明的大肠杆菌病防治剂，其有效成分是志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性 毒素的亚基的融合蛋白质。 志贺毒素（Stx)是肠出血性大肠杆菌化皿C，STEC)所产生的蛋白质性毒素，分为1型 (51:义1)和2型（51:义2)。51:义1分为曰~(1的亚类（31113(31曰33)，51:义2分为曰~旨的亚类。该志贺毒素 是由作为毒素主体的1分子A亚基和通过与肠道粘膜结合而起作用的5分子B亚基构成的全 毒素，具有作用于真核细胞的核糖体、阻碍蛋白质合成的作用。志贺毒素是成为感染肠出血 性大肠杆菌或频疾杆菌时可见到的出血性腹泻、溶血性尿毒症综合征化US)、急性脑病等各 种病态的直接原因的病原因子。由于志贺毒素对来自非洲绿猴的肾脏上皮的培养细胞 (Vero细胞)显示出细胞毒性，因而也被称为Vero毒素。 猪浮肿病是通过经口感染产生Stx2e的肠出血性大肠杆菌、并在体内吸收小肠内产生 的该毒素而发病。该病会出现全身浮肿，且是一个急性过程，显示出高死亡率。 本说明书中，^56〇10^).6的氨基酸序列表示5*义26的4亚基（5*义264)，^56〇10 ^).8的氨基酸序列表示8亚基（51义268)。另外，569 1〇^).8表示51义20 6亚基蛋白质 (GenBank登录号AAQ63639)的成熟区域(去除分泌于周质的分泌信号肤，Alal9~Asn87)的 氨基酸序列。本说明书中，仅称为"Stx2e B亚基蛋白质"、"Stx2eB"时，是指由上述成熟区域 的氨基酸序列构成的Stx2e B亚基蛋白质。 本发明中，Stx化的B亚基中，例如Asn73(即SEQ ID ^.8的氨基酸序列的55位4311残基） 被取代成Ser。用SEQIDN0.10表示SEQIDN0.8的氨基酸序列的55位Asn残基被取代成Ser 的氨基酸序列（Asn73Ser)。
[0013] Stx2eA和Stx2eB，只要向猪给予而能引起免疫应答，则SEQ ID N0.6或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸可各自被取代、缺失、插入 或附加。作为上述"数个"，例如在Stx2eA中优选2~30个，更优选2~20个，进一步优选2~10 个;在Stx2eB中优选2~10个，更优选2~5个，进一步优选2~3个。 另外，51义化4和51义268可^是分别与沈9 10側.6或沈9 10側.8或沈9 10側.10所示 的氨基酸序列具有优选85% W上、更优选90% W上、进一步优选95% W上的同一性且给予 猪时能引起免疫应答的氨基酸序列。 只是，SEQ ID NO. 10中包含上述取代等的序列或者具有与SEQ ID NO. 10上述同一性的 序列是，SEQ ID NO. 10的55位残基被取代成Ser的序列。 此外，本发明中所使用的Stx2e可W是A亚基或B亚基中的任意个，但优选B亚基。
[0014] 大肠杆菌性腹泻是由于产肠毒性大肠杆菌化TEC)所产生的蛋白质性大肠杆菌不 耐热性毒素化T)所导致的。LT是由作为毒素主体的1分子A亚基和5分子B亚基构成的全毒 素。LT的A亚基化TA)通过侵入细胞质内，使细胞内的cAMP浓度上升，使细胞膜氯离子通道活 化，从而起水渗出至肠道内，即腹泻病状。LT的B亚基化TB)是无毒的，其与LT毒素和肠道细 胞之间的粘附有关。 作为LTB可举出具有WSEQ ID NO.12所示的氨基酸序列的蛋白质，但只要给予猪时能 引起免疫应答，SEQ ID NO. 12所示的氨基酸序列中的一个或数个氨基酸就可W被取代、缺 失、插入或附加。作为上述"数个"，例如在LTB中，优选是2~10个，更优选是2~5个，进一步 优选是2~3个。沈Q ID NO. 12所示的氨基酸序列被登记为Gen Bank登录号AAL55672。 此外，LTB还可W是分别与SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有优选85%W上、更优选 90 % W上、进一步优选95 % W上的同一性并且给予猪时能引起免疫应答的序列。
[0015] 本发明的优选的实施方式中，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基上附加有糖链。更 优选地，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基的90位（即SEQ ID NO.8的90位）的Asn残基上附 加有N-结合型糖链。在90位为Asn残基的LTB亚基蛋白质的说明中/'数个"可W是在SEQ ID NO. 12所示的氨基酸序列的第90位的Asn残基W外的位置上，优选2~10个、更优选2~5个、 进一步优选2~3个的氨基酸被取代、缺失、插入或附加。 另外，90位为Asn残基的LTB亚基蛋白质，除了对应于SEQ ID NO. 12所示氨基酸序列的 90位的位置是AsnW外，还可W是与SEQ ID ^.12所示的氨基酸序列具有优选85%^上、更 优选90% W上、进一步优选95% W上的同一性的蛋白质。 此外，^569 10^.14表示569 10^).8的90位被取代为丝氨酸(56')残基的1；18亚基 蛋白质的氨基酸序列。可使用在SEQ ID NO. 14中包含上述取代等的序列或与SEQ ID NO. 14 具有上述同一性的序列，但在SEQ ID NO. 14中包含上述取代等的序列或与SEQ ID NO. 14具 有上述同一性的序列，其SEQ ID NO. 14的90位的残基是被取代为Ser的状态。
[0016] 本发明的大肠杆菌病防治剂是W如上所述的志贺毒素和大肠杆菌不耐热性毒素 的融合蛋白作为有效成分，因此，优选的是该防治剂可作为针对大肠杆菌不耐热性毒素的 抗体，例如诱导IgAJgG的疫苗或免疫增强剂发挥功能。 本发明的优选的实施方式中，由本发明的大肠杆菌病防治剂所诱导的抗体具有不耐热 性毒素肠毒素化化)的毒素中和活性。 本发明的大肠杆菌病防治剂具有大肠杆菌病的症状的防治(疫苗效果、免疫增强效果 或治疗效果)效果。本发明中所称的大肠杆菌病包括猪浮肿病(产肠毒性大肠杆菌）、大肠杆 菌性腹泻（肠出血性大肠杆菌）、肠侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌、肠致病性大肠杆 困。 所谓本发明的大肠杆菌病防治剂的有效成分即融合蛋白是通过基因重组技术制备的 蛋白质，其是通过将巧中W上蛋白质基因（编码区域)连接并连续转录和翻译而形成一个蛋 白质的物质。本发明中使用的融合蛋白质可W是蛋白质之间直接融合，也可W通过肤接头 进行结合。
[0017] 在优选的实施方式中，本发明的大肠杆菌病防治剂是将志贺毒素蛋白质的B亚基 与大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基通过肤接头将串联连接而成的融合蛋白。 本发明中，志贺毒素蛋白质的B亚基与大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基被融合的顺序可 W是任一个在先。另外，在植物中表达时，融合顺序是将Stx2eB配置于N末端侧的顺序具有 重组蛋白质变高蓄积的倾向。 本申请说明书中，有时将志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白 作为有效成分的大肠杆菌病防治剂、W及通过肤接头将志贺毒素蛋白质的B亚基与大肠杆 菌不耐热性毒素的B亚基串联连接所形成的融合蛋白、编码该融合蛋白的DNA构建物、通过 包含编码该融合蛋白的DNA构建物的载体进行转化后的植物等统称为大肠杆菌病防治剂。 另外，本发明的大肠杆菌病防治剂只要包含上述融合蛋白，就可W是疫苗或免疫增强剂等 药品和饲料中的任意形态。本发明中，所谓防治包含预防和治疗的中的任意项。
[0018] 本发明中所使用的肤接头的氨基酸的个数优选为12~25个，更优选为12~22个。 另外，本发明中所使用的肤接头中，优选脯氨酸的含有率为20~27%，更优选为20~25%。 在肤接头中，脯氨酸优选W每隔2个配置或每隔3个配置。然而，即使在运种情况下，肤 末端中，脯氨酸W外的氨基酸可在5个W内、优选4个W内的范围内连续。如此优选的肤接 头，例如记载于国际公开W02009/133882小册子中。 本发明中，肤接头优选是由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列构成的肤(PG12)或由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列构成的肤(PG12V2)。也可W是具有与运些序列90% W上、优选 95% W上同一性的肤接头。
[0019] 优选本发明中所使用的融合蛋白中，志贺毒素的B亚基与大肠杆菌不耐热性毒素 的B亚基通过上述肤被串联连接。本发明中所使用的融合蛋白更优选W下形成的蛋白：各B 亚基通过口612(569 10^.2)或口612乂2(569 10^.4)被串联连接。本发明中所使用的融合 蛋白可包含A亚基，但在包含A亚基时，优选为A亚基被无毒化。 另外，本发明中所使用的融合蛋白优选进一步在其C末端附加有上述肤接头。特别是， 本发明中所使用的融合蛋白优选在其C末端附加有PG12或PG12v2。 本发明中所使用的融合蛋白，例如具有SEQ ID NO. 15~18所示的氨基酸序列。具有SEQ ID NO. 15~18所示的氨基酸序列的融合蛋白中，志贺毒素的B亚基与大肠杆菌不耐热性毒 素的B亚基可W通过PG12或PG12V2被串联连接，并在其C末端进一步附加有PG12或PG12V2。 通过将上述PG12或PG12V2等的肤作为用于连接上述融合蛋白的接头使用，从而该融合 蛋白在植物细胞中的蓄积水平增大。
[0020] 本发明中所使用的融合蛋白优选在其氨基末端附加有来自植物的分泌信号肤或 叶绿体转移信号肤。此处，所谓"附加"是:既包括在通过上述肤连接的融合蛋白的氨基末端 上，直接结合有上述分泌信号肤的情况、也包括通过其它肤结合的情况的概念。 分泌信号肤优选来自属于茄科（Solanaceae)、十字花科（Brassicaceae)和菊科 (Asteraceae)的植物，更优选来自属于烟草属(Nicotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、窝宦 属(Xactuca)等的植物，进一步优选来自烟草（化cotiana taba州m)、拟南芥（Arabidopsis thaliana)、窝宦（Lactuca sativa)等。 另外，分泌信号肤优选来自烟草的β-D-葡聚糖外切水解酶（β-D-glucan exohy化olase)、烟草的38kDa的过氧化物酶(GenBank登录号D42064)。作为上述分泌信号 肤，例如可举出来自烟草的β-D-葡聚糖外切水解酶并具有SEQ ID NO.28所示氨基酸序列的 肤。编码烟草的0-D-葡聚糖外切水解酶的DNA的碱基序列，例如WSEQ ID NO. 27表示。 优选的叶绿体转移信号肤，例如记载于国际公开W02009/004842号小册子和国际公开 W02009/133882 小册子中。
[0021] 此外，本发明中所使用的融合蛋白还可W在其簇基末端附加有内质网滞留信号 肤、液泡运输信号肤等信号肤。此处，所谓"附加"是包含W下情况的概念:既包括在上述融 合蛋白的簇基末端上，直接结合有信号肤的情况，也包括介由其它肤结合的情况。本说明书 中，将在氨基末端附加有分泌信号肤且在簇基末端附加有内质网滞留信号肤的杂合蛋白又 称为内质网型化R)杂合蛋白，将编码该内质网型融合蛋白的DNA构建物称为内质网型DNA构 建物。内质网型融合蛋白在真核生物中有效蓄积的报告例有很多。 本发明中所使用的融合蛋白，在其簇基末端优选附加有内质网滞留信号肤。优选的内 质网滞留信号肤，例如记载于国际公开W02009/004842号小册子和国际公开W02009/133882 号小册子中，但可W利用皿化序列（SEQ ID NO.29)。 其它优选的液泡运输信号肤，例如记载于国际公开W02009/004842号小册子和国际公 开W02009/133882号小册子中。
[0022] 本发明中使用的融合蛋白可通过化学合成，也可W通过基因工程进行生产。关于 通过基因工程进行生产的方法如后所述。
[0023] 本发明中所使用的DNA构建物，其特征在于包含编码本发明的融合蛋白的DNA。 也就是说，本发明中使用的DM构建物包含W下的DM:编码志贺毒素的亚基的DNA和编 码大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的DNA(优选编码志贺毒素的B亚基的DNA和编码大肠杆菌 不耐热性毒素的B亚基的DNA)通过编码上述肤的DNA被串联连接而成的DNA。编码上述肤接 头的DNA，例如WSEQ ID N0.UPG12)或SEQ ID N0.3(PG12v2)表示。作为编码志贺毒素蛋白 质的0魁，例如可举出编码51义264的0魁（569 10^.5)、编码51义268^31173)的0魁（569 10 ^}.7)、编码51义268^3117356')的0麻(569 10^.9)。作为编码大肠杆菌不耐热性毒素的 DNA，例如可举出编码B亚基（Asn90)的DNA(SEQ ID腸.11)、编码8亚基^3119056')的0麻 (SEQ ID NO. 13)。编码上述肤的DNA、编码志贺毒素蛋白质的DNA和编码大肠杆菌不耐热性 毒素的DNA，除了终止密码子，使阅读框合并连接。
[0024] 编码志贺毒素蛋白质的DNA和编码大肠杆菌不耐热性毒素的DNA，例如可根据SEQ ID NO.9、11、13的碱基序列通过一般的基因工程学手段而获得。具体来说，通过产生各志贺 毒素的细菌，按照常规方法制备cDNA文库，并使用从该文库基于上述碱基序列制备而成的 探针，选择所期望的克隆。另外，也可通过基于上述碱基序列的化学合成、将上述碱基序列 的5'和3'末端的碱基序列作为引物，将基因组DNA作为模板的PCR等进行合成。 编码本发明中所使用的融合蛋白的DNA，例如用SEQ ID NO. 19~22表示。
[0025] 编码融合蛋白的DNA，优选表示构成融合蛋白的氨基酸的密码子被适当改变，W使 杂合蛋白的翻译量根据产生该蛋白质的宿主细胞而增大。 作为改变密码子的方法，例如可参考Kang等人(2004)的方法。另外，可举出选择宿主细 胞中使用频率高的密码子的方法、或选择GC含量高的密码子的方法或者选择宿主细胞的看 家基因中使用频率高的密码子的方法。
[00%]另外，编码融合蛋白的DNA也可W是在严格的条件下与具有SEQ ID NO. 19~22的 碱基序列的DNA进行杂交的DNA。"严格的条件"是指形成所谓特异性杂交且不形成非特异性 杂交的条件。例如，可举出同一性高的2个DNA(之间具有优选80 % W上、更优选90 % W上、特 别优选95% W上同一性的2个DNA)进行杂交、但比该同一性低的2个DNA不会杂交的条件。例 如可举出2XSSC(300mM化Cl、30mM巧樣酸）、42°C，优选地可举出0.1X XSSC(15mM化C1、 1.5111]\1巧樣酸）、60°(：。
[0027] 本发明中使用的DNA构建物中，优选编码上述融合蛋白的DNA可表达地连接于增强 子。此处，"可表达"是指本发明所使用的DNA构建物被插入到包含适当的启动子的载体中并 将该载体导入到适当的宿主细胞时，在宿主细胞内生产上述融合蛋白。另外，所谓"连接"是 既包含2个DNA直接结合的情况也包含通过其它碱基序列结合的情况的概念。 作为增强子，可举出Kozak序列和来自植物的醇脱氨酶基因的5'-非翻译区。特别优选 的是，编码上述杂合蛋白的DNA可表达地连接于来自植物的醇脱氨酶基因的5非翻译区。
[0028] 醇脱氨酶基因的5'-非翻译区是指包含从编码醇脱氨酶的基因的转录起始点到翻 译起始点(ATG、蛋氨酸)之前为止的碱基序列的区域。该区域具有翻译量增大功能。"翻译量 增大功能"是指被结构基因编码的信息被转录后被翻译而产生蛋白质时，使通过翻译产生 的蛋白质量增大的功能。上述区域只要来源于植物即可，优选来源于属于茄科 (Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，更优选来源于属于烟 草属（化cotiana)、拟南芥属(Arabidopsis)、窝宦属(Xactuca)等的植物，进一步优选来源 于烟草（Nicotiana tabacum)、拟南芥（Arabidopsis thaliana)、窝宦（Lactuca sativa) 等。 作为上述醇脱氨酶基因的5 '-非翻译区，例如可使用来自烟草(Nicotiana taba州m)的 醇脱氨酶基因的5 非翻译区（NtAD册'UTR) (SEQ ID NO. 30)，通过使用改变翻译起始点上 游3碱基后的化40册'17^区域(化40血〇(15'1]了1〇(569 10^.31)，从而能期待更高翻译。 获得来自植物的醇脱氨酶基因的5 非翻译区的方法，例如记载于日本专利特开2012- 19719号公报和国际公开W02009/133882号小册子中。
[0029] 另外，如569 10顯.31的碱基序列所示的上述化40血〇(15'17^，只要保持翻译量 增大功能，也可具有一个或数个碱基的取代、缺失、插入或附加。作为上述"数个"，优选2~ 10个，更优选2~5个，特别优选2~3个。 另外，还可使用具有与上述化AD血od 5'UTR优选85% W上、特别优选90% W上的同一 性且保持翻译量增大功能的DNA。
[0030] 对于上述区域是否具有作为目标的翻译量增大功能，例如可通过在烟草培养细胞 中将GUS(i3-葡萄糖醒酸酶)基因或巧光素酶基因作为报告基因的瞬间表达分析(transient assay)、重组于染色体的转化细胞中的分析等来确认。
[0031] 本发明中使用的DNA构建物，例如具有SEQ ID NO.23~26所示的碱基序列。 具有569 10肋.23化巧-)所示碱基序列的0麻构建物是在化40血〇(15'1]了1?(569 10 NO. 31)上连接编码W下融合蛋白的DNA的DNA构建物，所述融合蛋白中，1个LTB蛋白质(野生 型Asn90)和1个Stx2eB蛋白质（突变型Asn73Ser)介由PG12被串联连接，并在氨基末端附加 有分泌信号肤，在簇基末端附加有内质网滞留信号肤。 具有569 10肋.24化斗-)所示碱基序列的0麻构建物是在化40血〇(15'1]了1?(569 10 NO. 31)上连接编码W下融合蛋白的DNA的DNA构建物，所述融合蛋白中，1个LTB蛋白质（突变 型Asn90Ser)和1个Stx2eB蛋白质（突变型Asn73Ser)介由PG12被串联连接，并在氨基末端附 加有分泌信号肤，在簇基末端附加有内质网滞留信号肤。 具有569 10肋.25化-1>)所示碱基序列的0麻构建物是在化40血〇(15'1]了1?(569 10 N0.31)上连接编码W下融合蛋白的DNA的DNA构建物，所述融合蛋白中，l个Stx2eB蛋白质 (突变型Asn73Ser)和1个LTB蛋白质（野生型Asp90)介由PG12被串联连接，并在氨基末端附 加有分泌信号肤，在簇基末端附加有内质网滞留信号肤。 具有SEQIDN0.26化-レ）所示碱基序列的DNA构建物是在化AD血od5'UTR(SEQID N0.31)上连接编码W下融合蛋白的DNA的DNA构建物，所述融合蛋白中，l个Stx2eB蛋白（突 变型Asn73Ser)和1个LTB蛋白（突变型Asp90Ser)介由PG12被串联连接，并在氨基末端附加 有分泌信号肤，在簇基末端附加有内质网滞留信号肤。
[0032] 本发明中使用的DNA构建物，可通过一般性的基因工程学手段来制备，可W将来自 植物的醇脱氨酶基因的5'-非翻译区、编码来自植物的分泌信号肤的DNAW及编码融合蛋白 的DNA、编码内质网滞留信号肤的DNA等各种DNA分别用适当的限制酶切割并用适当的连接 酶进行连接来构建。
[0033] 本发明中使用的重组载体，其特征在于包含上述DNA构建物。本发明中使用的重组 载体，只要是编码上述融合蛋白的DNA插入于载体内而使其能在被导入有载体的宿主细胞 中表达即可。对于载体，只要其能在宿主细胞中复制，就没有特别限定，例如可举出质粒 DNA、病毒DNA等。另外，载体优选包含耐药性基因等的选择标记。质粒DNA可从大肠杆菌或± 壤杆菌通过碱提取法(8^扣〇山记.(：.&0〇17^.(1979)加。161〇3(^(11^3 7:1513)或其变 法等来制备。此外，作为市售的质粒，例如可使用地1221、981121、98110巧化16121血等。作 为病毒 DNA，例如可使用 pTB2 等（参照 Donson J.，Kerney CM.，Hilf ME.，Dawson WO.Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector.Proc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:7204-7208)〇
[0034] 载体内使用的启动子，可根据导入有载体的宿主细胞而适当选择。例如，优选使用 花挪菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.1985化化re 313:810)、水稻的肌动蛋白启动子 (Zhang et al.l991Plant Cell 3:1155)、玉米泛素启动子（Cornejo et al.l993Plant Mol.Biol.23:567)等。此外，载体内使用的终止子也同样可根据导入有载体的宿主细胞而 适当选择。例如，优选使用姻脂碱合成酶基因转录终止子、花挪菜花叶病毒35S终止子、拟南 芥热休克蛋白18.2基因的终止子化SP-T)等。本发明所使用的优选的终止子，例如是SEQ ID ^.32所示的服口-1'。
[0035] 本发明中使用的重组载体，例如可按照W下所述进行制备。 首先，用适当的限制酶切断上述DNA构建物或通过PCR附加限制酶位点，并插入到载体 的限制酶位点或多克隆位点中。
[0036] 本发明中使用的转化体，其特征在于，用上述重组载体进行转化。用于转化的宿主 细胞可W是真核细胞和原核细胞中的任意种。 作为真核细胞，优选使用植物细胞，其中，优选使用属于窝宦属化actuca)等的菊科 (Asteraceae)、茄科、十字花科、襲科的植物细胞。进一步地，优选使用属于窝宦属 (Lactuca)的植物细胞，尤其优选使用窝宦化ac化ca sativa)细胞。使用窝宦细胞作为宿主 细胞时，载体可使用花挪菜花叶病毒35S RNA启动子等。 作为原核细胞，可使用大肠杆菌化scherichia col i )、±壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens，根癌±壤杆菌）等。
[0037] 本发明中使用的转化体，可通过使用一般性的基因工程手段将本发明所使用的载 体导入到宿主细胞来制作。例如，可使用利用±壤杆菌的导入方法化〇〇d，et al. ,1993， Transgenic,Res.2:218，Hiei,et al.，1994Plant J.6:271)、电穿孔法（Tada,et al., 1990,Theor.Appl.Genet,80:475)、聚乙二醇法（Lazze;ri,et al. ,1991, Theor. A卵1.Genet. 81:437)、基因枪法（Sanford, et al. , 1987, J.Part. Sci . tech. 5:27)、 聚阳离子法(Ohtsuki)等方法。
[0038] 将本发明中使用的载体导入到宿主细胞后，可根据选择标记的表现型来筛选上述 转化体。另外，可通过培养筛选后的转化体来生产上述志贺毒素蛋白质。培养中所使用的培 养基和条件可根据转化体的种类进行适当选择。 此外，当宿主细胞为植物细胞时，可按照常规方法培养筛选后的植物细胞，从而使植物 细胞再生，并能使上述志贺毒素蛋白质蓄积在植物细胞内或植物细胞的细胞膜外。例如，根 据植物细胞的种类不同而不同，若是马铃馨，贝可举出Visser等（Theor.Appl .Genet 78: 594( 1989))的方法;若是烟草，则可举出Naga化与Takebe(Planta 99:12( 1971))的方法。
[0039] 若是窝宦，例如可在包含O.lmg/1 NAA(糞乙酸）、0.05mg/l BA(苄基腺嚷岭）和 0.5g/l聚乙締基化咯烧酬的MS培养基中使新芽（shoot)再生，并可通过将再生的新芽在包 含0.5g^聚乙締基化咯烧酬的1 /2MS培养基中培养来发根。 此外，本发明中使用的种子可通过从如上所述地再生的植物体中采取种子来获得。本 发明中使用的种子可通过用适当方法播种、栽培，从而作为生产上述细菌毒素蛋白质的植 物体，运样的植物体也包含于上述转化体中。
[0040] ±壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，根癌±壤杆菌）通过植物的伤口而感染， 运输被称为肿瘤诱发性的Ti( tumor-inducing)质粒的大染色体外因子。在许多研究所中， 经数年专屯、研究后，通过±壤杆菌系的开发，能将各种植物组织按照惯例进行转化。作为通 过该技术被转化的代表性植物，有烟草、番茄、向日葵、棉、油菜、马铃馨、白杨W及大豆、草 替、水稻等。 对于各种植物，证实了从利用上壤杆菌(Agrobacteri皿tumefaciens，根癌±壤杆菌） 转化后的组织再生成植物的情况。作为该植物，可举出向日葵、番茄、白Ξ叶草、油菜、棉花、 烟草、马铃馨、玉米、草替、水稻、其它许多蔬菜作物。 本发明中，优选通过±壤杆菌Ti载体转化W上述窝宦为首的可食用植物。
[0041] 本发明的大肠杆菌病防治剂还可包含上述转化体。本发明的大肠杆菌病防治剂可 包含含有上述融合蛋白的转化体的全部，也可W包含含有上述融合蛋白的转化体的一部 分。另外，可直接使用转化体，也可进行干燥、粉碎等后使用。此外，本发明的大肠杆菌病防 治剂中，也可混入提高融合蛋白的免疫原性的佐剂。一般情况下，将氨氧化侣、霍乱毒素 (CTB)、不耐热性肠毒素化TB)、细菌的鞭毛(例如沙口氏菌的鞭毛蛋白）等被作为佐剂使用。
[0042] 本发明的大肠杆菌病的防治方法，其特征在于，向动物给予用上述DNA构建物转化 后的植物体或其干燥物或者粉碎物。作为本发明的大肠杆菌病的防治对象，可举出猪、牛、 鸡、绵羊、山羊、狗、猫等，优选给予猪。由本发明的大肠杆菌病防治剂所引起的免疫，优选针 对哺乳期~120日龄的猪(优选哺乳期~90日龄的猪)进行，W及优选针对繁殖期前后的母 猪进行。作为免疫方法，可举出W下方法:将用上述DNA构建物转化后的植物体给予母猪，将 母猪所产生的抗体通过乳汁授给仔猪的方法；W及将用上述DNA构建物转化后的植物体给 予哺乳期~90日龄的仔猪而使仔猪直接免疫的方法等。 作为将本发明的大肠杆菌病防治剂给予猪的方法，可举出在猪饲料中混合用上述DNA 构建物转化后的植物体或其干燥物或者粉碎物并给予猪的方法、对猪进行滴鼻的方法等。 本发明的大肠杆菌病防治剂优选W-定的间隔给予多次。例如可举出每隔4~7天总计给予 2~3次的方法。 W下，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不局限于运些实施例。 【实施例】
[0043] 实施例1.大肠杆菌表达用蛋白质基因的构建 作为蛋白质抗原的候选，使用1)产肠毒素性大肠杆菌所产生的不耐热性毒素的无毒B 亚基化TB)和2)肠出血性大肠杆菌所产生的Vero毒素的无毒B亚基(Stx2eB)。 另外，LTB在窝宦内质网中产生时，在第90位Asn残基上被附加 N-结合型糖链，也制备出 将该Asn取代为Ser的突变体下将野生型表示为L+，将突变型表示为心）。5*^26日是按照 下述方法制备的：使用糖链附加位点突变体(Asn73Ser，W下表示为E-)，^1^+或心两种融合 顺序连接，制作4种融合抗原化巧-、心6-、6-]>、6寸-)。所得的片段化+6-、心6-、6-]>、6寸-) 分别用SEQ ID N0.19~22的碱基序列表示。各抗原融合于Stx2eB的信号肤，并连接于IPTG 诱导性启动子，插入到祀T101载体（Invitrogen)(图1)。 具体来说，通过使用 Stx2eB-SDSP-F 引物(aaatctagaaataataaggagttaagaatgaagaa (SEQ ID N0.33)，下戈lJ线为XbaI位点）和Stx2eB-SP-R引物 (aaaggatcctgcattaacagaaaccaatgcaaa(SEQ ID NO. 34)，下划线为BamHI位点），将包含 Stx2eB的核糖体结合位点(SD序列）和信号肤的区域扩增。 将得到的片段用Xba巧邮amHI处理，并插入到W下所示的pRI909L+、k、L巧-、kE-、E-L +、6寸-的乂6曰1-8曰111阳中。使用Xba巧日SacI切出SD序列-Stx2eBSP-抗原区-Η呢L片段，并插入 到祀TlOlQnvitrogen)的甜al-SacI间隙中（图1)。
[0044] 实施例2.使用大肠杆菌的抗原的生产 将各表达载体导入到重组蛋白质生产用大肠杆菌(BL21DE3)中。挑取所得到的重组大 肠杆菌的单菌落，用包含lOOmg/L氨节青霉素的LB培养基化B+Amp培养基)培养一晚后，与 50%甘油等量混合，储藏于-80°C。 用夹子刮取甘油储藏液并种菌于LB+Amp培养基中，在37°C、180rpm下进行过夜预培养。 将1ml培养液放入已装有250ml LB+Amp培养基的化带挡板烧瓶中继续接种，并在37°C、 180巧m下进行培养。在0. D.达到0.4~0.6时加入IPTG(终浓度ImM)，在25°C、120巧m下培养4 个小时。将培养液转移至50ml离屯、管，在SOOOrpm、室溫下离屯、5分钟，收集细菌。除去培养 基，再加入50ml培养液，在8000巧m、室溫下离屯、5分钟。菌体保存于-80°C。
[0045] 实施例3.来自表达重组LTB的大肠杆菌的可溶性蛋白质的制备 向实施例2所得的菌体，每125ml培养液添加20ml的溶解缓冲液(BugBuster ( 夕巧 求7)，包含〇.2mg/ml溶菌酶、ImM PMSF、30U/ml DNase I的PBS，pH7.4)，在室溫下用旋转器 揽拌30分钟。在8000rpm、4°C下离屯、20分钟，回收上清，转移至新离屯、管中。然后，重复该离 屯、操作2次。
[0046] 实施例4.使用半乳糖柱的重组抗原的纯化 向实施例3获得的菌体破碎液添加用PBST(包含0.05%吐溫20的PBS，pH 7.4)进行平衡 化后的半乳糖珠 （Immobilized D-Galactose Gel,Thermo SCIENTIFIC公司，No.20372) 5ml，用旋转器揽拌2小时。将悬浮液上样于色谱法用柱巧cono pack色谱法用柱，BIO-RAD公 司，#732-1010)，排出溶液。在柱中添加120ml PBST，进行柱洗涂。使用纳米微滴 (化no化op)，测定柱滴下溶液的280nm吸光度，并确认O.D.达到基线时的状况。洗涂不充分 时，适当追加 PBST进行洗涂。对每个馈分(fraction)添加含有0.5M半乳糖的PBST 1ml，洗脱 LTB。测定280nm吸光度，在确认没有蛋白质洗脱后，加入6M盐酸脈50ml，洗涂柱。用20 %乙醇 置换，在4Γ下保存柱。
[0047] 实施例5.纯化抗原的免疫原性评价 利用LTB对半乳糖的亲和性来进行亲和纯化而得的结果如图2A所示。另外，使用0.5M半 乳糖进行竞争洗脱，用于小动物免疫。 在无热变性的条件下进行SDS-PAGE时，在约70kDa的位置检测出纯化LTB(图2B)，认为 形成了五聚体。对于心和1+6-，也同样进行纯化抗原的制备。另外，E-L+在大肠杆菌内不溶 化，因此，未进行纯化抗原制备。
[0048] 实施例6.使用兔的免疫原性的确认 使用实施例4、5中制备的纯化抗原，对兔进行注射免疫，测定抗体效价。抗LTp抗体效价 在L+、L-、L+E-中的任一个中都被确认为增加，1；Γρ毒素中和活性也被检测出（表1)。从表1的 结果可知：（1)向LTB糖链附加部位导入突变不会影响中和抗体诱导；（2)用本发明的大肠杆 菌病防治剂也能诱导LTp中和抗体。抗Stx2e抗体效价的上升较弱，未检测出Stx2e毒素中和 活性。
[0049] 【表1】
中和活性是W达到阳性的最小血清量作为中和活性的效价。 #1与#2表示不同的兔个体的数据。
[0050] 实施例7.植物表达用蛋白质基因的构建 LTB和Stx2eB的组合化，制作了在Stx2eB的C末端上融合LTB(糖链附加有/无）的蛋白 质、与在N末端上融合LTB(糖链附加有/无）的蛋白质总计4种。此时，Stx2eB使用无糖链 Stx2eB(自N末端第73位的天冬酷胺取代为丝氨酸），无糖链LTB使用从N-末端开始第90位天 冬酷胺取代为丝氨酸的LTB。另外，运些蛋白质抗原基因介由被报道提高蓄积量的PG12间隔 区（spacerKMatsui et al,Transgenic Res,2011,20:735-48)或类似的PG12v2而连接，并 使用旁邻序列改变型化ADH 5 ' -UTR和A地SP终止子。进一步地，通过使用来自烟草的β-D-葡 聚糖外切水解酶分泌信号肤编码序列和内质网滞留信号化D化），谋求融合蛋白抗原候选蛋 白质的高蓄积化。
[0051] 植物表达用质粒的构建，具体来说如下所述进行。 按W下要点制作LTB(野生型Asn90)片段(去除向周质分泌的分泌信号肤的从Ala22至 Asnl24的区域）。^下的2个寡核巧酸链，通过3'互补末端进行退火后，使用T4DNA聚合酶 (Toyobo，化kui，日本)进行延伸反应。第一阶段中，使用LTB-A与LTB-B、LTB-C与1；18-0、1；18- E 与 LTB-F、LTB-G 与 LTB-H、LTB-I 与 LTB-J，分别制备 A+B、C+D、E+F、G+H和I+J片段。第二阶段 的反应中，使用A+B与C+D、E+F与G+H，制备A+化C+D和E+F+G+H片段。最后，使用A+B+C+D、E+F+ G+H和I + J，制备全长的A+B+C+D+E+F+G+H+1 + J片段。LTB (Asn90Ser)突变体的制备中，除了使 用LTB-IN90S代替LTB-IW外，其它如同上述进行制备。 LTB-A：ttggatccgccccccagaccatcaccgagttgtgcagcgagtac(SEQ ID NO.35) LTB-B:c邑tt邑at邑邑t邑ta邑attt邑邑邑t邑tt邑c邑邑tactc邑ct邑c(SEQ ID NO.36) LTB-C：cc曰tc曰曰eg曰c曰曰g曰tcctc曰get曰c曰ccg曰g曰gc曰tgg(SEQ ID NO.37) LTB-D：cttgaaggtgatgatcaccatctccctcttgccggccatgctc(SEQ ID NO.38) LTB-E：曰tc曰cette曰曰g曰geggeg曰g曰ccttcc曰ggteg曰ggtc(SEQ ID NO.39) LTB-F:cttctggctgtcgatgtgctggctgccggggacctcgacctggaa(SEQ ID NO.40) LTB-G：g曰c曰gee曰g曰曰g曰曰ggee曰teg曰g曰gg曰tg曰曰gg曰c曰ccctc曰gg曰tc(SEQ ID NO.41) LTB-H:邑c曰邑曰邑ctt邑tc邑曰tctt邑邑tctc邑邑t邑曰邑邑t曰邑邑t邑曰tcct邑曰（SEQ ID NO.42) LTB-I：曰曰gctctgcgtctgg曰曰c曰曰c曰曰g曰ccccc(SEQ ID NO.43) LTB-J:曰曰曰g曰tctgttctcc曰tgctg曰tggcggcg曰tgctgttgggggtcttgttgttcc曰g曰cgc曰g曰get t(沈Q ID NO.44) LTB-IN90S:aagctctgcgtctggaacagcaagaccccc(沈Q ID N0.45)
[0052] 将所得到的LTB(野生型Asn90)和LTB(Asn90Ser)的各片段用BamHI和Bgin切断 后，插入到Plasmidl4(Matsui et al. ,2009,Biosci .Biotechnol .Biochem. ,73,1628-34) 的脱憐酸化后的Ba恤I-Bglll间隙中。将所得的质粒分别用Bgin处理后，脱憐酸化，并插入憐 酸化后的PG12片段。另外，PG12片段是通过将PG12-F引物（gatcccctggttctggtcctggttctccta) (沈〇10側.46)和？612-1?引物（旨日1:。1日旨旨日旨日日。。日旨旨日。。日旨日日。。日旨旨旨）（56〇10側.47)退火 后，用T4多核巧酸激酶(PNK)(化W England Biolabs，Hitchin，UK)进行憐酸化而制得。用 Ba恤巧PSacI从所得的质粒中切出LTB-PG12-HD化片段，插入到2BH质粒(Matsui et al.， Transgenic Res .，2011，20 ; 735-48)的BamHI-SacI 间隙中。由此，制作了PRI909L+和 pRI909k表达用质粒。
[0053] 按照如下所述构建Stx2eBN73S-PG12v2融合片段。使用2BH质粒作为模板，用mStx2eB5- A引(曰曰邑邑曰tcc邑C邑邑C邑邑曰Ct邑C邑C邑曰曰邑邑邑C曰曰邑曰tc邑曰邑ttctc邑曰曰邑t曰C曰曰C邑曰邑邑曰C(SE0 ID NO.48), 下划线表示BamHI 位点）和PG12v2-R引物（aaagatc1:aggagaaccaggaccagaaccaggtcctct(SEQ ID ^.49)，下划线表示8旨111位点）进行？0?，扩增5*义268^35斗612乂2片段。将所得的片段 用 BamHI 和 Bglll 切断后，插入至リPlasmidl4(Matsui et al . , 20 0 9 , Biosci .Biotechnol.Biochem.，73，1628-34)的脱憐酸化后的BamHI-BglII间隙中。用BamHI 和SacI从所得的质粒中切出Stx2eBN73S-PG12v2-皿化片段，插入到2BH质粒的BamHI-SacI 间隙中（PRI909E-质粒）。
[0054] 按照如下要点构建本发明的大肠杆菌病防治剂表达盒。用BamHI和EcoRI从 pRI90 犯-质粒中切出 Stx2eBAsn73Ser-PGl 2v2-HD化-HSPT 片段。用 Xba 巧邮 gl Π 从 PRI909L+ 或pRI909k质粒中切出35S启动子-NtAD血odS'UTR-分泌信号肤-LTB-PG12片段。连接两个 片段，插入到2册质粒的Xbal-EcoRI间隙中，制作植物表达用的pRI909L+E-(SEQ ID N0.23) 质粒和93190化斗-(沈9 10^.24)质粒。 用BamH巧蛇coRI从PRI909L+质粒或pRI909k质粒中切出LTB-PG12-HD化-HSPT片段。用 Xbal和Bglll从PRI909E-质粒中切出35S启动子-NtADHmodS 'UTR-分泌信号肤- Stx化BAsn73Ser-PG12v2片段。连接两个片段，插入到2册质粒的Xbal-EcoRI间隙中，制作植 物表达用的93190犯-1^+(569 10^.25)质粒和91?190犯寸-(569 10^.26)质粒（图1)。
[0055] 实施例8.通过±壤杆菌进行的向窝宦的基因导入 将窝宦(Xac1:uca sativa L.)品种Green Wave(夕年^种苗）无菌接种于MS培养基[1/2 XMurashige · Skoog(厶クシク· 乂夕一少)培养基用混合盐类(MS盐，和光纯药工业），1X Murashige和Skoog维生素溶液(MS维生素，Sigma-Al化ich)，3%薦糖，0.8%琼脂，pH 5.8] 后，将第10~16天的本叶切断成5mm见方程度，将该切片浸溃于保持具有载体构建物的双元 质粒（pRI909)的±壤杆菌(Agrobacterium tumefacience (根癌±壤杆菌化HA105)悬浮液 10分钟后，接种于共培养培养基[1 XMS盐，1 XMS维生素，0.05mg/l 6-苄基氨基嚷岭(BA)， 0. lmg/1 1-糞基乙酸(NAA)，0.1M乙酷下香酬，3 %薦糖，0.8%琼脂，P册.8]，在25°C、黑暗中 培养2天。用灭菌水洗涂切片后，接种于选择性培养基[IXMS盐，IXMS维生素，0.05mg/l BA，0.1mg/l NAA，0.5g/l聚乙締化咯烧酬（PVP)，50mg/l卡那霉素（km)，250mg头抱嚷月亏 化6門，3%薦糖，0.8%琼脂，9册.8]，在25°(：、巧光灯(2000-300011^〇下进行培养。然后，在 获得不定芽为止，W每隔3~4天一次(2次/周）的间隔将其移植到新的选择性培养基。将由 不定芽形成的再分化个体移植到生根培养基[1/2 XMS盐，1 XMS维生素，0.5g/l PVP，250mg Cef ,3%薦糖，0.8%琼脂，pH5.引，在同样的条件下进行培养。然后，W每隔3~4天一次（2 次/周）的间隔将其移植到新的生根培养基。将生根的再分化个体进行盆栽，在同样的条件 下栽培。
[0056]实施例9.从窝宦中提取蛋白质 蛋白质提取是按照TCA-丙酬法（Shultz et al.Plant Mol Biol Rep,2005,23:405)， 使用经液氮冷冻后保存于-80°C的基因导入窝宦本叶进行。100-200mg的样品用 TissueLyzerll(QIAGEN)破碎后，加入样品的5倍量的TCA-丙酬（10%Ξ氯乙酸，90%丙酬， 0.07 % 2-琉基乙醇），混合，-20°C下静置1小时后，在16000 X g、4°C下离屯、30分钟，去除上 清，得到含有蛋白质的沉淀物。进一步地，为了去除杂质，加入样品的5倍量的丙酬/BME (100%丙酬，0.07%2-琉基乙醇），混合，在16000 Xg、4°C下离屯、10分钟，去除上清。该去除 杂质操作再进行2次。将沉淀物减压干燥后，悬浮于样品的2倍量的提取I缓冲液[0.5M氯化 钢，5mM咪挫，6M尿素，20mMS径甲基氨基甲烧(Tris)-HCl，pH7.9]中，在16000Xg、4°C下离 屯、10分钟，回收上清，得到蛋白质溶液。使用Protein Assay KitII (Bio-Rad)，进行蛋白质 浓度的测定。
[0057]实施例10. Western 分析 将所得的蛋白质溶液适量放入微型管内，加入同量的样品缓冲液化Z Apply,ATT0制 造)混合，沸水中加溫5分钟，进行样品的SDS化。蛋白质定量时的标准物质使用纯化LTB+。通 过用提取I缓冲液2倍稀释该物质并重复此稀释操作，由此制备稀释系列，将运些稀释系列 作为标准品。 蛋白质的电泳（SDS-PAGE)使用电泳槽(Mini PROTEAN Te化a Cell)和Mini PROTEAN TGX-凝胶(BIO RAD)。加入电泳缓冲液化Z Run,ATTO制造），孔中加入SDS化后的样品扣1，在 200V恒定电压下电泳40分钟。 电泳后的凝胶用Trans-blot转印包化10 RAD)，用Trans-blot Tu;rbo(BI0 RAD)进行印 迹(Blotting)。 将印迹后的膜浸于封闭溶液(TBS系，口^.2，十力弓斗テス夕），在室溫下振荡1小时或 在4°C下静置16小时后，在TBS-T( 137mM氯化钢，2.68mM氯化钟，1 %聚氧乙締脱水山梨醇单 月桂酸醋，25mM Tris-肥1，抑7.4)中进行3次室溫下的5分钟振荡，并洗涂。在LTB蛋白质的 检测中，用TBS-T将抗血清兔抗血清抗LTp 991109( inactive) (0.1 %化化)A0稀释10000倍 后使用。通过将膜浸于该稀释液中，室溫下振荡2小时，由此进行抗原抗体反应，并在TBS-T 中进行3次室溫下的5分钟振荡，并洗涂。对于二次抗体，使用WTBS-T稀释10000倍后的抗兔 IgG、AP-linked Antibody(Cell Si即aling Technology)。通过将膜浸于该稀释液中，室溫 下振荡1小时，由此进行抗原抗体反应，并在TBS-T中进行3次室溫下的5分钟振荡，洗涂。利 用碱性憐酸酶进行的显色反应是通过将膜浸于显色液(0.1M氯化钢，5mM氯化儀，0.33mg/ml 硝基四氮挫蓝，0.33mg/ml 5-漠-4-氯-3-吗I噪基憐酸，0.1M Tris-肥1，pH9.5)中，室溫下振 荡7分钟，由此进行，并且用蒸馈水洗涂膜后，在常溫下干燥。 显色后的膜通过扫描仪(PM-A900,爱普生）W600dpi的析像度进行成像，使用图像分析 软件(CS Analyzer ver.3.0,进行LTB蛋白质的定量。 使用图1所示的构建物制备的基因重组窝宦中被表达的融合蛋白的表达分析结果如图 3所示。在N-结合型糖链附加位点上导入突变后的心6-和6寸-中，在估计分子量（约20kDa) 的位置上检测到一条带（图3AKL+E-和E-L+中，除了检测到20kDa的带W外，还检测到被推 定为附加有N-结合型糖链的高分子量带。图3B表示各融合蛋白抗原的蓄积量。确认了使用 带有N-结合型糖链的LTB(L+)具有高于无 N-结合型糖链化-)的蓄积量的倾向，且融合顺序 是在N末端侧配置Stx2eB的蛋白质具有高蓄积趋势。
[0058]实施例11.基因重组蛋白质的抗原性(抗体诱导)的确认 为确认大肠杆菌不耐热性毒素 B亚基化+)、LTB糖链修饰部位突变体化-)、L+与浮肿病 毒素 B亚基（Stx2eB)的糖链修饰部位突变体的融合蛋白化+E-)的抗原性(抗体诱导），用弗 氏完全(或不完全)佐剂对纯化后的各蛋白质进行乳化，并对兔进行皮下免疫。按照第一次 5化g、之后W2周的间隔进行4次（lOOyg/次)追加免疫。用化ISA确认了针对抗原的抗体效价 充分上升后，进行全采血，离屯、分离，从而制备血清。
[0化9 ] 实施例12.重组窝宦的小鼠经口免疫 引入6周龄的Balb/c雌性小鼠，驯化，进行免疫前采血，从8周龄开始免疫。将包含相当 于90ygLTB的重组窝宦粉末用生理盐水悬浮后，使用胃管经口给予。给予粉末量与LTB等量。 经口给予每7天进行4次。在初次给予后的第10天和第28天进行采血，分离血清。血清在56°C 下进行30分钟处理，灭活化。关于重组窝宦粉末的经口给予，也同样地经口给予相当于65yg LTB的重组窝宦粉末。定期采血，分离血清，并灭活化。肠道洗涂液的采集是通过W下方式获 得:切取整个大肠和从回盲部开始5cm的小肠，用5mL PBS洗涂。在使用前为止保存于-80°C， 在测定抗体效价时添加蛋白酶抑制剂。
[0060] 实施例13.重组窝宦的兔经口免疫 引入体重2.化g的日本白兔，驯化，进行免疫前采血，之后每7天6次将包含相当于2mg LTB的重组窝宦粉末用生理盐水悬浮，进行经口给予。每次的给予量是L+E-和L+为2mg LTB 等量/次化+E-;0.85g窝宦粉末;L+;1.5g窝宦粉末），阴性对照的空载体窝宦为l.Og窝宦粉 末/次。初次给予后的第10天、28天、44天进行采血，分离血清。血清在56 °C下处理30分钟，灭 活化。使用蛋白G柱纯化IgG，用于中和活性测定。
[0061 ] 实施例14. Stx化的毒素中和活性测定 用Vero细胞检测法测定血清中的抗Stx2e毒素抗体的中和活性。在96孔细胞培养用板 中接种IX 10シ孔Vero细胞(来自非洲绿猴肾上皮的培养细胞），进行2天的预培养后，加入 半数细胞致死量的4倍的Stx2e，在二氧化碳培养箱(5%C02、37°C)中培养3天。Vero细胞的 存活判定是通过使用细胞计数试剂盒(同仁化学)测定细胞内脱氨酶活性来进行的。
[0062]实施例15.猪致泻性不耐热性肠毒素化化)的毒素中和活性测定 用C册细胞检测法测定血清中的抗LTp毒素抗体的中和活性。在8孔腔室玻片中加入待 测血清和终浓度为20ng/mL的LTp，并接种2.5 X 10^孔的CH0细胞（中国仓鼠卵巢细胞），在 二氧化碳培养箱(5 % C〇2、37 °C)中培养24小时。培养后，观察CH0细胞的形态，将细胞长径为 短径的2倍W上的细胞作为异型细胞。计算相对于总细胞数的异型细胞率，将其与自然产生 的异型细胞的发生率的比不超过50%的作为中和活性阳性。将中和活性达到阳性的最小血 清量作为中和活性的效价。
[0063] 实施例16.抗体效价的测定 使用将2.扣g/血抗原W10化L/孔进行固相化后的化ISA板(Maxi so巧，Nunc)进行抗体 效价的测定。就抗原而言，针对抗Stx2e抗体使用纯化后的无毒化Stx2e，针对抗LTp抗体使 用纯化后的LTp。对于待测血清，用包含0.1% (w/v)牛血清白蛋白的稀释液制备2倍稀释系 列，并用于化ISA板。对于二次抗体，通过使用辣根过氧化物酶化RP)标记抗体、基质使用过 氧化氨、显色剂使用ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethy化enzthiazoline-6-sulphonicacid， 2，2连氮-二(3-乙基苯并嚷挫嘟-6-横酸）的显色法进行检测。 将相对于作为阴性对照的稀释液的吸光度的平均值的2倍W上的吸光度作为抗体效价 阳性，将达到阳性的最大吸收率作为其血清的抗体效价。对于免疫前血清检测出抗体效价 时，将去除免疫前血清的抗体效价后的值作为该血清的抗体效价。结果如图4~7所示。 对于血清IgG和IgA(图4、5)、肠道洗涂液的IgA(图6)，在给予蛋白抗原窝宦的小鼠中确 认了抗体效价的上升。从运些结果可确认，通过融合蛋白抗原生产植物的经口给予能诱导 抗LTp抗体。而构建体之间的抗体诱导能力的显著差异并未观察到。 蛋白质抗原窝宦给予组中确认了抗LTp抗体效价的上升(图7)。从抗体效价充分上升的 第44天的血清中纯化IgG，进行LTp毒素中和活性评价。在L+E-免疫兔的全部两只、两只L+免 疫兔中的一只兔中确认了中和活性(表2)。
[0064] 【表2】 给予窝宦第44天的兔IgG的分析结果
[0065] 实施例17.浮肿病菌攻击试验 进行由蛋白质抗原窝宦的经口给予的浮肿病预防效果确认试验。试验中供试仔猪在分 娩后24小时前不给初乳而给予人工乳，随后恢复至母猪哺乳。对各试验组提供3头猪。在分 娩后第6、12、18天，将蛋白质抗原窝宦（相当于5*义268 2.3111旨的量)或空载体窝宦的冷冻干 燥粉末悬浮于水中，用连接了管的注射器强制给予。将来自猪的产志贺毒素大肠杆菌 (STEC，带广株，ST-，LT-)填充于肠溶性胶囊中，在第25、26、27天进行给予并攻击。测定体 重、饲料摄取量，同时每天观察临床症状，并对作为猪浮肿病典型症状的精力(0:正常，1:减 退，2:消失）、眼周围浮肿(0:无，1:轻度，2:中度，3:重度）、神经症状(0:无，1:轻度，2:中度， 3:重度)进行观察，评分化。另外，定期采血，采集粪便，并通过化ISA测定Stx2eB特异性抗体 效价。用STEC攻击的第7天进行安乐死后，解剖检查，用肉眼观察各脏器和组织的异常。制作 主要脏器的病理标本，观察病理组织学表现。结果如图8所示。 在E-L+与L+E-的临床症状与体重的增加两个指标中，都确认有浮肿病预防效果。 产业上的利用可能性
[0066]本发明的大肠杆菌性腹泻防治剂在畜产领域是有用的。
【主权项】
1. 一种大肠杆菌病防治剂，其特征在于，包含:志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒 素的亚基的融合蛋白。2. 如权利要求1记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基 通过肽接头融合。3. 如权利要求1或2记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的 亚基均为B亚基。4. 如权利要求3记载的防治剂，其中，志贺毒素的亚基的B亚基的73位天冬酰胺残基被 变更为丝氨酸。5. 如权利要求3或4记载的防治剂，其中，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基上附加有糖 链。6. 如权利要求5记载的防治剂，其中，在大肠杆菌不耐热性毒素的B亚基的90位天冬酰 胺残基上附加有N-结合型糖链。7. 如权利要求1~6中的任一项记载的防治剂，其中，志贺毒素的C末端侧上融合有大肠 杆菌不耐热性毒素。8. 如权利要求1~6中的任一项记载的防治剂，其中，志贺毒素的N末端侧上融合有大肠 杆菌不耐热性毒素。9. 如权利要求1~8中的任一项记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导针对大肠杆菌 不耐热性毒素的抗体的蛋白质抗原或免疫增强剂。10. 如权利要求9记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导IgA的蛋白质抗原或免疫增强 剂。11. 如权利要求9记载的防治剂，其中，所述防治剂为诱导IgG的蛋白质抗原或免疫增强 剂。12. 如权利要求1~11中的任一项记载的防治剂，其中，大肠杆菌病为大肠杆菌性腹泻。13. 如权利要求12记载的防治剂，其中，大肠杆菌病是猪浮肿病和大肠杆菌性腹泻这两 种疾病。14. 一种饲料，其特征在于，包含权利要求1~13中的任一项记载的防治剂。15. -种防治非人类的动物的大肠杆菌病的方法，其特征在于，向非人类的动物给予通 过包含DNA构建物的重组载体进行转化后的可食用植物，所述DNA构建物包含编码志贺毒素 的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白的DNA。16. -种用于防治大肠杆菌病的融合蛋白，其特征在于，其为志贺毒素的亚基和大肠杆 菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白。17. -种用于制造大肠杆菌病防治剂的融合蛋白的应用，其特征在于，所述融合蛋白为 志贺毒素的亚基和大肠杆菌不耐热性毒素的亚基的融合蛋白。
【文档编号】A61P7/10GK105899227SQ201480064772
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月25日
【发明人】泽田和敏, 松井健史, 泷田英司, 滨端崇, 佐藤寿男
【申请人】出光兴产株式会社, 国立研究开发法人国立国际医疗研究中心