一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法
【专利摘要】本发明涉及一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，包括如下步骤：a)选取体重为45?55g的草鱼，分为对照组及注射组，注射组草鱼注射1×107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；c)进行如下检测：1)红细胞计数；2)白细胞计数；3)红细胞比容测定；4)平均红细胞容积测定；5)白细胞分类计数；6)总蛋白测定；7)溶菌酶测定；8)过氧化物酶测定；9)免疫球蛋白M测定；10)总补体测定。本发明为鱼类免疫学研究提供科研指导，并揭示养殖生产上鱼类发病程度及给药剂量，该疾病模型的构建为水产养殖业科学健康发展奠定了一定的基础。
【专利说明】
一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及水产养殖技术领域，具体地说，是一种感染细菌性败血症草鱼疾病模 型的构建方法。
【背景技术】
[0002] 草鱼是草食性鱼类，也是我国优良的传统淡水渔业和淡水养殖的主要对象，草鱼 养殖在我国已有1700多年的历史。2012年，我国草鱼产量为444多万吨，占我国淡水养殖鱼 类总产量的20% (渔业统计年鉴，2012)，在世界淡水养殖鱼类中产量排名第一位。细菌性败 血症也称为细菌性出血病、爆发性出血病，最早发现于20世纪70年代末至80年代初，是由致 病性嗜水气单胞菌引起的急性转染病，从夏花鱼种到成鱼均可感染，严重地阻碍了草鱼养 殖业的发展。
[0003] 鱼类试验动物疾病模型在新渔药研发过程中起着举足轻重的作用，新渔药研发流 程有以下四个阶段:第一个阶段是发明（发现)阶段，第二个阶段是非临床(临床前)研究阶 段，第三个阶段是临床研究阶段，第四个阶段是上市后阶段。鱼类试验动物疾病模型一般在 第三阶段发挥作用，此阶段主要确定新渔药产品是否有进一步研发的意义。该试验包括试 验动物疾病模型耐受性试验，寻找有效剂量和中毒剂量范围，确定试验动物的有效性和安 全性;开展试验动物疾病模型的药代动力学及生物利用度试验，为下步推荐临床使用剂量 提供依据，即用健康靶动物在可控条件下进行药效对照试验，并进行鱼类试验动物疾病模 型药代动力学试验，确定初步的有效剂量，因此也有人称为剂量确定实验。试验动物疾病模 型对于学科和技术的发展极为重要，医学和陆生动植物已建立了包括动物试验、组织培养 和病原保藏中心等在内的数百种标准试验模型，有力地促进了医学和陆生动植物病害研究 的发展，而水生生物标准的试验模型（包括组织培养模型、鱼类试验动物疾病模型和病原 库)相对来说数量极少。
[0004] 中国专利201210115340X，公开了 一种草鱼水霉病疾病的建立方法，所述的方法选 自下列方法中的一种：1)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1 X 103-1 X 1〇5个/mL的水体中，25°C 下恒温养殖;2)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1 X 103-1 X 105个/mL的水体中，使水温在lh内 降低8~12°C或者使水温在lh内升高8~12°C，养殖。中国专利201110001159.1，公开了一种 建立鱼类脂肪肝实验模型的建立方法，包括以下步骤：1)采用腹腔注射的方式，对草鱼一次 性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后进行养殖;所述硫代乙酰胺的生理盐水溶 液中硫代乙酰胺的浓度为100~200mg/ml;2)养殖过程中，投喂油脂总量为4~6%的配合饲 料，养殖2~6周。而关于本发明的感染细菌性败血症草鱼疾病模型，目前还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种感染细菌性败血症草鱼疾病模 型的构建方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0007] 一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：
[0008] a)选取体重为45-55g的草鱼，平均分为对照组及注射组，注射组草鱼注射浓度为1 X 107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；
[0009] b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；
[0010] c)观察指标，取两组草鱼血液进行如下检测：
[0011] 1)红细胞计数(RBC);
[0012] 2)白细胞计数(WBC);
[0013] 3)红细胞比容测定(HCT);
[0014] 4)平均红细胞容积测定(MCV);
[0015] 5)白细胞分类计数；
[0016] 6)总蛋白测定(TP);
[0017] 7)溶菌酶测定(LSY);
[0018] 8)过氧化物酶测定(P0D);
[0019] 9)免疫球蛋白_则定（IgM);
[0020] 10)总补体测定(ACH50)。
[0021] 所述检测的方法如下：
[0022] 1)红细胞计数(RBC)，取新鲜血液20ul，加入到4mlNatt-Herricks缓冲液中，轻摇 混匀后静置2-3分钟，之后取10ul血液稀释液充入细胞计数板中，显微镜放大20倍计数，记 数区位于细胞计数板中央大方格的四角及中间的五个中方格；
[0023] 2)白细胞计数(WBC)，步骤同红细胞计数，白细胞记数区位于细胞计数板四角四个 大方格内；
[0024] 3)红细胞比容测定(HCT)，将新鲜血液充入温氏管中，离心机10000 X g，5分钟，离 心后静置10-20分钟，记下温氏管读数，乘以0.1即为红细胞比容值；
[0025] 4)平均红细胞容积测定(MCV)，采用如下公式换算：
[0027] 5)白细胞分类计数，用胶头滴管滴一滴新鲜血液于载玻片上，用另一片载玻片将 其推平，等血膜风干，之后用瑞氏染液染色，水洗风干后，放置在100倍显微镜下计数;计数 原则是随机视野下共计数100个白细胞，分别算出嗜中性粒细胞，单核细胞，血栓细胞及淋 巴细胞百分比；
[0028] 6)总蛋白测定(TP)，采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝G-250试剂配方如下表，
[0030] 7)溶菌酶测定(LSY)，溶菌酶的测定使用鱼类血清溶菌酶测定试剂盒测定；
[0031] 8)过氧化物酶测定(P0D)，过氧化物酶的测定使用鱼类血清过氧化物酶测定试剂 盒测定；
[0032] 9)免疫球蛋白Μ测定（IgM)，免疫球蛋白Μ的测定采用鱼类血清免疫球蛋白Μ测定试 剂盒测定；
[0033] 10)总补体测定(ACH50)，总补体的测定使用鱼类血清总补体测定试剂盒测定。
[0034]优选地，所述观察指标如下：
[0035] 1)注射后第7、14、21天白细胞计数；
[0036] 2)注射后第1、7天单核细胞百分比；
[0037] 3)注射后第1天嗜中性粒细胞百分比；
[0038] 4)注射后第14天血栓细胞百分比；
[0039] 5)注射后第14天淋巴细胞百分比；
[0040] 6)注射后第1、3天血清总蛋白含量；
[0041] 7)注射后第3天血清溶菌酶活力；
[0042] 8)注射后第1天血清过氧化物酶活力；
[0043] 9)注射后第7天免疫球蛋白Μ水平。
[0044] 本发明优点在于：
[0045] 本发明的感染细菌性败血症草鱼疾病模型为患有细菌性败血症草鱼提供参考;在 不同的免疫时间，草鱼体内免疫应答强弱也不同，养殖生产上的给药剂量可以根据本发明 的模型作出相应调整。在整个草鱼及鱼类养殖业上，该疾病模型不仅可以为鱼类免疫学研 究提供科研指导，并且可以揭示养殖生产上鱼类发病程度及给药剂量，该疾病模型的构建 为水产养殖业科学，健康的发展奠定了一定的基础。
【附图说明】
[0046] 附图1为建模后两组草鱼分别在第0、1、3、7、14、21天存活率统计。
[0047] 附图2为血液学指标测定结果，红细胞计数值(Α);白细胞计数值(Β);红细胞比容 (C);平均红细胞容积(D);单核细胞(Ε);嗜中性粒细胞(F);血栓细胞(G);淋巴细胞(Η)。*表 明差异显著(0.01〈?〈0.05)，**表明差异极显著(？〈0.01)。
[0048]附图3为血清学指标测定结果:总蛋白（A);溶菌酶活力(B);过氧化物酶活力（C); 免疫球蛋白Μ水平(D);总补体水平(Ε)。*表明差异显著(0.01〈？〈0.05)，**表明差异极显著 (P<0.01)〇
【具体实施方式】
[0049] 下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
[0050] 实施例1鱼疾病模型的构建
[0051 ] 1材料与方法
[0052] 1.1实验鱼
[0053] 80尾草鱼平均体重为45-55g，在22°C的水温下暂养一周。
[0054] 1.2实验方法
[0055]将水族箱中的自来水曝气1-3天，水温恒定为28±2°C，将草鱼分成两组，分别为对 照组及注射组，注射组给予注射浓度为1 X 107cfu/ml嗜水气单胞菌，对照组注射等量的生 理盐水，两组草鱼分别放入水族箱中，并于注射后的第〇，1，3,7，14,21天取血液进行后续分 析。使用SPSS软件对所得结果进行统计学处理。
[0056] 1.2.1血液学分析
[0057] 使用肝素钠润湿过的一次性注射器对草鱼进行腹腔采血，将采集的血液小心地推 入2支洁净的1.5ml离心管中，一支用于血液学分析；另一支于室温放置2h，之后放置在4°C 冰箱，过夜。之后将装有抗凝血的离心管放置在4°C离心机中，3000 X g离心5分钟，分离上层 血清用于血清学分析。
[0058] 1.2.1.1红细胞计数(1^〇
[0059] 取新鲜血液20ul，加入到4mlNatt-Herricks缓冲液中，轻摇混匀后静置2-3分钟， 之后取l〇ul血液稀释液充入细胞计数板中，显微镜放大20倍计数，记数区位于细胞计数板 中央大方格的四角及中间的五个中方格。
[0060] 1.2.1.2白细胞计数(冊〇
[0061 ]步骤同红细胞计数，白细胞记数区位于细胞计数板四角四个大方格内。
[0062] 1.2丄3红细胞比容测定(!1(：1')
[0063] 将新鲜血液充入温氏管中，离心机10000 Xg，5分钟，离心后静置10-20分钟，记下 温氏管读数，乘以〇. 1即为红细胞比容值。
[0064] 1 · 2 · 1 · 4平均红细胞容积测定(MCV)
[0065] 平均红细胞容积参照公式进行换算：
[0066] 1 · 2 · 1 · 5白细胞分类计数
[0067]用胶头滴管滴一滴新鲜血液于载玻片上，用另一片载玻片将其推平，等血膜风干， 之后用瑞氏染液染色，水洗风干后，放置在100倍显微镜下计数。计数原则是随机视野下共 计数100个白细胞，分别算出嗜中性粒细胞，单核细胞，血栓细胞及淋巴细胞百分比。
[0068] 1.2.2血清学分析
[0069] 1.2.2.1总蛋白测定（TP)
[0070]总蛋白测定主要采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝G-250试剂配方如下表。
[0071] 表1:考马斯亮蓝G-250试剂配方表
[0073] 标准曲线主要采用牛血清蛋白（BSA，0. lmg/ml)制作，将BSA梯度稀释:200μg/ml， 100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12 · 5μg/ml。之后将考马斯亮蓝G-250溶液与血清混合后，于分 光光度计595nm处测定吸光值。
[0074] 1.2.2.2溶菌酶测定〇^丫）
[0075] 溶菌酶的测定使用鱼类血清溶菌酶测定试剂盒[Fish lysozyme(LYS)Elisa Kit (R&D SyStemS，USA)]，并参照说明书进行操作。标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标 准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品1〇〇μ1，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50μ1，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μΙ分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四 孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1弃掉，再各取50μ1 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第 五、第六孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μ1，混匀后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标 准品稀释液50μ1，混匀后从第九第十孔中各取50μ1弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μ1，浓 度分别为12以8/1，8以8/1，4以8/1，2以8/1，1以8/1)。加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品 及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀 释液40μ1，然后再加待测样品?ομL (样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底 部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37°c温育30分钟。配液:将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满 洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶:每孔加入酶标试剂50μ1，空白孔除外。 温育:操作同3。洗涤:操作同5。显色:每孔先加入显色剂Α50μ1，再加入显色剂Β50μ1，轻轻震 荡混匀，37°C避光显色15分钟.终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转黄色）。测 定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值）。测定应在加终止液后15分钟 以内进行。
[0076] 1.2.2.3过氧化物酶测定(P0D)
[0077] 过氧化物酶的测定主要使用鱼类血清过氧化物酶测定试剂盒[Fish Peroxidase (POD)ELISAKit(R&D Systems，USA)]。标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品1〇〇μ1，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ1，混 匀;然后从第一孔、第二孔中各取?〇〇μ1分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加 标准品稀释液50μ1，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1弃掉，再各取50μ1分别加到 第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六 孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混 匀后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释 液50μ1，混匀后从第九第十孔中各取50μ1弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μ1，浓度分别为 30U/L，20U/L，10U/L，5U/L，2.5U/L)。加样:分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试 剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μ1， 然后再加待测样品1〇μ1(样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触 及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37°C温育30分钟。配液:将30(48Τ的20倍） 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 (48Τ的20倍)倍稀释后备用。洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩 干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶:每孔加入酶标试剂50μ1， 空白孔除外。温育：操作同3。洗涤:操作同5。显色:每孔先加入显色剂Α50μ1，再加入显色剂 Β50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟.终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色 立转黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值）。测定应在加终 止液后15分钟以内进行。
[0078] 1.2.2.4免疫球蛋白_则定（181〇
[0079] 免疫球蛋白Μ的测定主要采用鱼类血清免疫球蛋白Μ测定试剂盒[Fish Immunoglobulin M(IgM)ELISAKit(R&D Systems，USA)]。标准品的稀释与加样:在酶标包被 板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品?οομL，然后在第一、第二孔中加标准 品稀释液50μ1，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μΙ分别加到第三孔和第四孔，再在第 三、第四孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1弃掉，再 各取50μ1分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混 匀后从第五、第六孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准 品稀释液50μ1，混匀后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔 分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第九第十孔中各取50μ1弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μ1，浓度分别为12μg/ml，8μg/ml，4μg/ml，2μg/ml，lμg/ml)。加样：分别设空白孔（空白对 照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔 中先加样品稀释液40μ1，然后再加待测样品10μ1(样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于 酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37 °C温育30分钟。 配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。洗涤:小心揭 掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶:每 孔加入酶标试剂50μ1，空白孔除外。温育:操作同3。洗涤:操作同5。显色:每孔先加入显色剂 Α50μ1，再加入显色剂Β50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避光显色15分钟.终止:每孔加终止液50μ 1，终止反应(此时蓝色立转黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度 (0D值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
[0080] 1.2.2.5总补体测定以〇150)
[00811 鱼类总补体的测定主要使用鱼类血清总补体测定试剂盒[Fish ACH50ELISAKU (R&D Systems，USA)]。标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第 二孔中分别加标准品1〇〇μ1，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ1，混匀;然后从第一 孔、第二孔中各取1〇〇μ1分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μ1，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1弃掉，再各取50μ1分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μ1 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混匀后从第七、第 八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μ1，混匀后 从第九第十孔中各取50μ1弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μ1，浓度分别为360U/ml，240U/ ml，120U/ml，60U/ml，30U/ml)。加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余 各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μ1，然后再 加待测样品1〇μ1(样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔 壁，轻轻晃动混匀。温育：用封板膜封板后置37 °C温育30分钟。配液:将30 (48Τ的20倍)倍浓 缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。洗涤:小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干， 每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。加酶:每孔加入酶标试剂50μ1，空白 孔除外。温育：操作同3。洗涤:操作同5。显色:每孔先加入显色剂Α50μ1，再加入显色剂Β50μ 1，轻轻震荡混匀，37 °C避光显色15分钟.终止:每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色立转 黄色）。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值）。测定应在加终止液 后15分钟以内进行。
[0082] 2结果
[0083]试验过程中统计对照组及注射组草鱼存活率、血液学指标及血清学指标。
[0084] 2.1存活率
[0085] 实验结果如图1所示，对照组草鱼无死亡，注射组草鱼从第一天开始出现死亡，第 21天存活率为40%。
[0086] 2.2血液学指标
[0087] 实验结果如图2所示，血液学指标测定结果:红细胞计数值(A);白细胞计数值(B); 红细胞比容(C);平均红细胞容积(D);单核细胞(E);嗜中性粒细胞(F);血栓细胞(G);淋巴 细胞(H)。*表明差异显著(0.01〈?〈0.05)，**表明差异极显著(？〈0.01)。
[0088] 2.3血清学指标
[0089] 实验结果如图3所示，血清学指标测定结果:总蛋白（A);溶菌酶活力(B);过氧化物 酶活力(C);免疫球蛋白Μ水平(D);总补体水平(E)。*表明差异显著(0.01〈?〈0.05)，**表明 差异极显著(P〈〇.〇l)。
[0090] 3 讨论
[0091 ]本发明的感染细菌性败血症草鱼疾病模型分别从患病及对照组草鱼存活率、血液 学分析及血清学分析的角度测定了不同的免疫指标。血液学分析包括：红细胞计数值 (RBC)、白细胞计数值(WBC)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、嗜中性粒细胞百分 比、单核细胞百分比、血栓细胞百分比和淋巴细胞百分比；血清学分析包括:血清总蛋白测 定(ΤΡ)、溶菌酶活性测定(LSY)、过氧化物酶活性测定(P0D)、免疫球蛋白Μ水平测定（IgM)和 总补体水平测定(ACH50)。从图中的结果可以看出：注射组草鱼第7、14、21天血液白细胞计 数显著大于对照组;注射组草鱼第1、7天单核细胞百分比显著大于对照组;注射组草鱼第1 天嗜中性粒细胞百分比显著大于对照组;注射组草鱼第14天血栓细胞百分比显著大于对照 组，注射组草鱼第21天血栓细胞百分比显著小于对照组;注射组草鱼第14天淋巴细胞百分 比显著小于对照组，注射组草鱼第21天淋巴细胞百分比显著大于对照组;注射组草鱼第1、3 天血清总蛋白含量显著高于对照组;注射组草鱼第3天血清溶菌酶活力显著高于对照组，注 射组草鱼第7天血清溶菌酶活力显著低于对照组;注射组草鱼第1天血清过氧化物酶活力显 著低于对照组;注射组草鱼第7天免疫球蛋白Μ水平显著高于对照组;注射组草鱼第21天总 补体水平显著高于对照组。
[0092] 以上免疫指标测定结果可以为患有细菌性败血症草鱼提供参考。在不同的免疫时 间，草鱼体内免疫应答强弱也不同，养殖生产上的给药剂量也应做相应调整。因此，在整个 草鱼及鱼类养殖业上，该疾病模型不仅可以为鱼类免疫学研究提供科研指导，并且可以揭 示养殖生产上鱼类发病程度及给药剂量，该疾病模型的构建为水产养殖业科学，健康的发 展奠定了一定的基础。
[0093] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下 步骤： a) 选取体重为45-55g的草鱼，平均分为对照组及注射组，注射组草鱼注射浓度为IX IO7C化/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水； b) 两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析； C)观察指标，取两组草鱼血液进行如下检测： 1) 红细胞计数(RBC); 2) 白细胞计数(WBC); 3) 红细胞比容测定化CT); 4) 平均红细胞容积测定(MCV); 5) 白细胞分类计数； 6) 总蛋白测定(TP); 7) 溶菌酶测定化SY); 8) 过氧化物酶测定(POD); 9) 免疫球蛋白M测定（IgM); 10) 总补体测定(AC册0)。2. 根据权利要求1所述感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于:所述 检测的方法如下： 1) 红细胞计数(RBC)，取新鲜血液20ul，加入到4ml化tt-胎rricks缓冲液中，轻摇混匀 后静置2-3分钟，之后取IOul血液稀释液充入细胞计数板中，显微镜放大20倍计数，记数区 位于细胞计数板中央大方格的四角及中间的五个中方格； 2) 白细胞计数(WBC)，步骤同红细胞计数，白细胞记数区位于细胞计数板四角四个大方 格内； 3) 红细胞比容测定化CT)，将新鲜血液充入溫氏管中，离屯、机10000 Xg，5分钟，离屯、后 静置10-20分钟，记下溫氏管读数，乘WO. 1即为红细胞比容值； 4) 平均红细胞容积测定(MCV)，采用如下公式换算：5) 白细胞分类计数，用胶头洞菅洞一洞新鲜皿徽十载坂斤上，用另一片载玻片将其推 平，等血膜风干，之后用瑞氏染液染色，水洗风干后，放置在100倍显微镜下计数;计数原则 是随机视野下共计数100个白细胞，分别算出嗜中性粒细胞，单核细胞，血栓细胞及淋己细 胞百分比； 6) 总蛋白测定(TP)，采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝G-250试剂配方如下表，7) 溶菌酶测定化SY)，溶菌酶的测定使用鱼类血清溶菌酶测定试剂盒测定； 8) 过氧化物酶测定(POD)，过氧化物酶的测定使用鱼类血清过氧化物酶测定试剂盒测 定； 9) 免疫球蛋白M测定（IgM),免疫球蛋白M的测定采用鱼类血清免疫球蛋白M测定试剂盒 测定； 10) 总补体测定(AC册0)，总补体的测定使用鱼类血清总补体测定试剂盒测定。3.根据权利要求1所述感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于:所述 观察指标如下： 1) 注射后第7、14、21天白细胞计数； 2) 注射后第1、7天单核细胞百分比； 3) 注射后第1天嗜中性粒细胞百分比； 4) 注射后第14天血栓细胞百分比； 5) 注射后第14天淋己细胞百分比； 6) 注射后第1、3天血清总蛋白含量； 7) 注射后第3天血清溶菌酶活力； 8) 注射后第1天血清过氧化物酶活力； 9) 注射后第7天免疫球蛋白M水平。
【文档编号】A61K49/00GK105902575SQ201610223373
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】李家乐, 李立森, 黄文吉, 党云飞, 徐晓雁, 沈玉帮, 方圆
【申请人】上海海洋大学