葡萄渣提取物在制备减轻急性肺损伤药物中的应用
【专利摘要】本发明涉及葡萄渣提取物在制备减轻急性肺损伤药物中的应用。本发明采用水提法以酿酒后的葡萄渣为原料制备葡萄渣提取物(GPEs)，通过测定GPEs的有效成份，评价其体外和体内的抑制肺损伤的活性，为葡萄渣的回收利用、新型功能性食品的开发提供有价值的参考。
【专利说明】
葡萄渣提取物在制备减轻急性肺损伤药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及制药领域，具体地说，涉及一种葡萄渣提取物在制备减轻急性肺损伤 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 我国是葡萄生产大国，年种植葡萄数百万亩，其中40%以上用于酿酒，由酿造葡萄 酒而产生的葡萄渣资源极其丰富，酿酒后的葡萄渣中含有大量的单体多酚和聚合多酚类物 质，包括原花青素、黄酮类化合物等，目前葡萄渣的利用率普遍较低，绝大多数都被作为废 渣排放，不仅造成环境污染，也是对原料的极大浪费，葡萄渣综合利用已成为葡萄酒加工产 业增值的新方向。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供从酿酒后的葡萄渣中获得的葡萄渣提取物（grape pomace extractions，GPEs)及其制备方法。
[0004] 本发明的另一目的是提供所述葡萄渣提取物在制备用于减轻急性肺损伤的药物 及功能性食品开发中的应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的葡萄渣提取物，所述葡萄渣提取物是采用水 提法以酿酒后的葡萄渣为原料制备得到的；所述提取物的有效成分为如下分子式的化合 物：Cl3Hl6〇lQ、Cl3Hl2〇9、C45H38〇18、Cl3Hl2〇8、C3〇H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C3〇H26〇12、 C3〇H26〇12、C45H38O18、Cl5Hl4〇6、C2lH22〇ll、C45H38O18、C2lHl8〇13和C2lH2Q〇12，上述有效成分占提取物 总重量的2-7 %。
[0006] 本发明中使用的葡萄渣原料来自酿制红酒的葡萄品种，包括Cabernet Franc(品 丽珠 ）、Cabernet Sauvignon(赤霞珠）、Carignan(佳丽酿）、Pinot Noir(黑皮诺又叫黑品 乐）、Merlot(梅洛又叫美乐、美露辄）、Cabernet Gernischt(蛇龙珠)等。
[0007] 本发明还提供所述葡萄渣提取物的制备方法，收集酿酒后的葡萄渣，风干后研磨 成粉，向lg粉末中加 l〇_15ml水，摇床300-800转/分钟过夜提取，2000-5000转/分钟离心10-30分钟，去上清冷冻干燥。
[0008] 优选地，所述葡萄渣提取物的制备方法如下：收集酿酒后的葡萄渣，风干后研磨成 粉，向lg粉末中加 l〇ml水，摇床500转/分钟过夜提取，4000转/分钟离心20分钟，去上清冷冻 干燥。
[0009] 本发明更优选以葡萄品种'品丽珠 (Cabernet Franc)'为原料，收集酿酒后的葡萄 渣，自然风干至含水量约9.8%，研磨成粉，向lg粉末中加10ml水，摇床500转/分钟过夜提 取，4000转/分钟离心20分钟，去上清冷冻干燥。
[0010] 本发明使用的葡萄渣原料是经过葡萄酒酿造工艺获得的，葡萄酒酿造工艺参见国 际葡萄与葡萄酒局颁布的0IV国际标准工艺。
[0011] 本发明还提供所述葡萄渣提取物在制备用于减轻因感染、休克、吸烟、创伤、毒物 中毒、吸入刺激性气体、辐射、高氧或低氧等引起的肺损伤，特别是急性肺损伤的药物或功 能性食品中的应用。
[0012] 所述感染包括流感病毒感染，优选H1N1、H5N1、H3N2亚型流感病毒感染，更优选 H1N1及其适应株，例如WSN。
[0013] 所述刺激性气体选自光气、双光气、三光气、氯气、氮氧化物、甲醛、硫酸二甲酯、氯 化氢、溴化氢、氟化氢、氨、臭氧、二氧化硫等。
[0014] 本发明还提供一种用于治疗肺损伤的药物，其有效成分为所述的葡萄渣提取物。
[0015] 所述药物还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
[0016] 所述葡萄渣提取物还可与其它活性剂组合，所述活性剂包括但不限于利尿剂、β-阻断剂、ACE抑制剂、血管紧张素拮抗剂、妈通道阻断剂、α-阻断剂、α-β-阻断剂、神经系统抑 制剂、血管扩张剂、抗氧化剂等。
[0017] 所述药物为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、泡腾片或注射剂等 剂型。
[0018]所述药物的单次剂量单元为葡萄渣提取物10-60mg/Kg体重，优选40g/Kg体重。
[0019] 优选地，所述药物是将葡萄渣提取物溶解于水或生理盐水中制成的溶液剂;或者， 将葡萄渣提取物溶解于食用油(例如玉米油）中制成的乳剂。
[0020] 本发明还提供一种功能性食品，其有效成分为所述的葡萄渣提取物。
[0021] 本发明进一步提供所述葡萄渣提取物在治疗急性肺损伤中的应用。
[0022] 本发明通过测定葡萄渣提取物(GPEs)的有效成份，评价其体外和体内的抑制肺损 伤的活性，为葡萄渣的回收利用、新型功能性食品的开发提供有价值的参考。
[0023] 本发明首次揭示了葡萄渣提取物对流感病毒感染后小鼠肺组织的保护作用，该机 制的发现具有较强的临床意义，可以为流感的预防措施和治疗方法优化提供坚实的基础。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例2中实验组及对照组小鼠感染甲型流感病毒WSN株后体重(A)、 体温(B)、存活率(C)的变化情况。
[0025] 图2为本发明实施例2中实验组及对照组小鼠肺泡灌注液中总细胞数量(A)以及中 性粒细胞数量(B)、巨噬细胞数量(C)变化图。
[0026] 图3为本发明实施例2中感染病毒WSN 9天后肺泡巨噬细胞中Ml(iNos和IL-6基因， 对应A和B)和M2 (Chi 13和MGL2基因，对应C和D)相关基因的表达情况。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0028]实施例1葡萄渣提取物的制备
[0029]以葡萄品种'品丽珠 (Cabernet Franc)'为原料，收集酿酒后的葡萄渣，自然风干 至含水量约9.8 %，研磨成粉，向lg粉末中加10ml水，摇床500转/分钟过夜提取，4000转/分 钟离心20分钟，去上清冷冻干燥，即得葡萄渣提取物(GPEs)。测定GPEs中所含的有效成份， 方法如下：
[0030] 1、标准和化学品
[0031] ( + )_儿茶素、表儿茶素（_)，原花青素和原花青素 B2、B1，购自Chr〇maDex，Inc· (Irvine，加州，美国）。甲酸和高效液相色谱级甲醇和乙腈购自VWR国际有限公司。使用 Milli-Q系统(Millipore实验室，马里兰，美国）制备HPLC级水。
[0032] 2、样品制备
[0033]葡萄渣提取物冻干粉250毫克溶解在5毫升水中，超声抽提15分钟。上清液经孔径 为0.45μπι的PVDF注射过滤器(VWR国际有限公司，华盛顿，美国）过滤处理。5μ1样品溶液进行 uhplc-pda-esi/HRMS MSN反相高效液相色谱法定量分析。原花青素含量的测定重复三次。 [0034] UHPLC-PDA-ESI/HRMSn分析系统中使用LTQ Orbitrap XL质谱仪的Accela 1250二 元栗，一个PAL HTC Accela ΤΜ0自动进样器，光电二极管阵列（PDA)探测器（Thermo Scientific，加州，美国）及一个G1316A柱室(安捷伦，加州，美国）。在超高效液相色谱柱上 进行（10〇111111\内径2.1111111，'?^^6^八0〇1]几￥8^1(：18，1.74111)分离（高效液相色谱/1^^(：柱 器，Ultrashield分析科学仪器，加州，美国），流速0.25毫升/分钟(液相结合物，A为0.1%甲 酸水，v/v，B为0.1 %甲酸乙腈，v/v)。梯度洗脱，保持3分钟，A从2%到20 % (v/v)取10分钟， 4015分钟，5030分钟，9040分钟，9045分钟。
[0035] MS是在负离子模式下操作:70鞘气(任意单位），AUX扫气15(任意单位），电源电压 4.5V，毛细管温度200°C，毛细管电压14V、50V，管镜扫描范围从100到2000m/z具有15000位 的分辨率，FTMSAGC目标2e5，高分辨质谱AGC目标1E5，500毫秒最大离子注入时间。
[0036] 3、原花青素含量的测定
[0037] 使用Agilent Zorbax SB-C18柱高效液相色谱Agilent 1100系列系统量化的原花 青素含量（150mmX 2 · lmm，3 · 5μπι)。流动相含有水和乙腈(B)。以0 · 3ml/min的流量，于30°C进 行梯度洗脱程序：线性梯度从4%B 50min到20%B 60min再到35%B 60min，100%B 61分 钟，并在100 65分钟，最终系统平衡的初始条件（4%B) 10分钟由安捷伦DAD检测器在 278nm检测原花青素，然后通过LCQ Deca XP和质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司，马 里兰，美国），配有电喷雾电离源。MS参数如下：电源电压4.5kV;毛细管电压40V;管镜头偏移 5V;毛细管温度250°C;鞘气流量，80(任意单位）；辅助气流量，15(任意单位）。该仪器操作的 负离子模式，扫描从m/100~m/2000。
[0038]采用外标法测量原花青素的含量。进行了六个浓度的儿茶素分析，并根据儿茶素 的峰面积与浓度绘制曲线。表儿茶素、原花青素二聚、原花青素三聚体的量由儿茶素浓度乘 以相应的摩尔相对响应因子计算出(MMI)。原花青素含量单位:微摩尔/克冻干粉。
[0039]经过上述分析，从葡萄渣提取物（GPEs)中确定了十六种化合物（表1)。化合物 Cl3Hl6〇lQ、Cl3Hl2〇9、C45H38〇18、Cl3Hl2〇8、C3()H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C3()H26〇12、 C30H26Ol2、C45H38Ol8、Cl5Hl4O6、C2lH22Oll、C45H 38Ol8、C2lHl8Ol3和C2lH20Ol2占 GPEs总重量的2-7%。其 中原花青素单体(儿茶素和表儿茶素)的含量最高(表2)。
[0040]表1GPES中各成份的特性、保留时间、分子式、计算值与实测值之间的误差、化合物 MSN诊断片段
[0045]
[0046] 注:含量为每克冻干粉中所含μπιο?数，平均值土SD(n = 3) ;MW代表分子量;MRRF代 表摩尔相对响应因子。
[0047] 实施例2减轻流感病毒感染引起机体损伤的药物、其制备及应用
[0048] 本实施例中提供的用于减轻流感病毒感染引起机体损伤的药物为乳剂，是将实施 例1制备的葡萄渣提取物加入无菌生理盐水中，搅拌1 〇分钟左右，待完全溶解，即得。
[0049] 将2-3月龄、体重约25g的雄性C57BL/6鼠随机分成对照组、实验组1-3，每组10只。 每天灌胃给药，共60天。
[0050] 1、小鼠感染流感病毒：乙醚轻度麻醉后，对照组及三个实验组小鼠滴鼻接种流感 病毒H1N1小鼠适应株WSN病毒液50μ1 (3000pfu)。对照组小鼠接种病毒后，小鼠灌胃生理盐 水O.lmL，三个实验组小鼠接种病毒后，实验组1小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理盐水O.lmL (按葡萄渣提取物20g/kg体重给药），实验组2小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理盐水O.lmL (按葡萄渣提取物40g/kg体重给药），实验组3小鼠灌胃含葡萄渣提取物的生理盐水O.lmL (按葡萄渣提取物60g/kg体重给药）。然后每天记录小鼠体温体重情况，以检测小鼠染病率 及致死率。
[0051] 各实验组小鼠感染流感病毒WSN后体重、体温、存活率的变化情况如图1所示。从图 1可以看出，按葡萄渣提取物20g/kg体重、40g/kg体重和60/kg体重给药能够抑制病毒的感 染，减轻流感引起的体温（图1A)、体重的下降（图1B)，从而能够提高小鼠的存活率（图1C)， 且按葡萄渣提取物40g/kg体重给药的实验组2效果比实验组1和实验组3效果更好。
[0052]图2为各实验组小鼠肺泡灌注液中总细胞数(包括中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细 胞)变化图。
[0053] 2、分离感染WSN病毒9天后的小鼠肺泡巨噬细胞，检测促炎相关的Ml巨噬细胞的生 物标记物（iNos和IL-6基因）和抑制炎症相关的M2巨噬细胞的生物标记物(Chil3和MGL2基 因）。结果如图3所示，细胞水平实验表明，葡萄渣处理可抑制肺泡巨噬细胞中Ml巨噬细胞的 生物标记物表达，而促进M2巨噬细胞的生物标记物表达。
[0054]组织和细胞水平的实验结果均表明，本发明制备的含葡萄渣提取物的乳剂能够通 过抑制肺部的炎症反应，从而有效地降低小鼠病毒的感染，能够抑制小鼠感染后的发病率， 提高小鼠的存活率。
[0055] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0056] 参考文献
[0057] 1 . L i n , L . Z . &Harn 1 y , J . Μ . ( 2 0 1 2 ) . Quan t i ta t i on of flavanols, proanthocyanidins,isoflavones,flavananes,dihydroxychaleones ,stilbens and benzoic acid derivatives using UV absorbance after identification by LC_ MS.Journal of Agricultural and Food Chemistry,60,5832-5840.
【主权项】
1. 葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物是采用水提法以酿酒后的葡萄渣为 原料制备得到的； 所述提取物的有效成分为如下分子式的化合物:Cl3Hl6〇lQ、C13H12O9、C45H38O18、Cl3Hl2〇8、 C30H26〇12、Cl5Hl4〇6、C45H38〇18、C45H38〇18、C30H26〇12、C3()H26〇12、C45H38〇18、Cl5Hl4〇6、C2lH22〇ll、 C45H38〇18、C21H18OdPC 21H2QO12，上述有效成分占提取物总重量的2-7 %。2. 根据权利要求1所述的葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物的制备方法如 下:收集酿酒后的葡萄渣，风干后研磨成粉，向Ig粉末中加 l〇_15ml水，摇床300-800转/分钟 过夜提取，4000转/分钟离心20分钟，去上清冷冻干燥。3. 根据权利要求2所述的葡萄渣提取物，其特征在于，所述葡萄渣提取物的制备方法如 下:收集酿酒后的葡萄渣，风干后研磨成粉，向Ig粉末中加 IOml水，摇床500转/分钟过夜提 取，4000转/分钟离心20分钟，去上清冷冻干燥。4. 根据权利要求1-3任一项所述的葡萄渣提取物，所述葡萄渣原料来自酿制红酒的葡 萄品种，包括Cabernet Franc、Cabernet Sauvignon、Carignan、Pinot Noir、Merlot、 Cabernet Gernischt，其中优选Cabernet Franc。5. 权利要求1-4任一项所述葡萄渣提取物在制备用于减轻因感染、休克、吸烟、创伤、毒 物中毒、吸入刺激性气体、辐射、高氧或低氧引起的肺损伤的药物或功能性食品中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述感染包括流感病毒感染，优选HlNl、 H5N1、H3N2亚型流感病毒感染，更优选HlNl;所述刺激性气体选自光气、双光气、三光气、氯 气、氮氧化物、甲醛、硫酸二甲酯、氯化氢、溴化氢、氟化氢、氨、臭氧、二氧化硫。7. -种用于治疗肺损伤的药物，其特征在于，其有效成分为权利要求1-4任一项所述葡 萄渣提取物。8. 根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料或辅 助性成分;所述药物为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、乳剂、泡腾片或注 射剂;所述药物的单次剂量单元为葡萄渣提取物10-60g/Kg体重，优选40g/Kg体重。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，其是将葡萄渣提取物溶解于水或生理盐水 中制成的溶液剂。10. -种功能性食品，其特征在于，其有效成分为权利要求1-4任一项所述葡萄渣提取 物。
【文档编号】A61K31/353GK105902698SQ201610224976
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】李向东, 王娜
【申请人】中国农业大学