一种靶向药物载体及其制法与应用
【专利摘要】本发明提供了一种靶向药物载体及其制备方法与应用，该靶向药物载体是通过将原发肿瘤细胞在体外培养并破碎后，取同源肿瘤细胞膜，将其包被于纳米粒子表面获得。本发明还提供了该靶向药物载体的制药用途，将本发明的靶向药物载体通过静电吸附或者共价偶联方法负载DNA、RNA、多肽等药物分子，制备获得的靶向药物制剂能够高度特异性的攻击母体病人身体内的癌细胞，而对正常细胞没有杀伤作用，是一种高效的靶向肿瘤药物。本发明的靶向药物载体通过同源肿瘤细胞膜识别病人肿瘤细胞表面靶标分子，达到纳米粒子特异性结合肿瘤细胞、靶向药物传输至肿瘤细胞的功能，在肿瘤早期诊断、生物医学成像、以及靶向药物治疗方面具有广阔应用前景。
【专利说明】
一种靶向药物载体及其制法与应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种基于同源肿瘤细胞膜靶向识别肿瘤细胞的纳米药物载体材料及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。随着细胞生物学的发展以及对癌症发病机制的了解，癌症的药物治疗得到了很好的发展。目前大约有多种化学药物及抗体药物发展用于杀死肿瘤细胞和癌症治疗。但是这些药物缺乏靶向特异性，在临床上通常给患者带来致命的副作用。同时，抗体药物在体外抗肿瘤实验中都取得了比较好的结果，但是一旦应用于体内，就会被人体内的免疫系统所清除;而体外对药物进行修饰后，虽然可以部分逃避人体免疫系统的清除，但是又改变了作用机理。因此需要发展既能靶向携带药物攻击肿瘤细胞，又能逃避人体免疫系统的靶向载体。
[0003]同时，由于肿瘤的异质性，同一种癌症病人的癌细胞存在差异。例如，同样是肺癌患者，对病人A有效的药物，对病人B可能就没有作用。要能够对不同的癌症病人进行个体化的治疗，需要筛选单个病人的癌细胞靶标，这是极其昂贵且耗时的工作，没有商业化价值。现有的靶向肿瘤药物一般通过特异性抗体进行肿瘤细胞的识别，特异性抗体存在几个问题:第一，目前有些肿瘤还没有找到特异性抗体，无法通过特异性抗体进行靶向识别;第二，由于肿瘤的异质性，特异性抗体无法识别某些肿瘤亚型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种靶向识别肿瘤细胞的同源细胞膜药物载体。
[0005]本发明提供的一种靶向药物载体，其为纳米粒子表面包被同源肿瘤细胞膜得到的纳米颗粒。
[0006]所述纳米粒子为下列之一:量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸、脂质体或明胶。
[0007]所述纳米粒子粒径为5-100nm。
[0008]所述同源肿瘤细胞膜为原发肿瘤细胞传代培养得到的肿瘤细胞的细胞膜。
[0009]本发明提供了上述靶向药物载体在制备靶向药物中的应用。
[0010]优选地，所述靶向药物载体通过静电吸附或者共价偶联方法负载药物分子，制备靶向药物。靶向药物结构示意图见图1。
[0011 ] 优选的，所述药物分子为DNA、siRNA、mRNA、多肽分子或抗体。
[0012]本发明提供了上述靶向药物载体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。
[0013]本发明提供了上述靶向药物载体在生物医学成像中的应用。
[0014]本发明还提供了上述靶向药物载体的制备方法，包括以下步骤:
[0015](I)将原发肿瘤细胞体外培养获得同源肿瘤细胞；
[0016](2)将同源肿瘤细胞离心、清洗、裂解、去除杂质得到同源肿瘤细胞膜囊泡；
[0017](3)在纳米颗粒表面包被同源肿瘤细胞膜囊泡即得。
[0018]上述方法中，步骤(I)的同源肿瘤细胞是通过收集癌症患者手术切除的癌组织样品获得，具体为，清洗组织样品，然后去除组织样品中残留的脂肪;将组织样品用消化液消化;消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%胰酶-EDTA中消化;加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，离心去上清;加入温水浴的分散酶和DNaseI，用枪头反复吹打样品；再加入含10 %胎牛血清的DMEM培养基，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清;重悬细胞沉淀于培养基中，接种于培养瓶培养，得到人同源肿瘤细胞。
[0019]上述方法中，步骤(2)是将同源肿瘤细胞离心、清洗、裂解、去除杂质得到同源肿瘤细胞膜囊泡，具体地，将培养的同源肿瘤细胞离心(100G-2000G)，在培养瓶中完全贴壁，然后清洗;将同源肿瘤细胞在低渗裂解液中裂解，离心(2000G-5000G)分离去除杂质，留下纯化后的细胞膜；用压力(0.01MP-10MP)多次将纯化后的同源肿瘤细胞膜挤过纳米孔滤膜(50nm-5000nm)获得同源肿瘤细胞膜囊泡。
[0020]其中，上述将同源肿瘤细胞在低渗裂解液中裂解，进行离心时，整个溶液离心(2000G-5000G) 15_25次，每次3_8分钟。优选地，3200g离心20次，每次5分钟。
[0021]在本发明的实施例中，采用的纳米孔滤膜品牌为AvantiPolar Lipids。
[0022]上述方法中，步骤(3)是将纳米颗粒和制备的同源肿瘤细胞膜囊泡混合，用压力多次将混合物挤过纳米孔滤膜，对混合物离心以除去过量的同源肿瘤细胞膜，获得同源肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒。
[0023]步骤(3)中，纳米颗粒和制备的同源肿瘤细胞膜囊泡按照质量比1:100-100:1混合。混合物离心条件为500G-50000G。
[0024]步骤(3)所述压力为0.01MP-10MP，纳米膜孔径为50-5000nm。
[0025]优选地，纳米膜孔径为20-2000nm。
[0026]同源肿瘤细胞是肿瘤病人原发位点癌细胞系，其从肿瘤病人的病灶部位取一小部分肿瘤细胞，进行体外培养获得。由于癌细胞的特性，癌细胞膜上面存在靶标分子，使得癌细胞相互之间能够互相识别。这样就不需要进行癌细胞靶标的筛选，癌症病人自身的癌细胞膜就是最好的靶标。将所述体外培养的癌细胞破膜，获取同源肿瘤细胞膜，然后将同源肿瘤细胞膜包裹在纳米材料上。这种同源肿瘤细胞膜包裹的纳米材料有非常高的特异性。能高度特异性的识别母体病人的癌细胞。将所述的同源肿瘤细胞膜作为载体材料，通过静电吸附或者共价偶联方法负载药物分子，制备获得的靶向药物制剂，能够高度特异性的攻击母体病人身体内的癌细胞，而对正常细胞没有杀伤作用，是一种高效的靶向肿瘤药物。
[0027]本发明通过同源肿瘤细胞膜识别病人肿瘤细胞表面靶标分子，达到纳米粒子特异性结合肿瘤细胞、靶向药物传输至肿瘤细胞的功能，在肿瘤早期诊断、生物医学成像、以及靶向药物治疗方面具有广阔应用前景。生物利用度实验显示没有明显的药理毒性、同时小鼠成像实验证实其具有特别优异的靶向性能。
【附图说明】
[0028]图1为肿瘤靶向药物结构示意图，图中a为肿瘤细胞靶向分子;b为同源肿瘤细胞膜;c为纳米粒子;d为偶联的药物分子。
[0029]图2为肿瘤靶向药物载体材料制备方法流程图。
[0030]图3为肿瘤靶向药物载体材料透射电镜图片。其中a为未包裹同源肿瘤细胞膜的纳米粒子;b为包裹了同源肿瘤细胞膜的靶向药物载体。
[0031]图4为肿瘤靶向药物载体材料生物利用度数据图。注射30天后，所有的小白鼠会被实施安乐死，它们的血液和主要器官会被收集起来，用于进行血液生化及血液检查，和组织病理学分析。结果发现，的血液系数、血液生化显性(丙谷转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，碱性磷酸酶ALP，血浆尿素氮BUN，肌氨酸酐CRE)等方面无明显区别。
[0032]图5为苏木精-伊红染色的组织病理学切片图对比组和用药组的心，肝，脾，肺，肾组织病理切片图，图片显示用药组小组的组织未发现明显的组织损伤。
[0033]图6为肿瘤靶向药物载体材料靶向特异性的小鼠实验显示图。其中a图为患肿瘤的小鼠，圆圈处为肿瘤部位，b图为注射实施例1制得的靶向载体MDA-UCNPs后，圆圈处显示药物在肿瘤部位富集。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶购自Thermo-Fisher(美国)。(EDTA)，多聚甲醛(PFA)，4’，6_二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，细胞计数试剂盒_8(CCK8)和乙酸双氧铀购自Sigma-Aldrich公司(美国)Jris-HCl (pH值=7.5)和无EDTA迷你蛋白酶抑制剂片剂从Mediatech公司(美国)和Roche获得(瑞士)。磷脂购自Avanti (美国)。在这项工作中所使用的其它试剂购自拉丁试剂(中国)。
[0035]实施例1肺癌病人的同源肿瘤细胞膜载体的制备与效果
[0036]1、肺癌病人同源肿瘤细胞膜载体的制备
[0037]如图2所示，同源肿瘤细胞膜载体的制备包括3个步骤:
[0038](I)将原发肿瘤细胞体外培养获得同源肿瘤细胞；
[0039](2)将同源肿瘤细胞破碎得到同源肿瘤细胞膜囊泡；
[0040](3)在纳米颗粒表面包被同源肿瘤细胞膜囊泡即得同源肿瘤细胞膜载体。
[0041 ]步骤(I)具体为:
[0042]I)收集癌症患者手术切除的癌组织样品；
[0043]2)清洗组织样品，然后去除组织样品中残留的脂肪；
[0044]3)将组织样品用消化液消化；
[0045]4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%胰酶-EDTA中消化；
[0046]5)加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，离心去上清；
[0047]6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；
[0048]7)再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；
[0049]8)重悬细胞沉淀于培养基中，接种于培养瓶培养，得到人同源肿瘤细胞。
[0050]步骤(2)具体步骤为:
[0051 ] I)将同源肿瘤细胞通过在800g离心5分钟，在T-175培养瓶中完全贴壁，然后用含2mM EDTA的PBS缓冲液清洗3次。
[0052]2)将细胞悬浮在低渗裂解缓冲液(20mM的Tris-HCl，1mM氯化钾，2mM的MgC12和ImM无EDTA迷你蛋白酶抑制剂)中并混合均匀。整个溶液进行20次离心(3200g，每次5分钟)，离心参数根据细胞膜的密度来选择，以获得最优的分离效率。将离心后上清液保存，将沉淀物重新悬浮在低渗裂解缓冲液，并进行另外20次离心。和保存的上清液混匀，并离心(20000g 30分钟)，之后，弃去沉淀，上清液用超高速离心机(LE-80K，贝克曼库尔特，USA)，再离心(80000g 1.5小时)。然后用10毫摩尔Tris-HCl和ImM EDTA中洗涤沉淀的细胞膜。将最终的沉淀物收集作为纯化后的同源肿瘤细胞膜。
[0053]3)将纯化癌症细胞膜挤入纳米孔滤膜(50nm-5000nm，AvantiPolar Lipids,USA)，重复物理挤压多次(压力0.01MP-10MP)，从而获得同源肿瘤细胞膜囊泡。
[0054]步骤(3)在纳米颗粒(UCNPs)表面包被同源肿瘤细胞膜囊泡
[0055]I)要在UCNPs上包裹癌细胞膜，先将I毫升的PBS(含50微克UCNPs)和制备的同源肿瘤细胞膜(50微克)混合。
[0056]2)随后将上述混合物通过20nm-2000nm的纳米孔挤出多次，压力0.01MP-10MP。
[0057]3)然后在100G-5000G下对混合物离心以除去过量的同源肿瘤细胞膜。最后，将得到的同源肿瘤细胞膜包裹颗粒(CC-UCNPs)放在PBS过夜。图3制备得到的同源肿瘤细胞膜包裹颗粒的透射电镜图片。
[0058]2、肺癌病人同源肿瘤细胞膜载体的安全性实验
[0059]如图4所示，为药物的生物利用度实验数据，血生化指标分析显示，实验中，实验室小白鼠(两只)的静脉被分别注射:I.200毫升的PBS; 2.MDA细胞膜(MDA细胞是肺癌细胞)包裹上转换荧光纳米材料(MDA-UCNPs)，即上面步骤I制备得到的同源肿瘤细胞膜包裹颗粒。(上述处理I是对照组，处理2是用药组)
[0060]对于体内毒性而言，体重波动是一个直接显征。在对用药组和对比组两组进行为期30天的观察后，既无死亡病例也无体重的明显变化，说明用药组和对比组对小白鼠没有副作用。值得注意的是，用药组(注射了MDA-UCNPs)后，不会让免疫力缺乏的实验室小白鼠患上肿瘤。注射30天后，所有的小白鼠会被实施安乐死，它们的血液和主要器官会被收集起来，用于进行血液生化及血液检查，和组织病理学分析。结果发现，用药组和对比组的血液系数、血液生化显性(如丙谷转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，碱性磷酸酶ALP，血浆尿素氮BUN，肌氨酸酐CRE)等方面无明显区别(图4的a，b，c图)。与此同时，在苏木精-伊红染色的切片(图5)中，未观察到明显的组织损伤等特征，上述所有结果都显示肿瘤细胞膜包裹的纳米材料没有明显的生物毒性。
[0061 ] 3、同源肿瘤细胞膜载体药物靶向特异性实验
[0062]如图6所示，为药物靶向特异性实验数据，为了证实所述纳米载体药物对肿瘤的靶向特异性，进行了小鼠体内上转换发光(UCL)成像实验，32只BALB/c裸鼠分别进行MDA-MB-435肿瘤异种移植，然后分为用药组和对比组接受静脉内注射:对比组注射200微升的PBS;用药组注射含有纳米颗粒(即，MDA细胞膜包裹发光纳米(UCNPs)颗粒:MDA-UCNPs)的PBS溶液(浓度为5mg/ml)。在注射后24小时，所有的小鼠通过腹膜内(IP)注射80微升1 %水合氯醛溶液麻醉，然后在小鼠UCL成像成像系统(Xenogen IVIS Spectrum，Caliper，美国)上拍照，成像系统配备荧光滤光片(激发/发射=53511111/98011111)，视场为12.5厘米，曝光时间为1秒。图6显示，药物主要在肿瘤附近高浓度富集，证实具有较好的肿瘤靶向性。小鼠实验证实，MDA-UCNPs纳米颗粒具有极好的肿瘤靶向特异性，其在裸鼠肿瘤部位富集，是非常好的肿瘤靶向药物载体。
【主权项】
1.一种靶向药物载体，其特征在于，其为纳米粒子表面包被同源肿瘤细胞膜得到的纳米颗粒。2.如权利要求1所述的靶向药物载体，其特征在于，所述纳米粒子为下列之一:量子点、磁性纳米粒子、金纳米粒子、聚乳酸乙醇酸、脂质体或明胶。3.如权利要求2所述的革E向药物载体，其特征在于，所述纳米粒子粒径为5-100nm。4.权利要求1-3任一所述的靶向药物载体在制备靶向药物中的应用。5.权利要求1-3任一所述的靶向药物载体在制备肿瘤诊断试剂盒中的应用。6.权利要求1-3任一所述的靶向药物载体在生物医学成像中的应用。7.权利要求1-3任一所述的靶向药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将原发肿瘤细胞体外培养获得同源肿瘤细胞； (2)将同源肿瘤细胞离心、清洗、裂解、去除杂质得到同源肿瘤细胞膜囊泡； (3)在纳米颗粒表面包被同源肿瘤细胞膜囊泡即得。8.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)是将纳米颗粒和制备的同源肿瘤细胞膜囊泡混合，用压力将混合物挤过纳米孔滤膜，再对混合物离心以除去过量的同源肿瘤细胞膜，获得同源肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒。9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，纳米颗粒和制备的同源肿瘤细胞膜囊泡按照质量比1:100-100:1混合。10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述压力为0.01MP-10MP，纳米膜孔径为50_5000nm。
【文档编号】A61K9/50GK105903037SQ201610338277
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】刘威
【申请人】刘威