包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物的制作方法

包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物的制作方法
【专利摘要】描述了肽类树状聚合物和试剂，其可用于使纤维蛋白原聚合并且可用作止血剂。所述肽类树状聚合物包含分支核心和多个与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽。所述分支核心包含：i)2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多官能团氨基酸残基单独共价连接；il)多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；Hi)多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；iv)多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团氨基酸残基的侧链共价连接；或y)单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的每个官能团单独共价连接。所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。
【专利说明】包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物
[0001] 本发明涉及包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物和试剂，包含所述肽类树状 聚合物或试剂的组合物，以及它们用于使纤维蛋白原聚合和用作止血剂的用途。
[0002] 由其可溶性前体纤维蛋白原形成不溶性纤维蛋白聚合物是血液凝结的最后阶段。 纤维蛋白原向纤维蛋白的转化分三步进行:纤维蛋白原受凝血酶限制性蛋白水解为纤维蛋 白单体;纤维蛋白单体组装成半交错、双链原纤丝;及经组装的纤维蛋白交联以加固凝块。
[0003] 纤维蛋白原分子由三对通过二硫键连接在一起的不同多肽链Αα、Ββ和γ组成。纤 维蛋白原链折叠成三个不同的结构区，两个远侧D区与一个中心Ε区连接。每个D区均含有分 别位于γ和邸链的C端的聚合'a'和'b'孔洞。凝血酶催化短肽，纤维蛋白肽A(FpA)和B(FpB) 从中心E区中纤维蛋白原的Αα和Ββ链的氨基端去除，分别暴露出两个聚合位点:具有氨基端 序列Gly-Pro-Arg-的"把手(knob)A" ；和具有氨基端序列Gly-His-Arg-的"把手Β"。一个纤 维蛋白单体新暴露的聚合把手通过'A-a'和'B-b'把手-孔洞相互作用与另一纤维蛋白单体 的相应孔洞相互作用，导致纤维蛋白单体组装成半交错、双链原纤丝。
[0004] 原纤丝侧向聚集以产生较粗纤维，其聚结形成纤维蛋白凝块的三维网络。FpA从纤 维蛋白原裂解比FpB更迅速。FpA的去除引发原纤丝的形成，而FpB的去除与其侧向聚集相吻 合。FpB释放，在反应开始时非常缓慢，在聚合物形成后加速。FpB裂解上的这种延迟对于正 常纤维蛋白组装而言是必需的，并且与不同类型的凝块的形成也有关。其中仅去除了FpA的 纤维蛋白I不太紧凑并且更易于被纤溶酶消化，而其中去除了FpA和FpB两者的纤维蛋白II 更紧凑并且对纤维蛋白溶解的抵抗力更强。
[0005] 用仅去除FpA或主要去除FpB的蛇毒酶进行的研究已经证明可通过'A-a'或'B-b' 相互作用形成纤维蛋白凝块，表明两种相互作用均可介导原纤丝形成。用变体重组纤维蛋 白原进行的实验显示，当'A-a'相互作用削弱时'B-b'相互作用可在原纤丝形成中起重要作 用。其它研究已经证实即使当'B'把手和'b'孔洞两者都可用时在纤维蛋白片段与纤维蛋白 原分子结合期间也仅发生'A-a'相互作用，并且在排除'A-a'相互作用时'B-b'把手-孔洞相 互作用明显。然而，肽抑制研究已经表明'B-b'相互作用可与'A-a'同时发生。
[0006] 纤维蛋白通过纤维蛋白纤维中不同分子的侧链间的共价交联的形成而稳定。在由 因子Xllla催化的转酰胺反应中在特定谷氨酰胺和赖氨酸侧链之间形成肽键。
[0007] 纤维蛋白组织粘着剂(FTA)是给予通过模仿形成纤维蛋白凝块的凝血级联的最后 一步形成的产物的名称。可商购的FTA试剂盒迅速产生用于止血、药物递送和作为外科用胶 水和组织封闭剂的强、生物可降解的凝胶。纤维蛋白原、因子XIII、凝血酶和钙离子通常经 由在储存期间将纤维蛋白原和因子XIII与钙离子和凝血酶分开的注射器装置递送。从注射 器排出期间组分的混合导致纤维蛋白原的凝血酶溶解产生纤维蛋白，纤维蛋白自我组装成 稍后通过钙离子活化的因子XIII而交联的凝胶。
[0008] 传统FTA的缺点在于其并非呈即用形式提供，所以在向伤口涂敷之前必须混合FTA 的组分。这些组分一经混合，就必须在短时间内使用FTA。在使用前不久制备混合物的要求 可特别不利，例如，如果在紧急情况下需要该产品。
[0009] 许多FTA利用被牛抗原，尤其是牛因子V污染的牛凝血酶。对这种抗原产生的抗体 可与人因子V交叉反应并且导致致命性出血并且，在一些情况下，导致过敏性反应和死亡。 已经从供体的混合血浆中分离出人凝血酶，试图将这些风险降到最低，但是具有传播血源 性病原体，特别是病毒的可能性。已经开发出重组人凝血酶并且经美国食品和药物管理局 (FDA)批准使用。重组人凝血酶具有最低抗原性的优点并且未携带病毒传播的风险。然而， 重组人凝血酶使用经基因修饰的中国仓鼠卵巢细胞系制备，所以生产相对昂贵。
[0010]纯化的牛和重组人凝血酶制剂呈粉末储存在室温下，使用之前必须用盐水复水成 溶液。FDA批准的纯化人凝血酶呈溶液包装，但是这仅可储存在室温下24小时；长期储存需 要冷冻（Lew和Weaver，Biologies :Targets&Therapy 2008:2(4)593-599)。使用凝血酶的另 一缺点是，酶需要时间来将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，所以在血液凝固加速之前存在延 迟。
[0011]传统FTA也使用很大量的纤维蛋白原。其它止血剂依赖于患者自身的纤维蛋白原 促进凝块形成。称为"FL0SEAL"的止血基质由牛源性明胶基质、人源性凝血酶和氯化钙的混 合物组成。凝血酶呈冻干形式提供，并且在使用之前必须溶于氯化钙溶液中，再与明胶基质 混合。该产品必须在制备8小时内使用。同样在使用前不久制备混合物的要求可特别不利， 例如，如果在紧急情况下需要该产品。
[0012] W0 2008/065388描述了使用能够使纤维蛋白原在凝血酶缺乏时聚合的试剂形成 生物凝胶。所述试剂包含使用交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺 酯（SMCC)与可溶性人血清白蛋白（HSA)载体偶联的几种纤维蛋白原结合肽。US 2012/ 0114682描述了纤维蛋白把手肽的偶联物形成纤维蛋白聚合物的用途，及其在伤口修复上 的用途。本文件还描述了包含与聚乙二醇(PEG)连接的纤维蛋白原结合肽GPRP(SEQ ID N0: 1)的偶联物的生成。通过使马来酰亚胺活化的PEG与合成把手肽的C端半胱氨酸反应生成 "把手-PEG"偶联物。
[0013] 偶联方法往往很复杂，需要多个步骤，其中一些可能需要在不同地点完成，并且往 往产生相对低产率的所需产物。偶联产物的另一缺点是，由于其合成中所用的载体和/或连 接材料，其可能对灭菌辐射敏感。
[0014]因此，需要提供可使纤维蛋白原迅速聚合，可以容易地生产而无需使用免疫原性 试剂，抗灭菌辐射并且可以呈即用形式提供的止血剂。
[0015] 根据本发明的第一个方面，提供了一种肽类树状聚合物，其包含分支核心和多个 与所述分支核心单独共价连接的纤维蛋白原结合肽，其中所述分支核心包含：
[0016] 2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的多 官能团氨基酸残基单独共价连接；
[0017] 多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心的 至少两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接；
[0018] 多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心 的至少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接；
[0019] 多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官 能团氨基酸残基的侧链共价连接;或
[0020] 单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肽与所述多官能团氨基酸残基的 每个官能团单独共价连接；
[0021] 其中所述多官能团氨基酸残基包含三或四官能团氨基酸残基，或三和四官能团氨 基酸残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为三或四官能团氨基酸残基。
[0022] 每个纤维蛋白原结合肽与所述分支核心具有不同的连接点，所以本文将纤维蛋白 原结合肽称为与分支核心"单独共价连接"。
[0023] 分支核心包含任何适合的氨基酸序列。分支核心可包含多达10个多官能团氨基酸 残基，例如2至10个，或2至6个多官能团氨基酸残基。
[0024] 分支核心可包含多个连续的多官能团氨基酸残基。分支核心可包含多达10个连续 的多官能团氨基酸残基。
[0025]本文所用术语"三官能团氨基酸"指具有为胺（-NH2)的第一官能团、为羧酸（_ C00H)的第二官能团和第三官能团的任何有机化合物。本文所用术语"四官能团氨基酸"指 具有为胺(-NH2)的第一官能团、为羧酸(-C00H)的第二官能团、第三官能团和第四官能团的 任何有机化合物。第三和第四官能团可以是能够与纤维蛋白原结合肽的羧基末端或与连接 到纤维蛋白原结合肽的羧基末端的接头的官能团反应的任何官能团。
[0026]多官能团氨基酸可包含带有氨基的中心碳原子(α-或2_)、羧基和带有另一官能团 (从而提供三官能团氨基酸)或另两个官能团(从而提供四官能团氨基酸)的侧链。
[0027]所述或每个多官能团氨基酸残基可为蛋白原或非蛋白原多官能团氨基酸的残基， 或天然或非天然多官能团氨基酸的残基。
[0028]蛋白原三官能团氨基酸具有带有氨基的中心碳原子(α-或2_)、羧基、侧链和α-氢 左旋构象。适合的三官能团蛋白原氨基酸的实例包括L-赖氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-半胱氨酸。
[0029]适合的三官能团非蛋白原氨基酸残基的实例包括D-赖氨酸、β-赖氨酸、L-鸟氨酸、 D-鸟氨酸和D-精氨酸残基。
[0030] 因此，用于本发明的肽类树状聚合物中的适合三官能团氨基酸残基的实例包括赖 氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸残基，如L-赖氨 酸、D-赖氨酸、β-赖氨酸、L-鸟氨酸、D-鸟氨酸、L-精氨酸、D-精氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨 酸、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-半胱氨酸和 D-半胱氨酸残基。
[0031] 适合用于本发明的肽类树状聚合物中的适合多官能团非天然氨基酸的实例包括 瓜氨酸、2，4-二氨基异丁酸、2，2 二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸和顺-4-氨基-L-脯氨酸。 多官能团非天然氨基酸可从Sigma-Aldrich得到。
[0032] 在一些实施方案中，分支核心可包含均聚多官能团氨基酸序列，例如聚-赖氨酸、 聚-精氨酸或聚-鸟氨酸序列，如分支核心包含2至10个或2至6个连续的赖氨酸、精氨酸或鸟 氨酸残基。在其它实施方案中，分支核心可包含不同的多官能团氨基酸残基，例如一个或多 个赖氨酸残基、一个或多个精氨酸残基和/或一个或多个鸟氨酸残基。
[0033] 在其它实施方案中，分支核心可包含多个多官能团氨基酸残基和一个或多个其它 的氨基酸残基。
[0034] 分支核心包含多个多官能团氨基酸残基时，相邻多官能团氨基酸残基可通过氨基 酸侧链连键、肽键连接在一起，或一些相邻多官能团氨基酸残基可通过侧链连键或其它的 通过肽键连接在一起。
[0035] 在另外的实施方案中，分支核心可包含两个或更多个多官能团氨基酸残基，并且 至少一个纤维蛋白原结合肽与两个或更多个多官能团氨基酸残基中的每一个单独连接，并 且两个或更多个纤维蛋白原结合肽与分支核心的至少一个多官能团氨基酸残基单独连接。
[0036] 根据其它实施方案，两个纤维蛋白原结合肽与分支核心的末端多官能团氨基酸残 基单独连接。
[0037] 本发明的肽类树状聚合物的结构的实例包括下述肽类树状聚合物，其中：
[0038] ?分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽与之连接的第一三官能团氨基酸残基和 一个纤维蛋白原结合肽与之连接的第二三官能团氨基酸残基；
[0039] ?分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽与之连接的第一三官能团氨基酸残基和 两个纤维蛋白原结合肽与之连接的第二三官能团氨基酸残基；
[0040] ?分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽与之连接的第一三官能团氨基酸残基，一 个纤维蛋白原结合肽与之连接的第二三官能团氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽与之 连接的第三三官能团氨基酸残基;或
[0041] ?分支核心包含两个纤维蛋白原结合肽与之连接的第一三官能团氨基酸残基，一 个纤维蛋白原结合肽与之连接的第二三官能团氨基酸残基，一个纤维蛋白原结合肽与之连 接的第三三官能团氨基酸残基和一个纤维蛋白原结合肽与之连接的第四三官能团氨基酸 残基。
[0042] 本发明的肽类树状聚合物可包含下列通式(I):
[0044]其中：
[0045] FBP为纤维蛋白原结合肽；
[0046]-(接头)-为任选接头，优选为非肽接头；
[0047] X为三官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、鸟氨酸或精氨酸；
[0048] Y 为-FBP 或-NH2;
[0049] Z在Y为-FBP时为-(接头）-FBP，或在Y为-NH2时为-[_Χη_(接头）-FBP] a-(接头）- FBP；
[0050]其中：
[0051 ] Xn为三官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、L-鸟氨酸或精氨酸;并且
[0052] a 为 1-10,优选 1-3。
[0053] 例如，在Y为-NH2，Z为-[-Xn-(接头）-FBP] a-(接头）-FBP时，树状聚合物的结构如 下：
[0054] 其中a为1:
[0060] 可选地，在 Y为-FBP时，Z为-[-χη-(接头)-FBP ] a-(接头)-FBP;
[0061] 其中：
[0062] Χη为三官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、L-鸟氨酸或精氨酸;并且
[0063] a 为 1-10,优选 1-3。
[0064] 例如，在Y为-FBP，Z为-[-Xn-(接头)-FBP ] a-(接头)-FBP并且a为1时，树状聚合物的 结构如下：
[0066]本发明的肽类树状聚合物可包含下列通式(II):
[0068] 其中：
[0069] FBP为纤维蛋白原结合肽；
[0070] -(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH( CH2) 5C0_;
[0071] Y 为-FBP 或-NH2;
[0072] Z：
[0080] 其中 R为-(CH2) 4NH-、- (CH2) 3NH-或-(CH2) 3NHCNHNH-;
[0081] 其中 a 为 1-3。
[0082] 可选地，a可为4-10,或其可为1-10。
[0083] 在另一个实施方案中，Z:
[0085] 其中 R为-(CH2) 4NH-、- (CH2) 3NH-或-(CH2) 3NHCNHNH-;
[0086] 其中 a 为 1-10,优选 1-3。
[0087] 例如，Z:
[0089]本发明的肽类树状聚合物可包含下列通式(III):
[0091]其中：
[0092] FBP为纤维蛋白原结合肽；
[0093 ]-(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH( CH2) 5C0_;
[0094] Y 为-FBP 或-NH2;
[0095] Z：
[0096] 在 Y为-FBP时，为_(CH2)4NH-(接头)_FBP;或
I. - · - · J y、 I y 丄 <_/ o
[0102] 可选地，a为4-10,或其可为1-10。
[0103] 在另一个实施方案中，Z:
[0105]其中 a 为 1-10,优选 1-3。
[0106]例如，Z:
[0108]在一个实施方案中，肽类树状聚合物不包含以下结构：
[0110] 任何适合的纤维蛋白原结合肽(FBP)均可使用。例如，所述肽能够与纤维蛋白原自 然与纤维蛋白结合或被血小板膜糖蛋白GPIIb-IIIa结合的区域结合。在Mosesson等2001， Ann.N.Y.Acad. Sci . ,936，11-30中讨论了纤维蛋白与纤维蛋白原的结合。在Bennett，2001， Annals ofNY Acad.Sci. ,936,340-354中讨论了GPIIb-IIIa与纤维蛋白原的结合。
[0111] 如本文中所用的术语"肽"还并入了肽类似物。若干肽类似物为技术人员已知。任 何适合的类似物均可使用，条件是纤维蛋白原能够结合纤维蛋白原结合肽。
[0112] TO 2005/035002、TO 2007/015107和TO 2008/065388中提供了适合的纤维蛋白原 结合肽的实例及其如何鉴定。
[0113] 优选地，纤维蛋白原结合肽各自长度为3-60个，优选3-30个，更优选3-10个氨基酸 残基。
[0114] 优选地，每个纤维蛋白原结合肽以介于10_9至10_6M，例如大约10、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、40〇11]\1或更高的解离常数(1(〇) 与纤维蛋白原结合。优选大约1〇〇ηΜ的KD。可在平衡时测量解离常数。例如，已知浓度的放射 性标记纤维蛋白原可以和纤维蛋白原结合部分已经与之交联的微球一起孵育。通常，5μΜ肽 与1克微球交联，或15_40μπιο1肽与1克微球交联。将肽连接的微球稀释至0.5mg/ml，并且在 20°C下在pH 7.4的等渗缓冲液(例如，含0.15M NaCl的0 . OlMHepes缓冲液）中与浓度介于 0.05和0.5mg/ml之间的放射性标记纤维蛋白原一起孵育长达1小时。可通过离心将与微球 上的纤维蛋白原结合部分结合的纤维蛋白原与游离纤维蛋白原分离并且测量游离和结合 的纤维蛋白原的量。然后通过按结合:游离纤维蛋白原的浓度比为结合的纤维蛋白原的浓 度绘图，通过Scatchard分析计算解离常数，其中曲线斜率表示Kd。
[0115]根据一些实施方案，本发明的肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽优先于纤维蛋 白原的孔洞'b'与纤维蛋白原的孔洞'a'结合。优先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结合 的适合纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括:GPR-;GPRP-(SEQ SD N0:1);GPRV-(SEQ ID N0:2)；GPRPFPA-(SEO ID NO:3)；GPRVVAA-(SEQ ID NO:4)；GPRPVVER-(SEQ ID NO:5)； GPRPAA-(SEQ ID NO:6)；GPRPPEC-(SEQ ID NO:7)；GPRPPER-(SEQ ID NO:8)；GPSPAA-(SEQ ID N0:9)〇
[0116] 根据其它实施方案，本发明的肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽优先于纤维蛋 白原的孔洞'a'与纤维蛋白原的孔洞'b'结合。优先于纤维蛋白原的孔洞'a'与孔洞'b'结合 的纤维蛋白原结合肽的序列的实例包括:GHR-、GHRP-(SEQ ID N0:10)、GHRPY-(SEQ ID N0: 11)、GHRPL-(SEQ ID N0:12)、GHRPY酰胺_(SEQ ID N0:13)。
[0117] 本发明的肽类树状聚合物的每个纤维蛋白原结合肽可独立地，在其羧基末端(任 选地经由接头），或在其氨基末端(任选地经由接头)连接到树状聚合物的分支核心。如果纤 维蛋白原结合肽在其氨基末端连接，则所述肽的羧基末端可包含酰胺基团。在所述肽暴露 的羧基末端存在酰胺基团而非羧基(或带负电的羧酸盐离子)可帮助优化纤维蛋白原结合 肽与纤维蛋白原的结合。
[0118] 在一些实施方案中，每个纤维蛋白原结合肽(任选地经由接头)在其羧基末端连接 到树状聚合物的分支核心。在其它实施方案中，至少一个纤维蛋白原结合肽(任选地经由接 头)在其氨基末端连接到树状聚合物的分支核心。例如，优先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔 洞'a'结合的至少一个纤维蛋白原结合肽，如包含序列APFPRPG(SEQ ID N0:14)的肽，可(任 选地经由接头)在其氨基末端连接到树状聚合物的分支核心。
[0119] 有利地，本发明的肽类树状聚合物包含不同序列的纤维蛋白原结合肽(本文称为 '嵌合'肽类树状聚合物）。例如，在一些实施方案中，本发明的肽类树状聚合物包含具有优 先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结合的不同选择性的纤维蛋白原结合肽。
[0120] 根据本发明的第二个方面，提供了一种包含多个载体的试剂，其中每个载体具有 多个连接到所述载体的纤维蛋白原结合肽，并且其中连接到所述载体的所述纤维蛋白原结 合肽包含不同序列的纤维蛋白原结合肽。
[0121] 在本发明的第二个方面的一些实施方案中，所述多个载体包含第一多个载体和第 二多个载体，其中连接到所述第一多个载体的所述纤维蛋白原结合肽具有与连接到所述第 二多个载体的所述纤维蛋白原结合肽不同的序列。
[0122] 在本发明的第二个方面的其它实施方案中，每个载体具有与之连接的不同序列的 纤维蛋白原结合肽。
[0123] 载体可为可溶性或不溶性载体，但是优选不为血小板。载体可适于向受试者的组 织部位，例如出血性伤口部位或粘膜部位局部施用。可溶性载体可适于静脉而非局部施用。 载体可包含可溶性或不溶性蛋白质、治疗性药物、聚合物(例如生物相容性聚合物，如聚乙 二醇）或这些中任一种的组合。蛋白质载体的实例为酶或不是酶的蛋白质，如人血清白蛋 白。
[0124] 不溶性载体可为微粒(包括实心、空心或多孔微粒，优选基本上为球形的微粒）。微 粒可由任何适合的物质，例如交联蛋白形成。适合的蛋白质为白蛋白（在序列上为血清来源 的或重组的、人或非人的)或明胶。适于在本发明中用作不溶性载体的微粒可由使用公知的 喷雾-干燥技术，例如与W0 92/18164中一样喷雾干燥人血清白蛋白（HSA)来形成。微粒用作 载体的替代物包括脂质体、合成聚合物颗粒(如聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳/乙醇)酸)或细胞 膜碎片。
[0125] 至少大部分载体可具有小于6μπι的最大尺寸。如果本发明的试剂用于静脉施用，则 这可优选。
[0126] 可选地，至少大部分载体可具有大于6μπι的最大尺寸。如果本发明的试剂用于局部 施用，则这可优选。
[0127] 理论上每个载体分子的纤维蛋白原结合肽的数量没有上限。最佳数量很可能取决 于许多因素，如载体的特性和每个载体上用于连接纤维蛋白原结合肽的反应基团的数量。 然而，优选平均每个载体分子存在高达100个纤维蛋白原结合肽。优选地，平均每个载体分 子存在至少三个，优选至少四个或五个纤维蛋白原结合肽。优选范围为每个载体分子10-20 个纤维蛋白原结合肽。
[0128] 载体可包含允许纤维蛋白原结合肽与载体连接的基团。例如，载体可包含在其表 面上的硫醇部分或胺部分。如果载体为蛋白质，则可由氨基酸，例如半胱氨酸或赖氨酸的侧 链提供硫醇或胺部分。可向载体添加非肽基团。如果载体由蛋白质，如HSA形成，则这样特别 有利。例如，可使用能够与载体上的伯胺基团反应的试剂，如2-亚氨基硫杂环戊烷(2-ΙΤ)向 载体添加硫醇基团。
[0129] 不同序列的纤维蛋白原结合肽可包含优先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结 合的第一纤维蛋白原结合肽，和以比所述第一纤维蛋白原结合肽更高的选择性优先于纤维 蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结合的第二纤维蛋白原结合肽。已经发现此类肽类树状聚合物 在相对宽的肽类树状聚合物浓度范围内使纤维蛋白原迅速聚合。
[0130]例如，第一纤维蛋白原结合肽可包含在其氨基末端的氨基酸序列GPRP-(SEQ ID N0:1)，和/或第二纤维蛋白原结合肽包含在其羧基末端的氨基酸序列-APFPRPG(SEQ ID NO: 14)，其中序列的氨基酸残基按氨基到羧基的顺序表示，并且表示与肽类树状聚合物 的分支核心或与载体连接的序列末端。在其羧基末端具有序列_APFPRPG(SEQ ID N0:14)的 纤维蛋白原结合肽以比在其氨基末端具有序列GPRP_(SEQ ID NO: 1)的纤维蛋白原结合肽 更高的选择性，优先于纤维蛋白原的孔洞' b '与孔洞' a '结合。
[0131]在其它实施方案中，不同序列的纤维蛋白原结合肽可包含优先于纤维蛋白原的孔 洞'b'与孔洞'a'结合的第一纤维蛋白原结合肽，和优先于纤维蛋白原的孔洞'a'与孔洞'b' 结合的第二纤维蛋白原结合肽。已经发现与仅含优先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结 合的纤维蛋白原结合肽的等效肽类树状聚合物相比，此类肽类树状聚合物与纤维蛋白原聚 合形成相对致密的水凝胶。据信，形成的水凝胶密度增大是由于树状聚合物的纤维蛋白原 结合肽与纤维蛋白原的孔洞'a'和孔洞'b'结合，从而加固了聚合的纤维蛋白原的网络。
[0132] 例如，第一纤维蛋白原结合肽可包含在其氨基末端的氨基酸序列GPRP_(SEQ ID NO: 1)和/或第二纤维蛋白原结合肽可包含在其氨基末端的氨基酸序列GHRP-(SEQ ID NO: 10)或氨基酸序列GHRPY-(SEQIDN0:11)。在氨基末端具有序列GPRP-(SEQIDN0 :1)的纤 维蛋白原结合肽以一定选择性与纤维蛋白原的孔洞'a'结合。在氨基末端具有序列GHRP-(SEQIDN0 :10)或GHRPY-(SEQIDN0:11)的纤维蛋白原结合肽优先与纤维蛋白原的孔洞 'b'结合。
[0133] -个或多个或每个纤维蛋白原结合肽可通过非肽接头与本发明的肽类树状聚合 物的分支核心共价连接。接头可为不干扰纤维蛋白原与肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合 肽结合的任何适合接头。接头可包含挠性、直链接头，适合地直链烷基。此类接头允许肽类 树状聚合物的纤维蛋白原结合肽延伸相互远离。例如，接头可包含-NH(CH2)nC〇-基团，其中η 为任意数字，适合地1-10,例如5。可通过使用ε-氨基酸6-氨基己酸（eAhx)形成包含-ΝΗ (CH2)5CO_基团的接头。
[0134] 理论上，对本发明的肽类树状聚合物中可存在的纤维蛋白原结合肽的总数不存在 限制。然而，实际上，对于任何特定结构而言，纤维蛋白原结合肽的数量可改变并且经试验 确定对于所需纤维蛋白原聚合性质，例如对于加速纤维蛋白原聚合或对于通过与纤维蛋白 原聚合而产生的水凝胶的密度的最佳数量。肽类树状聚合物可包含总计每个树状聚合物多 达20个纤维蛋白原结合肽，例如每个树状聚合物多达10个纤维蛋白原结合肽，或每个树状 聚合物多达5个纤维蛋白原结合肽。
[0135]
【申请人】已经发现，令人惊讶的是，本发明的肽类树状聚合物与包含两个或更多个 纤维蛋白原结合肽的肽偶联物的混合物能够比单独的肽类树状聚合物或肽偶联物更迅速 地使纤维蛋白原聚合。
[0136] 根据本发明，提供了一种组合物，其包含本发明的肽类树状聚合物和包含两个或 更多个纤维蛋白原结合肽的肽偶联物。
[0137] 肽偶联物可包含相同序列或不同序列的纤维蛋白原结合肽。例如，肽偶联物可仅 包含优先于纤维蛋白原的孔洞'b'与孔洞'a'结合的纤维蛋白原结合肽，或仅包含优先于纤 维蛋白原的孔洞'a'与孔洞'b'结合的纤维蛋白原结合肽，或一个或多个优先于纤维蛋白原 的孔洞'b'与孔洞'a'结合的纤维蛋白原结合肽和一个或多个优先于纤维蛋白原的孔洞'a' 与孔洞' b '结合的纤维蛋白原结合肽。
[0138] 肽偶联物可包含纤维蛋白原结合肽与之连接的载体。适合的载体可包含一个或多 个氨基酸残基，例如单个氨基酸残基，如赖氨酸氨基酸残基。包含含一个或多个氨基酸残基 的载体的偶联物的优点在于其可易于使用固相肽合成法制备。
[0139] 肽偶联物的每个纤维蛋白原结合肽可独立地在其羧基末端(任选地经由接头)或 在其氨基末端(任选地经由接头)与载体连接，如果纤维蛋白原结合肽在其氨基末端连接， 则所述肽的羧基末端可包含酰胺基团。
[0140] 在一些实施方案中，肽偶联物可为本发明的肽类树状聚合物。
[0141] 本发明组合物的肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽可优先于纤维蛋白原的孔 洞'b'与纤维蛋白原的孔洞'a'结合，而肽偶联物的纤维蛋白原结合肽可优先于纤维蛋白原 的孔洞' a '与纤维蛋白原的孔洞' b '结合。
[0142] 已经发现此类组合物具有协同作用，因其能够比单独的肽类树状聚合物或肽偶联 物更迅速地使纤维蛋白原聚合。这种协同作用的机制不完全清楚，但不受理论约束，据信这 可以发生是因为所述组合物提供更多的'A'和'B'纤维蛋白原聚合位点。
[0143] 可选地，本发明组合物的肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽可优先于纤维蛋白 原的孔洞'a'与纤维蛋白原的孔洞'b'结合，而肽偶联物的纤维蛋白原结合肽优先于纤维蛋 白原的孔洞' b '与纤维蛋白原的孔洞' a '结合。
[0144] 根据本发明，还提供了一种药物组合物，其包含本发明的肽类树状聚合物、本发明 的试剂或本发明的组合物及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0145] 适合的药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂为技术人员公知。药学上可接受的 载体、赋形剂和稀释剂包括适于和本发明的肽类树状聚合物、试剂或组合物一起向伤口部 位局部施用的那些。适合的药学上可接受的载体的实例包括优选呈可流动形式的载体，如 明胶、纤维蛋白、壳聚糖、纤连蛋白、胶原蛋白、淀粉、透明质酸。适合的药学上可接受的稀释 剂或赋形剂包括缓冲剂(如Tris-HCl、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂）、添加剂如去垢剂或助溶剂 (例如，吐温80、聚山梨醇酯80 )、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠）、防腐剂(例如，间甲 苯酚、对羟基苯甲酸（甲基、丙基或丁基）酯、氯丁醇、苯汞盐（例如，乙酸盐、硼酸盐、硝酸 银）、山梨酸、苯甲醇)和填充物质（例如，乳糖、甘露糖醇）、张度剂(例如，糖、氯化钠）、聚合 化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸）。
[0146] 本发明的肽类树状聚合物、试剂和组合物的特殊优点在于，其可易于灭菌，例如通 过暴露于辐射，适合地Y辐射，肽类树状聚合物或组合物与纤维蛋白原聚合的能力无明显 损失。
[0147] 根据本发明，提供了一种为本发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发明的 组合物灭菌的方法，其包括将所述肽类树状聚合物、试剂或组合物暴露于γ辐射，优选高达 30kGy。所述肽类树状聚合物、试剂或组合物可呈干燥、湿润或溶剂形式。
[0148] 根据本发明，还提供了本发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发明的组合 物，其无菌。
[0149] 本发明的肽类树状聚合物、试剂或组合物可有利地作为无菌、即用型制剂，尤其作 为无菌、即用型止血剂或伤口治疗制剂提供。
[0150] 在一些实施方案中，本发明的肽类树状聚合物可配制成水合可流动的明胶糊剂并 包装到注射器中，注射器可经辐照以提供无菌、即用型、可流动产品。
[0151] 根据本发明，还提供了一种使纤维蛋白原聚合的方法，其包括使纤维蛋白原与本 发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发明的组合物接触。
[0152] 用于聚合的树状聚合物和纤维蛋白原的相对浓度将取决于树状聚合物的特性，例 如存在多少纤维蛋白原结合肽，和纤维蛋白原结合肽的序列。
【申请人】已经使用在〇.〇〇5mg/ ml至2mg/ml浓度范围的本发明的肽类树状聚合物，和生理水平的纤维蛋白原(3mg/ml)观察 到快速的聚合时间。
[0153] 对于本发明的一些肽类树状聚合物而言，随着树状聚合物的浓度增加，纤维蛋白 原聚合的速度（即，"凝结时间"）降低。不受理论约束，这被认为是由于纤维蛋白原分子的 'a'和/或'b'孔洞被树状聚合物的纤维蛋白原结合肽饱和。在这些较高的树状聚合物浓度 下，存在竞争游离纤维蛋白原结合孔洞（即，空的'a'和/或'b'孔洞）的过量纤维蛋白原结合 肽，并且认为这种竞争降低了进行聚合的速率。
[0154] 根据本发明还提供了一种用于形成水凝胶的试剂盒，其包含本发明的肽类树状聚 合物、本发明的试剂或本发明的组合物和单独地，纤维蛋白原。
[0155] 根据本发明还提供了一种水凝胶，其包含本发明的肽类树状聚合物、本发明的试 剂或本发明的组合物与纤维蛋白原的共聚物。
[0156] 本发明的肽类树状聚合物、试剂和组合物可用作止血剂，例如用于治疗出血或治 疗伤口。
[0157] 根据本发明，提供了一种治疗出血或治疗伤口的方法，其包括向出血部位或向伤 口施用本发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发明的组合物。
[0158] 所述肽类树状聚合物、试剂或组合物可使出血部位或伤口处存在的内源（即宿主） 纤维蛋白原聚合。在一些实施方案中，可向出血部位或伤口施用外源纤维蛋白原以及本发 明的肽类树状聚合物、试剂或组合物。
[0159] 本文使用术语"纤维蛋白原"以包括天然纤维蛋白原、重组纤维蛋白原或可由凝血 酶转化形成纤维蛋白（例如，天然或重组纤维蛋白单体，或能够或不能自发组装的纤维蛋白 单体的衍生物)的纤维蛋白原衍生物。纤维蛋白原应能够结合至少两个纤维蛋白原结合肽。 纤维蛋白原可从任何来源和任何物种得到（包括牛纤维蛋白原），但是优选为人纤维蛋白 原。人纤维蛋白原可从自体或供体血液得到。优选自体纤维蛋白原或重组纤维蛋白原，因为 这降低了向受试者施用时的感染风险。
[0160] 向人类受试者施用的肽类树状聚合物的适用量将取决于，例如，树状聚合物的类 型，例如每个树状聚合物分子存在多少纤维蛋白原结合肽，及伤口或出血部位的类型和尺 寸。然而，树状聚合物的典型量为〇. lml至50ml，例如0. lml至5ml，或1至50ml含浓度为0.005 至25mg/ml的树状聚合物的制剂(例如，含水制剂）。
[0161 ]向人类受试者施用的外源纤维蛋白原的适用量为0 . lmg至200mg，例如3mg至 200mg〇
[0162] 本发明的肽类树状聚合物、试剂或组合物可作为直接向伤口施用的液体提供，或 在涂敷之前任选与纤维蛋白原一起涂敷到海绵或织物上(例如，浸渍或涂布）。可选地，本发 明的肽类树状聚合物、试剂或组合物可与可流动糊剂混合，用注射器施用。
[0163] 根据本发明还提供了用作药剂的本发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发 明的组合物。
[0164] 根据本发明还提供了用于治疗出血或用于治疗伤口的本发明的肽类树状聚合物、 本发明的试剂或本发明的组合物。
[0165] 根据本发明还提供了本发明的肽类树状聚合物、本发明的试剂或本发明的组合物 在制备用于治疗出血或用于治疗伤口的药剂中的发明用途。
[0166] 本发明的肽类树状聚合物、试剂和组合物具有几个重要优点。具体而言，在某些实 施方案中，所述肽类树状聚合物、试剂和组合物可易于使用常规的固相肽合成程序制备。在 最佳浓度下，本发明的肽类树状聚合物、试剂和组合物可以使纤维蛋白原在凝血酶缺乏时 不到1秒钟就聚合。本发明的肽类树状聚合物和试剂还可以使人血浆中的纤维蛋白原不到1 秒钟就聚合。
[0167] 可选择本发明的肽类树状聚合物或试剂的结构以便优化树状聚合物做预期用途 的性质。例如，包含5个优先与纤维蛋白原的孔洞'a'结合的相同序列的纤维蛋白原结合肽 的肽类树状聚合物能够使纤维蛋白原几乎瞬间聚合。相比之下，具有一个或多个优先与纤 维蛋白原的孔洞'a'结合的纤维蛋白原结合肽和一个或多个优先与纤维蛋白原的孔洞'b' 结合的不同纤维蛋白原结合肽的'嵌合'肽类树状聚合物可使纤维蛋白原更缓慢地聚合，但 是形成密度和尺寸更大的水凝胶。
[0168] 本发明的肽类树状聚合物、试剂和组合物可灭菌，无纤维蛋白原聚合活性损失。因 其允许肽类树状聚合物、试剂和组合物呈无菌、即用型制剂，例如即用型止血剂或伤口治疗 制剂提供，所以这是重要优点。
[0169] 现仅以举例的方式，参考附图描述本发明的实施方案，其中：
[0170] 图1示出了优选实施方案的肽类树状聚合物在不同浓度下使纤维蛋白原聚合的能 力；
[0171] 图2示出了几种不同的肽类树状聚合物在不同浓度下使纤维蛋白原聚合的能力。 编号指代肽类树状聚合物的身份；
[0172] 图3示出了几种不同的肽类树状聚合物在不同浓度下使纤维蛋白原聚合的能力。 编号指代肽类树状聚合物的身份；
[0173] 图4示出了几种不同的肽类树状聚合物在不同浓度下使纤维蛋白原聚合的能力。 编号指代肽类树状聚合物的身份；
[0174] 图5示出了通过使用本发明的不同肽类树状聚合物聚合纤维蛋白原形成的水凝胶 的照片；
[0175] 图6示出了本发明的肽类树状聚合物与肽偶联物的不同组合在不同浓度下使纤维 蛋白原聚合的能力;并且
[0176] 图7示出了本发明的几种不同肽类树状聚合物使人血浆中的纤维蛋白原聚合的能 力。
[0177] 实施例1
[0178] 肽类树状聚合物和肽偶联物的合成
[0179] 在Rink酰胺MBNA低载量树脂(Novabiochem，0.36mmol/g)上，使用Fmoc保护的氨基 酸(Novabiochem)通过标准的Fmoc肽合成法合成肽。
[0180] 一般而言，在整个合成期间使用单偶合循环并且采用HBTU激活化学法（HBTU和 PyB0P(来自于AGTC Bioproducts)用作偶合剂）。然而，在一些位置偶合不如预期的有效并 且需要双重偶合。
[0181]使用自动化肽合成仪和HBTU将肽组装到分支点并且对于肽分支而言使用PyBOP通 过人工肽合成。
[0182]对于自动化合成每次偶合使用3倍过量的氨基酸和HBTU和在二甲基甲酰胺(DMF， Sigma)中9倍过量的二异丙基乙胺(DIPEA，Sigma)。
[0183] 对于人工合成每次偶合使用3倍过量的氨基酸和PyBOP和在N-甲基吡咯烷酮(NMP， Sigma)中9倍过量的DIPEA。
[0184] 使用在DMF中20%的哌啶（Sigma)为增长肽链去保护（去除Fmoc基团）同样不是总 能有效并且需要双重去保护。
[0185] 使用卩111〇(3-1^8(卩1]1〇(3)-0!1、卩1]1〇(3-1^8(13〇(3)-0!1或卩1]1〇(3-1^8(]\11:1:)-0!1产生分支。
[0186] 肽最终去保护和从固相支持体上裂解是通过用含有三异丙基硅烷(TIS，Sigma)、 水和茴香醚(Sigma) (1:1:1，5% )的95%TFA(Sigma)处理树脂2-3小时而进行。
[0187] 裂解的肽沉淀在冷乙醚(Sigma)中，通过离心团块化并且冻干。使团块重新溶于水 (10-15mL)中，过滤并且使用C-18柱（Phenomenex，流速为20ml/min)和含有0.1%TFA的乙 腈/水梯度经由反相HPLC纯化。纯化的产物冻干并通过ESI-LC/MS和分析型HPLC分析并且经 证明是纯的（>95% )。大量结果与计算值完全一致。
[0188] 肽类树状聚合物和肽偶联物
[0189] 下面示出了使用上述方法合成的肽类树状聚合物和肽偶联物的结构。
[0190] 在肽序列末端的"-NH2-"基团表示在序列氨基末端的氨基。在肽序列末端的"-am" 基团表示在序列羧基末端的酰胺基团。
[0213] 实施例2
[0214] 肽类树状聚合物与纤维蛋白原的共聚
[0215] 12号树状聚合物包含具有5个连续赖氨酸残基的分支核心。赖氨酸残基通过相邻 赖氨酸残基的侧链共价连接。
[0216]评估12号肽类树状聚合物使纤维蛋白原聚合的能力。将30μ1呈溶液的浓度范围为 0.00 5-2mg/ml的树状聚合物添加到1 ΟΟμ 1的3mg/ml (在血液中发现的纤维蛋白原水平）的纯 化人纤维蛋白原中。使用Sigma Amelung KC4Delta凝固分析仪分析纤维蛋白原的聚合。图1 示出了增加树状聚合物的浓度，聚合(凝结)时间（按秒计)的曲线图。
[0217]结果显示即使在树状聚合物的极低浓度下，树状聚合物也能够几乎瞬间与纤维蛋 白原共聚。凝结时间随高于〇.5mg/ml的树状聚合物浓度的增加被认为是通过与纤维蛋白原 中的游离结合口袋的数量相比，纤维蛋白原结合肽过量来解释。在较高浓度下，树状聚合物 的纤维蛋白原结合肽可使纤维蛋白原结合口袋饱和，产生大量不能够与纤维蛋白原共聚的 过量树状聚合物分子。
[0218] 实施例3
[0219] 改变每个树状聚合物的纤维蛋白原结合肽数量对与纤维蛋白原共聚的速度的影 疸
[0220]该实施例研究了改变每个肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽数量对与纤维蛋 白原共聚的速度的影响。
[0221] 使用实施例2中描述的相同方法评估4、5、10、11和12号肽类树状聚合物与纤维蛋 白原共聚的能力。每种树状聚合物的浓度在0.005-0.5mg/ml改变。图2示出了增加每种不同 树状聚合物的浓度，凝结时间（按秒计)的曲线图。
[0222] 结果显示5号树状聚合物(每个树状聚合物仅具有两个纤维蛋白原结合肽)不能够 与纤维蛋白原共聚。随着纤维蛋白原结合肽的数量从三个增加到五个，在~0.125至~ 0.275mg/ml的树状聚合物浓度下，共聚速度增加。在低于~0.125mg/ml的树状聚合物浓度 下，10号树状聚合物(每个树状聚合物具有三个纤维蛋白原结合肽)产生比4号树状聚合物 (每个树状聚合物具有四个纤维蛋白原结合肽)更快的凝结时间。在~0.02-0.5mg/ml范围 内，12号树状聚合物(每个树状聚合物具有五个纤维蛋白原结合肽）引起几乎瞬间凝结。在 ~0.05-0.3mg/ml范围内，11号树状聚合物(每个树状聚合物具有四个纤维蛋白原结合肽） 也引起几乎瞬间凝结。
[0223] 据推断，随着每个树状聚合物的纤维蛋白原结合肽的数量增加，纤维蛋白原被本 发明的树状聚合物聚合的速度通常增加。
[0224] 实施例4
[0225] 纤维蛋白原结合肽定向和不同的纤维蛋白原结合肽序列对与纤维蛋白原共聚的 速度的影响
[0226] 为评估纤维蛋白原结合肽的定向是否会影响肽类树状聚合物与纤维蛋白原共聚 的能力，合成了包含三个连接到单个三官能团氨基酸残基(赖氨酸）的纤维蛋白原结合肽的 肽类树状聚合物(本文称为'三分支'树状聚合物），但是其中一个纤维蛋白原结合肽定向为 其氨基末端连接到分支核心，并且在其羧基末端酰胺化。还试验了包含不同的纤维蛋白原 结合肽序列的肽类树状聚合物与纤维蛋白原共聚的能力。
[0227] 3和10号肽类树状聚合物的纤维蛋白原结合肽各自具有序列GPRPG(SEQ ID N0: 15)。10号肽类树状聚合物的每个纤维蛋白原结合肽定向为其羧基末端连接到分支核心。3 号肽类树状聚合物的一个纤维蛋白原结合肽定向为其氨基末端连接到分支核心。该肽的羧 基末端包含酰胺基团。
[0228] 8号肽类树状聚合物的两个纤维蛋白原结合肽具有序列GPRPG(SEQ ID N0:15)，并 且第三个纤维蛋白原结合肽具有序列APFPRPG(SEQ ID NO: 14)，定向为其氨基末端连接到 分支核心。该肽的羧基末端包含酰胺基团。
[0229] 9号肽类树状聚合物的两个纤维蛋白原结合肽具有序列GPRPFPA(SEQ ID N0:3)， 并且第三个纤维蛋白原结合肽具有序列APFPRPG(SEQ ID NO: 14)，定向为其氨基末端连接 到分支核心。该肽的羧基末端包含酰胺基团。
[0230] 序列GPRPG(SEQ ID勵：15)与纤维蛋白原的孔洞、'和孔洞'13'结合，但是对孔洞 ' a '有一定优先。序列GPRPFPA( SEQ ID NO: 3)对纤维蛋白原中的孔洞' a'以高优先结合。序 列Pro-Phe-Pro稳定肽链的骨架并增强把手-孔洞相互作用的亲和力（Stabenf eld等， BL00D，2010,116:1352-1359)。
[0231 ]对于浓度范围为0.005-0.5mg/ml的每种树状聚合物而言，使用实施例2中描述的 相同方法评估树状聚合物与纤维蛋白原共聚的能力。图3示出了增加每种不同树状聚合物 的浓度获得的凝结时间（按秒计)的曲线图。
[0232]结果显示改变三分支树状聚合物的一个纤维蛋白原结合肽的定向，使得所述肽定 向为其氨基末端连接到分支核心（即，3号树状聚合物），降低了树状聚合物与纤维蛋白原共 聚的能力（比较3号树状聚合物的凝结时间与10号树状聚合物的凝结时间）。然而，在较高的 纤维蛋白原浓度下，3号树状聚合物能够与纤维蛋白原共聚(数据未示出）。
[0233]具有定向为其氨基末端连接到分支核心的不同序列的纤维蛋白原结合肽的三分 支树状聚合物能够与纤维蛋白原共聚(参见8号树状聚合物的结果）。
[0234] 其中两个纤维蛋白原结合肽包含优先与纤维蛋白原中的孔洞'b'结合的序列（序 列GPRPFPA(SEQIDN0:3))，这些肽定向为其羧基末端连接到分支核心，而另一个肽包含定 向为其氨基末端连接到分支核心的反向序列（即序列APFPRPG(SEQIDN0 :14))的三分支树 状聚合物(9号树状聚合物)在与纤维蛋白原的共聚中极具活性。
[0235] 实施例5
[0236]具有不同纤维蛋白原结合肽序列的肽类树状聚合物与纤维蛋白原共聚的能力 [0237] GPRPG(SEQIDN0:15)和GPRPFPA(SEQIDN0:3)基序主要与纤维蛋白原上的'a' 孔洞结合。该实施例描述了对嵌合肽类树状聚合物（即具有连接到相同分支核心的不同纤 维蛋白原结合肽序列的肽类树状聚合物)与纤维蛋白原共聚的能力的评估。
[0238] 13号肽类树状聚合物是嵌合四分支肽类树状聚合物，其包含两个具有序列6卩1?^- (SEQ ID NO: 15)的纤维蛋白原结合肽(对'a'孔洞具有结合优先）和两个具有序列GHRPY-(SEQ ID N0:11)的纤维蛋白原结合肽(优先结合'b'孔洞）。11和12号非嵌合肽类树状聚合 物分别为四臂和五臂肽类树状聚合物。这些树状聚合物的每个纤维蛋白原结合肽均具有序 列GPRPG-(SEQ ID勵：15)。11、12和13号树状聚合物的每个纤维蛋白原结合肽均在其羧基 末端连接到分支核心。
[0239]对于浓度范围为0.005-0.5mg/ml的每种树状聚合物而言，使用实施例2中描述的 相同方法评估树状聚合物与纤维蛋白原共聚的能力。图4示出了增加每种不同树状聚合物 的浓度获得的凝结时间（按秒计)的曲线图。
[0240]结果显示使用嵌合树状聚合物的凝结速度比在低于0.3mg/ml浓度下的非嵌合树 状聚合物更慢。然而，图5示出了使用不同树状聚合物获得的水凝胶的照片。凝胶标记有所 用肽类树状聚合物的编号（11、12和13)，并且"P"标记使用其中几个纤维蛋白原结合肽连接 到可溶性人血清白蛋白的产品所形成的水凝胶。与使用11和12号树状聚合物(在3mg/ml纤 维蛋白原或更高浓度的纤维蛋白原下）形成的水凝胶相比，用嵌合树状聚合物形成的水凝 胶更致密并且含有更少的流体。因此，虽然使用嵌合树状聚合物的凝结时间更慢，但使用这 种树状聚合物形成的水凝胶更致密。
[0241] 实施例6
[0242] 肽类树状聚合物和肽偶联物的混合物与纤维蛋白原共聚的能力 [0243]序列GPRP_(SEQ ID N0:1)的纤维蛋白原结合肽强烈且优先地与纤维蛋白原的'a' 孔洞结合(Laudano等，1978PNAS 7SK1号肽偶联物包含两个具有该序列的纤维蛋白原结合 肽，各自连接到赖氨酸残基。第一肽的羧基末端通过接头连接到赖氨酸残基，而第二肽在其 氨基末端通过接头连接到赖氨酸残基。第二肽的羧基末端包含酰胺基团。
[0244] 序列GHRPY_(SEQ ID N0:11)的纤维蛋白原结合肽强烈且优先地与纤维蛋白原的 'b'孔洞结合（Doolittle和Pandi，Biochemistry 2006，45,2657-2667)。2号肽偶联物包含 具有该序列的第一纤维蛋白原结合肽，在其羧基末端通过接头连接到赖氨酸残基。具有反 向序列(YPRHG(SEQ ID N0:16))的第二纤维蛋白原结合肽在其氨基末端通过接头连接到赖 氨酸残基。第二肽的羧基末端包含酰胺基团。
[0245] 接头允许肽延伸相互远离。
[0246] 1或2号肽偶联物(2mg/ml)与3或4号肽类树状聚合物和纤维蛋白原混合，并且对于 浓度范围为0.025-0.5mg/ml的每种树状聚合物而言，使用实施例2中描述的相同方法评估 混合物与纤维蛋白原共聚的能力。图6示出了增加每种不同树状聚合物的浓度获得的凝结 时间（按秒计)的曲线图。
[0247] 结果显示，令人惊讶的是，仅含2号肽偶联物（即含B-把手肽)和树状聚合物肽的混 合物有协同且增加的活性，而含1号肽偶联物(A-把手肽)的混合物在添加到2号肽偶联物或 肽类树状聚合物中时无活性。
[0248] 实施例7
[0249]肽类树状聚合物使人血浆中的纤维蛋白原聚合的能力
[0250] 试验了几种不同的肽类树状聚合物(4、5、8、9、10、11、12、13号)与人血浆中的纤维 蛋白原聚合的能力。
[0251] 在37°C下向1 OOyL人血浆中添加 30yL的每种树状聚合物(浓度为0.25mg/ml)，并使 用Sigma Amelung KC4Delta凝固分析仪测定纤维蛋白原的聚合。
[0252] 图7示出了每种树状聚合物的凝结时间，并且显示10、11、4、12和13号肽类树状聚 合物能够使人血浆中的纤维蛋白原聚合，其中12号树状聚合物特别有效(凝结时间小于1 秒）。然而，5、8和9号肽类树状聚合物不能使人血浆中的纤维蛋白原聚合。
[0253] 实施例8
[0254] 灭菌对即用型肽类树状聚合物制剂的影响
[0255] 该实施例描述了 γ辐射对用水合明胶配制成即用型糊剂的肽类树状聚合物的止 血活性的影响。
[0256] 将2ml的12或13号肽类树状聚合物溶液与SURGIFL0止血基质（水合可流动明胶基 质）混合以形成每种肽的糊剂。每种糊剂通过用剂量为30kGy的 6()C〇 γ射线灭菌，然后在室温 下储存。在储存2和4周后灭菌糊剂的样品用于试验。
[0257] 储存后，使用10mM HEPES缓冲剂从每种糊剂中萃取肽类树状聚合物。向100yL的 3mg/ml的人纤维蛋白原中添加各30yL的萃取物(肽浓度为约0.25mg/ml)，并且使用Sigma Amelung KC4Delta凝固分析仪测定37°C下每种树状聚合物使纤维蛋白原聚合的能力（'凝 结'活性）。还测定了未经辐照的对照样品的聚合活性。结果总结于下表中。
[0259]结果显示用水合明胶配制成即用型糊剂的本发明的肽类树状聚合物在通过辐射 灭菌后保持使纤维蛋白原聚合的能力。
【主权项】
1. 一种肤类树状聚合物，其包含分支核屯、和多个与所述分支核屯、单独共价连接的纤维 蛋白原结合肤，其中所述分支核屯、包含： 2至10个多官能团氨基酸残基，其中每个纤维蛋白原结合肤与所述分支核屯、的多官能 团氨基酸残基单独共价连接； 多个多官能团氨基酸残基，其中一个或多个纤维蛋白原结合肤与所述分支核屯、的至少 两个相邻多官能团氨基酸残基中的每一个单独共价连接； 多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个纤维蛋白原结合肤与所述分支核屯、的至 少一个多官能团氨基酸残基单独共价连接； 多个多官能团氨基酸残基，其中两个或更多个多官能团氨基酸残基通过相邻多官能团 氨基酸残基的侧链共价连接;或 单个多官能团氨基酸残基，并且纤维蛋白原结合肤与所述多官能团氨基酸残基的每个 官能团单独共价连接； 其中所述多官能团氨基酸残基包含=或四官能团氨基酸残基，或=和四官能团氨基酸 残基，或所述单个多官能团氨基酸残基为=或四官能团氨基酸残基。2. 根据权利要求1所述的肤类树状聚合物，其中所述分支核屯、包含多个连续的多官能 团氨基酸残基。3. 根据权利要求1或2所述的肤类树状聚合物，其中所述分支核屯、包含多达10个多官能 团氨基酸残基。4. 根据权利要求2所述的肤类树状聚合物，其中所述多官能团氨基酸残基或所述多个 多官能团氨基酸残基包含赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺 或半脫氨酸残基。5. 根据前述任何权利要求沁苗乂4*甘曰右?下列通式Q ): 其中： FBP为纤维蛋白原结合肤； -(接头)-为任选接头，优选为非肤接头； X为=官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷 胺、谷氨酷胺或半脫氨酸残基； Y为-FBP或-畑2; Z在Y为-FBP时为-(接头）-FBP，或在Y为-N此时为-[-Xn-(接头）-FBP ] a-(接头）-FBP，或 在 Y为-FBP时为-[-Xn-(接头)-FBP ] a-(接头)-FBP; 其中： Xn为=官能团氨基酸残基，优选为赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酷 胺、谷氨酷胺或半脫氨酸残基;并且 a 为 1-10,优选 1-3。6. 根据前述任何权利要求所述的肤类树状聚合物，其具有下列通式(II):其中： FBP为纤维蛋白原结合肤； -(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH(Ofc)SCO-; Y为-FBP或-畑2; Z：其中R为-(C出)4畑-、-(C出)3畑-或-(C出)3NHCNHNH。7. 根据前述任何权利要求所述的肤类树状聚合物，其具有下列通式(III): 在 Y为 _FBpW* 斗*-〇_/"+去'、1、-C'DD TTtt 在Y为-N吐 在Y为-N吐 在Y为-N吐 在Y为-F团 其中：FBP为纤维蛋白原结合肤； -(接头)-为任选接头，其优选地包含-NH (C出)5C0-; Y为-FBP或-畑2; Z：在Y为-FBP时，为-(C出)4畑-(接头)-FBP;或 在Y为-Nt 在Y为-W 在Y为-Nt 在Y为-巧8. 根据前述任何权利要求所述的肤类树状聚合物，其中所述纤维蛋白原结合肤优先于 纤维蛋白原的孔桐' b '与纤维蛋白原的孔桐' a '结合。9. 根据权利要求1-7中任一项所述的肤类树状聚合物，其中所述纤维蛋白原结合肤优 先于纤维蛋白原的孔桐' a '与纤维蛋白原的孔桐' b '结合。10. 根据前述任何权利要求所述的肤类树状聚合物，其中每个纤维蛋白原结合肤通过 非肤接头与所述分支核屯、连接。11. 根据权利要求10所述的肤类树状聚合物，其中所述接头包含直链接头，优选直链烧 基。12. 根据权利要求11所述的肤类树状聚合物，其中所述接头包含:-NH (C此)nCO-，其中n 为1-10。 13 ^|^?1前冰化缸妨壬||巧光醉冰的化米协伴巧各物1甘末包今1;1 了娃输.14. 根据前述任何权利要求所述的肤类树状聚合物，其包含不同序列的纤维蛋白原结 合肤。15. -种包含多个载体的试剂，其中每个载体具有多个连接到所述载体的纤维蛋白原 结合肤，并且其中连接到所述载体的所述纤维蛋白原结合肤包含不同序列的纤维蛋白原结 合肤。16. 根据权利要求15所述的试剂，其中所述多个载体包含第一多个载体和第二多个载 体，并且其中连接到所述第一多个载体的所述纤维蛋白原结合肤具有与连接到所述第二多 个载体的所述纤维蛋白原结合肤不同的序列。17. 根据权利要求15所述的试剂，其中每个载体具有与之连接的不同序列的纤维蛋白 原结合肤。18. 根据权利要求14所述的肤类树状聚合物，或根据权利要求15-17中任一项所述的试 剂，其中不同序列的所述纤维蛋白原结合肤具有优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与孔桐'a'结 合的不同选择性。19. 根据权利要求14或18所述的肤类树状聚合物，或根据权利要求15-18中任一项所述 的试剂，其中不同序列的所述纤维蛋白原结合肤包含优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与纤维 蛋白原的孔桐'a'结合的第一纤维蛋白原结合肤，和W比所述第一纤维蛋白原结合肤更高 的选择性优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与纤维蛋白原的孔桐'a'结合的第二纤维蛋白原结 合肤。20. 根据权利要求19所述的肤类树状聚合物或试剂，其中所述第一纤维蛋白原结合肤 包含在其氨基末端的氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO: 1)。21. 根据权利要求19或20所述的肤类树状聚合物或试剂，其中所述第二纤维蛋白原结 合肤包含在其簇基末端的氨基酸序列-APFPRPG(SEQ ID NO: 14)。22. 根据权利要求14或18所述的肤类树状聚合物，或根据权利要求15-18中任一项所述 的试剂，其中不同序列的所述纤维蛋白原结合肤包含优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与纤维 蛋白原的孔桐'a'结合的第一纤维蛋白原结合肤，和优先于纤维蛋白原的孔桐'a'与纤维蛋 白原的孔桐'b'结合的第二纤维蛋白原结合肤。23. 根据权利要求22所述的肤类树状聚合物或试剂，其中所述第一纤维蛋白原结合肤 包含在其氨基末端的氨基酸序列GPRP-(SEQ ID NO: 1)。24. 根据权利要求22或23所述的肤类树状聚合物或试剂，其中所述第二纤维蛋白原结 合肤包含在其氨基末端的氨基酸序列G皿P-(SEQ ID顯：10)，优选氨基酸序列6皿?￥-(560 ID N0:11)。25. -种组合物，其包含根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物和 包含两个或更多个纤维蛋白原结合肤的肤偶联物。26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述肤偶联物是根据权利要求1-14或18-24中 任一项所述的肤类树状聚合物。27. 根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述肤类树状聚合物的所述纤维蛋白原 结合肤优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与纤维蛋白原的孔桐'a'结合，并且所述肤偶联物的所 述纤维蛋白原结合肤优先于纤维蛋白原的孔桐'a'与纤维蛋白原的孔桐'b'结合。28. 根据权利要求25或26所述的组合物，其中所述肤类树状聚合物的所述纤维蛋白原 结合肤优先于纤维蛋白原的孔桐'a'与纤维蛋白原的孔桐'b'结合，并且所述肤偶联物的所 述纤维蛋白原结合肤优先于纤维蛋白原的孔桐'b'与纤维蛋白原的孔桐'a'结合。29. -种药物组合物，其包含根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合 物，根据权利要求15-24中任一项所述的试剂或根据权利要求25-28中任一项所述的组合物 及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。30. 根据权利要求29所述的药物组合物，其为即用型止血制剂，其中所述药学上可接受 的载体、赋形剂或稀释剂包含水合明胶。31. 根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24 中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物，其无菌。32. -种为根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求 15-24中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物灭菌的方法，其包 括将所述肤类树状聚合物或组合物暴露于丫福射，优选高达30kGy。33. -种使纤维蛋白原聚合的方法，其包括使纤维蛋白原与根据权利要求1-14或18-24 中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24中任一项所述的试剂或根据权利要 求25-30中任一项所述的组合物接触。34. -种用于形成水凝胶的试剂盒，其包含根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的 肤类树状聚合物，根据权利要求15-24中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项 所述的组合物和单独地，纤维蛋白原。35. -种水凝胶，其包含根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物， 根据权利要求15-24中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物与 纤维蛋白原的共聚物。36. -种治疗出血或治疗伤口的方法，其包括向出血部位或向伤口施用根据权利要求 1-14或17-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24中任一项所述的试剂或 根据权利要求25-30中任一项所述的组合物。37. 根据权利要求36所述的方法，其包括向所述出血部位或向所述伤口施用纤维蛋白 原和所述肤类树状聚合物、纤维蛋白原和所述试剂、或纤维蛋白原和所述组合物。38. 根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24 中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物，其用作药剂。39. 根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24 中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物，其用于治疗出血或用 于治疗伤口。40. 根据权利要求1-14或18-24中任一项所述的肤类树状聚合物，根据权利要求15-24 中任一项所述的试剂或根据权利要求25-30中任一项所述的组合物在制备用于治疗出血或 用于治疗伤口的药剂中的用途。
【文档编号】A61K47/48GK105916524SQ201580004811
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2015年1月8日
【发明人】R·兹博兹茵
【申请人】哈莫斯塔蒂斯有限公司