猪圆环病毒2型灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供猪圆环病毒2型灭活疫苗及其制备方法，涉及生物制药领域。该疫苗含有0.01?2mg/mL左旋咪唑、0.05～20 mg/mL紫苏提取物、0.03?20mg/mL杨树花提取物。本发明还提供所述疫苗的制备方法，将左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物溶解于灭活的猪圆环病毒2型病毒液中，然后与吐温?80混合均匀，得到水相溶液；将白油与司盘?80混合均匀，得到油相溶液；将水相溶液与油相溶液混合、乳化。本发明灭活疫苗制备方法简单方便、成本低，该疫苗中的左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物，能够显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，提高抗体水平，显著延长动物机体抗体产生持续期。
【专利说明】
猪圆环病毒2型灭活疫苗及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)具有单链环状DNA基因组，二十面体，表面无囊膜，病毒粒子直径在12_23nm。猪圆环病毒2型(PCV2)感染是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要原因，该病主要发生于断奶保育猪阶段，病猪主要表现为生长发育不良、贫血、呼吸困难、腹泻、淋巴结肿大、增重迟缓、衰弱等临床症状。由于该病是免疫抑制疾病，机体防御免疫功能降低，致使临床上与其他疾病共同发生，产生所谓的综合征，如:断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎-肾病综合征。PCV2常与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRS)或猪细小病毒(PPV)并发感染或并发细菌感染，病猪病情加重，死亡率升高。中国于2000年首次报道PCV2以来，该病毒在猪场中感染率迅速上升，给中国养猪业造成巨大的经济损失，急需采取防治措施控制该病毒的传播。
[0003]迄今为止，试验表明疫苗预防是防治本病的主要措施，但在临床应用中发现，现有PCV2疫苗免疫后，动物机体抗体产生窗口期长，在此期间无法抵御PCV2病毒入侵，另外常规疫苗免疫后动物机体产生的抗体水平不够高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型灭活疫苗，该疫苗含有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物，能够显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，提高抗体水平，显著延长动物机体抗体产生持续期。
[0005]本发明的另一目的是提供猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法，该方法简单方便，低成本。
[0006]本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0007]猪圆环病毒2型灭活疫苗，含有0.01-211^/1^的左旋咪唑、0.05?20 mg/mL的紫苏提取物、0.03-20mg /mL的杨树花提取物。
[0008]优选的技术方案中，所述猪圆环病毒2型灭活疫苗的剂型为油乳剂。
[0009]本发明还提供所述灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤:
(1)将左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物溶解于灭活的猪圆环病毒2型病毒液中，然后与吐温-80混合均匀，得到水相溶液；
(2)将白油与司盘-80混合均匀，得到油相溶液；
(3)将所述水相溶液与油相溶液混合、乳化，得到所述灭活疫苗。
[0010]优选的技术方案中，步骤(I)中加入了左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的猪圆环病毒2型病毒液与吐温的体积比为96:1_6。
[0011]优选的技术方案中，步骤(2)中白油与司盘-80的体积比为96:1-6。
[0012]优选的技术方案中，步骤(3)中所述水相溶液与油相溶液的体积比为1:1-3。
[0013]本发明猪圆环病毒2型灭活疫苗含有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物，能够显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，提高抗体水平，显著延长动物机体抗体产生持续期。通过实验发现，仅含有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物中单一成分的灭活疫苗，并不能产生上述效果，因此，本发明灭活疫苗中左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物存在协同增效作用。本发明猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法，该方法简单方便，低成本。
【附图说明】
[0014]图1:不同时间点试验猪血清抗体水平，纵坐标是OD630。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。
[0016]本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。
[0017]实施例1制备猪圆环病毒2型灭活疫苗 I.实验材料
左旋咪唑购自SIGMA公司。紫苏提取物(其中紫苏多糖含量不低于30%)购自汉中天然谷生物科技股份有限公司。杨树花提取物(其中黄酮含量不低于30%，多糖含量不低于20%)购自南京泽朗医药科技有限公司。
[0018]2.疫苗制备
灭活疫苗A配制方法如下:
(I)制备水相溶液:将灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0019](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0020](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗A。
[0021 ]灭活疫苗B配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)中添加终浓度为2.5mg/mL的左旋咪唑，此处终浓度是指添加有左旋咪唑的病毒液中左旋咪唑的终浓度。将添加有左旋咪唑的病毒液与吐温-80按体积比96: 4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0022](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0023](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗B。
[0024]灭活疫苗C配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)中添加终浓度为25mg/mL的紫苏提取物。将添加有紫苏提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0025](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合，高压灭菌，制成油相溶液。
[0026](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗C。
[0027]灭活疫苗D配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)添加终浓度为30mg/mL的杨树花提取物。将添加有杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0028](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制得成油相溶液。
[0029](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗D。
[0030]灭活疫苗E配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价ΙΟ6' 5TCID/mL)中添加终浓度为0.03mg/mL的左旋咪唑、0.3mg/mL紫苏提取物和0.lmg/mL杨树花提取物。然后将添加有左旋咪唑、紫苏提取物、杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0031 ] (2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0032](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗E。
[0033]灭活疫苗F配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106.5TCID/mL)中添加终浓度为2.5mg/mL的左旋咪唑、25mg/mL的紫苏提取物和30mg/mL的杨树花提取物。将添加有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0034](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0035](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗F。
[0036]灭活疫苗G配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)中添加终浓度为6mg/mL的左旋咪唑、50mg/mL紫苏提取物和60mg/mL的杨树花提取物。将添加有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0037](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0038](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合乳化后，得油乳剂型灭活疫苗G。
[0039]灭活疫苗H配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)中添加终浓度为0.03mg/mL的左旋咪唑、25mg/mL的紫苏提取物和60mg/mL的杨树花提取物。将添加有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0040](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。[0041 ] (3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗H。
[0042]灭活疫苗I配制方法如下:
(I)制备水相溶液:在灭活的猪圆环病毒2型病毒液(毒株:PCV2 NJ株，灭活前毒价106'5TCID/mL)中添加终浓度为6mg/mL的左旋咪唑、25mg/mL的紫苏提取物和0.1mg/mL的杨树花提取物。将添加有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的病毒液与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0043](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0044](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗I。
[0045]空白疫苗J配制方法如下:
(I)制备水相溶液:将MEM培养基与吐温-80按体积比96:4混合均匀，无菌处理，制成水相溶液。
[0046](2)制备油相溶液:将白油和司盘-80按体积比96:4混合均匀，高压灭菌，制成油相溶液。
[0047](3)将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合、乳化，得油乳剂型灭活疫苗J。
[0048]3.疫苗的理化性质检查结果
对刚制备好的疫苗A-J进行理化性质检查，结果如下:疫苗A-J外观为白色乳状，油乳剂型。将疫苗A-J滴于冷水表面，不扩散，呈规则圆形。将疫苗A-J置37°C条件下，21d内疫苗不分层，不破乳。将疫苗A-J在3000r/min离心15min，疫苗不分层，不破乳。用ImL吸管(内径约为1.2mm)在25°C室温下吸满Iml疫苗，垂直放出在3s流出0.4mL以上，适用于注射。将疫苗A-J无菌接种到液体LB培养基中，于370C摇床中培养24h，培养基澄清无细菌生长;再转接2次，无细菌生长。
[0049]实施例2猪圆环病毒2型灭活疫苗的免疫效果 I.实验材料
4周龄试验猪购自镇江市丹徒区云立牧业有限公司，PCV2抗原、抗体检测均为阴性。
[0050]猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒(间接法)，购自武汉科前生物制品有限公司。
[0051 ] 2.实验动物分组、免疫及检测
将50头4周龄健康试验猪(PCV2抗原、抗体阴性)随机分为10组，每组各5头。将实施例1制备的猪圆环病毒2型灭活疫苗A、B、C、D、E、F、G、H、I各免疫一组试验猪，免疫途径为颈部肌肉注射，免疫剂量2mL/头，对照组试验猪注射同等剂量的疫苗J。在免疫前测量体温，免疫后7天内每天定时测量体温。免疫后14天内每天观察猪群的采食情况，触摸疫苗接种位置，观察有无肿块。免疫后于第14天、21天、28天、60天、90天、120天、150天、180天对各组试验猪采血，无菌分离血清，采用猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒检测血清中PCV2抗体水平，当OD630大于0.42时，血清抗体效价合格。
[0052]测定了免疫前和免疫后试验猪的体温情况，免疫前后体温无上升的情况;疫苗免疫位置无肿块。免疫后每个时间点经试验猪前腔静脉采血，无菌分离血清，用武汉科前圆环病毒2型抗体检测试剂盒(间接法)进行检测，检测结果OD63q大于0.42为阳性。计算每组试验猪的几何平均抗体效价，比较不同疫苗之间的免疫效果(见图1)。免疫后14d，含有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的灭活疫苗E-1免疫组试验猪的抗体水平比疫苗A免疫组试验猪高至少5倍以上，且高于疫苗A免疫组试验猪在免疫后第4周的合格抗体水平。含有左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物中单一组分的灭活疫苗B、C和D的免疫效果与疫苗A相似。含左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的灭活疫苗能将免疫窗口期缩短至免疫后2周。左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物能显著提高PCV2灭活疫苗免疫后的抗体效价，大于左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物中单一组分对PCV2灭活疫苗的抗体效价提升之和，也就是说左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物之间产生了协同增效作用。含左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的灭活疫苗免疫后4周，试验猪抗体水平达到顶点，且疫苗E-J免疫组之间的几何平均抗体水平效价相当，均高于疫苗A免疫组的抗体水平，亦高于含左旋咪唑、紫苏提取物、杨树花提取物中单一组分的疫苗免疫组抗体水平。免疫后21d-180d，疫苗E-J免疫组试验猪的几何平均抗体水平OD63q持续维持在1.7以上，至试验结束(免疫后6个月)没有明显下降的趋势。而含有左旋咪唑、紫苏提取物、杨树花提取物中单一组分的疫苗、疫苗A免疫组免疫后，抗体水平达到顶点后均明显下降，且仅在28天左右达到抗体合格水平。
[0053]上述试验结果表明:不同剂量的左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物复配能够显著提高PCV2灭活疫苗的免疫效果，具有明显的免疫增强作用，与常规疫苗(疫苗A)相比，能显著缩短疫苗免疫窗口期，延长抗体持续期，提高抗体水平。结果提示:左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的配伍使用具有明显的协同增效作用。
【主权项】
1.猪圆环病毒2型灭活疫苗，其特征在于含有0.01-2mg/mL的左旋咪唑、0.05?20mg/mL的紫苏提取物、0.03-20mg /mL的杨树花提取物。2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型灭活疫苗，其特征在于所述猪圆环病毒2型灭活疫苗的剂型为油乳剂。3.权利要求1或2所述灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤: (I)将左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物溶解于灭活的猪圆环病毒2型病毒液中，然后与吐温-80混合均匀，得到水相溶液； (2 )将白油与司盘-80混合均匀，得到油相溶液； (3)将所述水相溶液与油相溶液混合、乳化，得到所述灭活疫苗。4.根据权利要求3所述灭活疫苗，其特征在于:步骤(I)中加入了左旋咪唑、紫苏提取物和杨树花提取物的猪圆环病毒2型病毒液与吐温的体积比为96:1-6。5.根据权利要求4所述灭活疫苗，其特征在于:步骤(2)中白油与司盘-80的体积比为96:1-6。6.根据权利要求5所述灭活疫苗，其特征在于:步骤(3)中所述水相溶液与油相溶液的体积比为1:1-3。
【文档编号】A61K39/39GK105920595SQ201610462360
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】于晓明, 郑其升, 陈瑾, 侯立婷, 李鹏成, 乔绪稳, 程海卫, 侯继波
【申请人】江苏省农业科学院