一种复合细胞外基质成分生物材料的制作方法

文档序号:10560270阅读:903来源:国知局
一种复合细胞外基质成分生物材料的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合细胞外基质成分生物材料,以脱细胞小肠粘膜下层SIS为中间层,脱细胞膀胱粘膜层基底膜UBM为上下表层;所述上下表层完全包覆中间层形成三明治结构。本发明综合了UBM和SIS的优点:UBM隔绝SIS的免疫原性及其与宿主组织的直接接触,植入后的宿主?材料交界区炎症反应基本类型与单纯UBM相同,组织相容性高;另一方面,SIS能弥补UBM力学强度低的缺点,且SIS制备方便、拼接后厚度可变;可应用于填充、加强、修复或重建筋膜、脑膜、胸膜、盆底、真皮、实质脏器等各种软组织缺损,具备良好的临床实用性。
【专利说明】
-种复合细胞外基质成分生物材料
技术领域
[0001] 本发明属于组织修复材料领域,特别设及一种复合细胞外基质成分生物材料。
【背景技术】
[0002] 脱细胞基质生物材料(Acellular Tissue Ma化ix,ACTM)是近二十年来软组织修 复材料研究的重要进展。即运用物理或化学方法脱去组织中的所有细胞、抗原、脂质、可溶 性蛋白质等物质、保留下的具有完整外观形态、组织学特性及超微结构的不溶性细胞外基 质巧xtracellular Matrix,ECM)作为生物支架。ECM是生物进化过程中高度保守的部分,不 同种属间相同组织内ECM差异小,经脱细胞技术去除引起免疫排斥反应的细胞成分和抗原 后的ACTM是能够安全的异种异体移植的。与合成材料的引发慢性炎症刺激,导致纤维细胞 包裹癒痕修复的机理不同,ACTM可W诱导"内源性组织再生":植入后其内所含的生物信号 或降解产物可W诱导修复区周围巨隧细胞和干细胞主动、快速浸润,生长、增殖并分泌自身 细胞外基质替代植入物。随着宿主组织的长入,ACTM逐步降解,两者基本同步,最终ACTM完 全被宿主组织代替。因此,ACTM作为组织修复材料具有较多优势:①结构和组分接近自然组 织:主要成分是胶原纤维等结构蛋白,和少量糖蛋白、纤粘蛋白、糖胺聚糖和蛋白多糖类、生 长因子与酶类等;②ACTM有良好的可降解性和降解速率可控性,降解更符合再生规律;③ ACTM具有一定的孔隙率,便于组织间的营养和物质空气的交换;④ACTM具有一定的机械强 度能够对组织的生长起到支持作用。⑤具备一定的耐受感染能力,可W用在伴有污染或潜 在感染的组织缺损,因为其可W实现吞隧细胞早期进入、早期局部快速再血管化,细菌生物 膜难W形成。
[0003] ACTM目前已临床应用于替代脑膜、胸膜、腹壁筋膜等,吻合口加强、盆底重建、膀脫 悬吊、肝脾等实质脏器破损填塞止血W及各种复杂痛和腹壁缺损的治疗如伴有污染的腹壁 缺损、合成补片植入后感染、肠擾二次手术治疗等。据统计,在美国ACTM的用量已占到软组 织修复材料的5~10%。根据组织来源的不同生物补片可大体分为两类:①惰性组织(Ined tissue, IT)源产品,W人尸/猪的真皮、牛/猪/马的屯、包、牛/猪的腹膜等为代表。来源组织 属机体内生物惰性组织,成分几乎仅为结构蛋白(胶原纤维和弹力纤维),无粘连蛋白、生长 因子和蛋白聚糖类等生物活性成分。②ECM源生物材料,其拥有完整的活体组织细胞外基质 的Ξ维超微结构和粘连蛋白类、生长因子类、糖胺聚糖类等生物活性成分。运类产品W小肠 粘膜下层(Small Intestinal Submucosa, SIS)、人羊膜、膀脫粘膜层基底膜(UrinaiT Bladder Ma化ix,UBM)等为代表。ECM生物材料的制备技术(包括脱细胞处理和成型工艺)较 IT源产品更复杂但ECM生物材料较IT源产品拥有更多修复组织缺损的优势:① IT源产品仅 能诱导血管化的结缔组织再生填充组织缺损、实现解剖层面的修复,而ECM生物材料植入后 可与宿区有效整合,主动吸引自体干细胞迁入损伤处并促进增殖和分化而实现部分程度的 特异性、功能性修复,如实现肌肉筋膜等组织再生和神经支配部分恢复而改善残疾肢体功 能和指尖再造。②IT源产品结构致密,含有大量降解缓慢且人体25岁后不能再生的弹性纤 维,导致修复区远期不稳定,易失弹性。③ECM生物材料较IT源产品更耐受感染、组织再生速 度更快。
[0004] SIS来源于哺乳动物小肠,是机械除去小肠肌层和浆膜层后经脱细胞处理而得。 SIS主要由I、虹型胶原组成,含有少量的IV、V型胶原,糖胺聚糖、生长因子、纤连蛋白等,植 入体内后可完全降解,是组织工程良好的支架材料。SIS具有良好的力学强度,原材料来源 广泛,预处理较为简便或借助机器实现自动化处理。但SIS的生物活性相对较低,且由于其 在活体环境中可能接触到食物中各种抗原而致其带有较高的初始生物负载,虽然经过严格 的脱细胞、灭菌等处理仍具有一定的免疫原性(可能的内毒素、Gal抗原表位等残留),引起 宿主免疫反应。
[0005] 中国专利CN2608014公开了一种兼有硬膜和蛛网膜功能的人造硬脑膜,在人羊膜 层上粘合小肠粘膜下层,具有人体硬脑膜的机械抗张能力和蛛网膜防粘连的双重功能。但 运一制备方法没有完全隔绝SIS的免疫原性。
[0006] 中国专利CN101366979公开了一种组织补片及其制备方法,W脱细胞小肠粘膜下 层为内层,两面包裹覆有脱细胞羊膜所构成。W脱细胞羊膜隔绝了脱细胞小肠粘膜下层的 免疫毒性,而脱细胞小肠粘膜下层补偿了脱细胞羊膜的机械强度不足,具有较高的生物活 性和组织相容性,无明显免疫排斥反应,对细胞无毒性。但羊膜为人源性材料,来源难W控 审IJ,存在传播未知病毒或疾病的风险。
[0007] UBM来源于哺乳动物膀脫,经机械方法除去浆膜、肌层、粘膜下层、粘膜肌层后脱细 胞处理所制得。与SIS相比,UBM具有如下优势:①极低免疫原性,高组织相容性:UBM在活体 内不接触细菌等生物负载,层次简单,且取材过程中可W做到无内毒素污染。②生物活性 高:UBM含完整基底膜结构和成分,可构成血管、皮肤等上皮组织细胞生长的支撑层,可W帮 助组织特异性细胞形成连续的片层、抑制瘤痕组织生成,有助于增强组织修复和伤口愈合 并实现缺损组织特异性的再生。应用Ma化istemUcell公司UBM产品)的患者开放性伤口愈 合时间由25.5周缩短至9.8周。其降解产物含有超过5000种活性成分,其中可W确证与组织 愈合相关的蛋白或多肤有4巧巾,包括神经营养、促血管新生、抑制肿瘤活性或其他与组织重 塑、伤口修复相关的成分(表1)。但在实际生产过程中,UBM的剥离需耗费大量人工,且机械 强度不足,表面光滑难W制成具有一定厚度的产品。
[000引表1 UBM降解产物活性成分
[0009]
[0010]


【发明内容】

[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种复合细胞外基质成分生物材料,该材料综 合了UBM和SIS的优点:UBM隔绝SIS的免疫原性及其与宿主组织的直接接触,植入后的宿主- 材料交界区炎症反应基本类型与单纯UBM相同,组织相容性高;另一方面,SIS能弥补UBM力 学强度低的缺点,且SIS制备方便、拼接后厚度可变;可应用于填充、加强、修复或重建筋膜、 脑膜、胸膜、盆底、真皮、实质脏器等各种软组织缺损,具备良好的临床实用性。
[0012] 本发明的一种复合细胞外基质成分生物材料,所述生物材料W脱细胞小肠粘膜下 层SIS为中间层,脱细胞膀脫粘膜层基底膜UBM为上下表层;所述上下表层完全包覆中间层 形成Ξ明治结构。
[0013] 所述SIS由哺乳动物小肠经机械方法除去浆膜层和肌层后脱细胞处理制得,为膜 片状材料。
[0014] 所述UBM由哺乳动物膀脫经机械方法除去浆膜、肌层、粘膜下层、粘膜肌层后脱细 胞处理制得,为膜片状材料。
[001引所述中间层的层数化~20层。
[0016] 所述上下表层的层数各为1~10层。
[0017] 所述中间层与上下表层间、中间层与上下表层内(即多层UBM间、多层SIS间)W医 用粘合剂、缝合捆扎、真空层压中的一种或几种方式固定。
[0018] 所述上下表层具有高生物活性,且有效隔绝中间层的免疫原性,不改变外层UBM的 宿主-材料交界区炎症反应类型。所述中间层可显著提高材料的力学强度与材料厚度。
[0019] 所述医用粘合剂为壳聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白胶、透明质酸、硫酸软骨素、水凝 胶、骨胶、明胶、果胶中的一种或几种。医用粘合剂、缝合线优选可吸收成分。
[0020] 所述真空层压的工艺参数为:真空压力为-50~-760mmHg,作用时间为0.5~72h。 [0021 ]所述生物材料还包括贯穿材料的孔桐。
[0022] 所述孔桐的直径为1~5mm,孔间距为0.5~5 cm。
[002;3] 有益效果
[0024] (1)高生物活性,组织粘连轻,无过量癒痕:表层UBM基底膜组织成分可W释放大量 支持和调控细胞生长分化等生命行为的活性因子,如碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、 肝细胞生长因子、角蛋白细胞生长因子等成分,促进细胞的黏附和迁移,诱导分化,减少调 亡;调控上皮细胞优先于成纤维细胞侵入并抑制过量纤维蛋白原渗出,在成纤维细胞占优 势前形成上皮组织,联合材料表面光滑的基底膜结构,减少粘连,抑制癒痕组织生成。
[0025] (2)高组织相容性、低免疫原性、不改变UBM的宿主-材料交界区炎症反应基本类 型:SIS被包裹在极低免疫原性的UBM中,保证植入初期无法直接接触到周围组织,延迟可能 引起免疫反应的成分释放,免疫反应类型和程度与单纯UBM植入相同。伴随UBM的降解,组织 同步长入,植入后期SIS的逐渐暴露将不再改变组织修复结果。贯穿整个材料的孔桐,加速 周围组织细胞长入,利于组织液流动,故血清肿等局部并发症发生率低。
[0026] (3)良好的力学强度,厚度可变,适应不同创面修复的需要。中间层可为材料整体 提升力学强度,且SIS的层数可W适当增减W适应不同力学需求的组织修复。医用粘合剂和 真空层压的联合使用增强了材料的剥离强度,保证多层材料水化或剪裁后的完整性,不易 松散。
[0027] (4)降低原料预处理难度,价格低廉:在兼顾UBM和SIS优势的同时,本发明可W大 幅度降低产量和生产周期限制因素-UBM的用量。降低材料成本,缩短生产周期,减少人力投 入。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明的结构示意图;其中,1为脱细胞小肠粘膜下层SIS,2为脱细胞膀脫粘 膜层基底膜UBM。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改,运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0030] 实施例1
[0031] WAbraham法制备猪源性脱细胞膀脫粘膜层基底膜(UBM)和脱细胞小肠粘膜下层 (SIS)。一层UBM铺平(光滑面向下),将单片膜状SIS按照层间错位50%的方式拼接为独立片 层,平铺于UBM表面,层间错位90°铺设4层。其上再铺设一层UBM(光滑面向上)。排除气泡,各 层间使用医用壳聚糖粘合剂粘合,再W-250mm化的压力经过24h将其压为一体。材料全层 打孔,孔间距为5mm,直径为1mm。
[0032] 实施例2
[0033] WAbraham法制备猪源性脱细胞膀脫粘膜层基底膜(UBM)和脱细胞小肠粘膜下层 (SIS)。两层UBM铺平(光滑面向下),将单片膜状SIS按照层间错位50%的方式拼接为独立片 层,平铺于UBM表面,层间错位90°铺设6层。其上再铺设两层UBM(光滑面向上)。排除气泡,各 层间使用医用胶原蛋白粘合剂粘合,再W-300mm化的压力经过36h将其压为一体。材料全 层打孔,孔间距为8mm,直径为2mm。
[0034] 实施例3
[0035] 根据GB/T528-2009,取3个样品制作成4cmXlcm的哑铃状,水化后用材料力学试验 机固定样品两端,W lOmm/min速度拉伸,测算材料抗张强度为34± 3N/cm。
[0036] 取3个样品制作成2cm X 5cm,两端固定在拉力机上下夹持器上,WlOmm/min稳定的 速度连续剥离,直到样品重叠部分分层。测量分层时负载力。SIS-SIS间、UBM-SIS间的剥离 强度为6±2N/cm,剥离维持力为l.5±0.5N/cm。
[0037] 根据GB/T 16886.5规定的方法评价材料细胞毒性。^^册了3和1^929为模式细胞。 W细胞培养基为浸提介质,W梯度浓度的浸提液替代培养基培养细胞,MTT法测定细胞存活 率。材料的细胞毒性为0~I级。
[0038] 细胞迁移实验:将材料低溫粉碎,蛋白酶酶解,酶解产物浓度为50yg/mL。细胞经饥 饿培养2地后,Boyden小室法测定化细胞迁移量,W含10%胎牛血清培养基和不含血清培养 基分别为阳性和阴性对照。修复材料细胞迁移量为2056 ± 72,阳性对照为2105 ± 35,阴性对 照为1328 ±65。材料组与阳性对照组无显著性差异(P〉0.05)。
[0039] 根据GB/T14233.2规定的方法检测材料内毒素含量。W内毒素检测用水为浸提介 质,37°C浸提24h。动态浊度法测定材料内毒素含量,复测稀释浸提液内毒素含量W排除干 扰。材料内毒素含量《祀U/装置。
[0040] 根据GB/T14233.2规定的方法测定材料血液相容性。接触组:大鼠背部脱毛,涂抹 浓度为50yg/mL的酶解产物,每天涂抹1次,连续涂抹20d;经口摄入组:7d内隔天口服ImL浸 提液,共摄入4次;肌肉注射组和静脉注射组:7d内隔天注射浓度为0.15mL浸提液,各注射4 次。分别于染毒第30天和90天两批处死动物,取静脉血用于测试。溶血率按下列公式计算: 溶血率(%) =(样品吸光度一阴性吸光度)/(阳性吸光度一阴性吸光度)X 100%。材料溶血 率《5%。
[0041] 根据GB/T 16886.10规定的方法评价材料皮内刺激性。于白兔皮内注射浸提液及 对照液(PBS)各0.2mL,于注射后15min,化,2d,3d观察实验区皮肤反应,根据红斑和水肿情 况打分。材料无刺激性。
[0042] 根据GB/T 16886.10规定的最大剂量法评价材料致敏性。纯淀粉溶液为阴性对照 组,经口灌胃,持续1周,停药后继续观察1周。每天记录大鼠体重,观察动物临床毒性体征, 记录毒性级别。实验结束后处死大鼠常规组织病理切片。材料无迟发型超敏反应。
[0043] 构建犬腹直肌前銷和腹直肌缺损动物模型,缺损面积为10 X5cm2,将复合软组织 修复材料裁剪至一定大小进行修复,W单纯SIS、单纯UBM为对照。单纯SIS对照组术后修复 区血清肿发生率为33%,单纯UBM和复合软组织修复材料组未发生血清肿。术后2周、1个月、 2个月、4个月取出修复区,组织切片经CD68、CCR7、CD163染色观察浸润细胞类型和密度,Ml/ M2巨隧细胞比例,证实材料不改变UBM的宿主-材料炎症反应基本类型,且组织修复效果与 纯UBM相近。
【主权项】
1. 一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述生物材料以脱细胞小肠粘膜 下层SIS为中间层,脱细胞膀胱粘膜层基底膜UBM为上下表层;所述上下表层完全包覆中间 层形成三明治结构。2. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述SIS由 哺乳动物小肠经机械方法除去浆膜层和肌层后脱细胞处理制得。3. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述UBM由 哺乳动物膀胱经机械方法除去浆膜、肌层、粘膜下层、粘膜肌层后脱细胞处理制得。4. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述中间层 的层数为1~20层。5. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述上下表 层的层数各为1~10层。6. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述中间层 与上下表层间、中间层与上下表层内以医用粘合剂、缝合捆扎、真空层压中的一种或几种方 式固定。7. 根据权利要求6所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述医用粘 合剂为壳聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白胶、透明质酸、硫酸软骨素、水凝胶、骨胶、明胶、果胶中 的一种或几种。8. 根据权利要求6所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述真空层 压的工艺参数为:真空压力为-50~-760mmHg,作用时间为0.5~72h。9. 根据权利要求1所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述生物材 料还包括贯穿材料的孔洞。10. 根据权利要求9所述的一种复合细胞外基质成分生物材料,其特征在于:所述孔洞 的直径为1~5mm,孔间距为0 · 5~5cm 〇
【文档编号】A61L27/40GK105920669SQ201610261472
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】张剑
【申请人】上海卓阮医疗科技有限公司
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