一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法和应用，所述脱细胞基质源组织工程支架是以处理后的动物膜材作为生物膜基材，在所述生物膜基材的表面粘附胶原蛋白疏松层。所述脱细胞基质源组织工程支架的制备方法包括脱脂、脱细胞、去除抗原、交联固定、胶原蛋白提取及胶原复合等工艺步骤。本发明选用柔韧而光滑的动物膜材作为生物膜基材，克服了单纯胶原支架力学性能差和降解速率过快的缺点；配合胶原蛋白疏松层，为组织再生性修复和细胞生长提供良好微环境；脱细胞基质源组织工程支架材料植入体内后，会随着缺损组织的修复而逐渐降解，且降解时间可控制，不作为永久异物存在，无任何残留毒性。
【专利说明】
一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是涉及一种脱细胞基质源组织工程支 架及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着组织工程学科和再生医学的发展，人们对组织工程技术所需要的支架材料展 开大量的研究，其中包括高分子材料、金属材料、生物陶瓷、异种材料等，但是这些材料在临 床应用中存在一定的并发症或不良反应。因此，近年来，脱细胞基质源的生物材料受到大量 的关注和研究，脱细胞基质源生物材料作为组织工程支架的研究正在兴起，研究内容主要 是脱细胞基质源材料在人体软组织损伤后的修复效果和使用方式；如皮肤烧烫伤后的治 疗、软骨损伤后的修复、疝气修补等。然而，脱细胞基质材料作为支架使用时，本身存在结构 较为单一，生物相容性欠佳，难以适用于多个临床适用症，临床使用受限等问题。
[0003] 异种组织来源的脱细胞基质材料因具有来源广泛，结构与人体相似度高等优点， 目前已经有多个产品上市并且成功应用于临床，但是异种来源的脱细胞基质材料存在免疫 排斥反应、力学强度差、结构可控性不够等先天不足的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决上述现有组织工程支架所存在的缺陷，提供一种具有良 好力学性能，良好生物相容性，较低免疫原性，可降解吸收，可控制降解速度，植入后不引起 排斥反应，同时又适用多个临床适用症的脱细胞基质源组织工程支架。
[0005] 本发明的另一目的是提供一种上述脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，可得 到具有良好力学性能，良好生物相容性，较低免疫原性，可降解吸收，可控制降解速度，植入 后不引起排斥反应，同时又适用多个临床适用症的上述脱细胞基质源组织工程支架。
[0006] 本发明的第三目的是提供一种上述脱细胞基质源组织工程支架的应用。
[0007] 为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种脱细胞基质源组织工程 支架，以处理后的动物膜材作为生物膜基材，在所述生物膜基材的表面粘附胶原蛋白疏松 层。
[0008] 优选的，所述胶原蛋白疏松层是由动物肌腱组织制得。
[0009] 优选的，所述生物膜基材有糙面和光面，所胶原蛋白疏松层粘附于糙面上。
[0010] 优选的，所述胶原蛋白疏松层的厚度为〇. 1~3.0mm，孔隙率为65~86 %，孔径为50 ~300μπι〇
[0011] -种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，包括的步骤如下：
[0012] (1)生物膜基材的制备；
[0013] (2)胶原蛋白的制备；
[0014] (3)胶原复合:将胶原蛋白粘附于生物膜基材的糙面上，干燥。
[0015] 具体的，所述脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，包括的步骤如下：
[0016] (1)预处理:取新鲜的动物膜材和肌腱组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和 绒毛组织;优选的，可通过修剪去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；
[0017] (2)脱脂:使用有机溶剂抽提萃取动物膜材和肌腱组织，去除脂肪及脂溶性杂质； 优选的，有机溶剂为质量浓度为〇. 5~3.2%的水溶液；
[0018] (3)脱细胞:使用表面活性剂溶液并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓 度为0.1~0.5 %，蛋白酶的质量终浓度0.1~0.3%，超声消化动物膜材和肌腱组织，以去除 所含的细胞或细胞碎片；
[0019] (4)去除抗原:使用活泼试剂，在pH值为7~8条件下与动物膜材与肌腱组织反应24 ~48h，然后用强氢键试剂，在pH值为7~8条件下与动物膜材与肌腱组织反应24~48h，以置 换动物膜材和肌腱组织中胶原蛋白分子螺旋链中的特殊氢键，得到彻底去除抗原后的生物 膜基材和肌腱组织；
[0020] (5)交联固定:使用质量浓度为0.5~5 %的非醛类化学交联剂溶液，在pH值为7~8 搅拌条件下，与经过去除抗原处理后的生物膜基材反应2~8天(可根据所需的交联度选择 相应的交联时间），对生物膜基材中的胶原蛋白分子进行交联；
[0021 ] (6)胶原蛋白提取及纯化:使用质量浓度为0.05~0.2 %的酸溶液溶解经去除抗原 处理后的肌腱组织，捣碎，然后在pH值为3~5的酸性条件下使用质量浓度0.1~0.4%的蛋 白酶溶液继续溶解，析出胶原蛋白，过滤，再使用质量浓度为0.1~0.5 %的表面活性剂溶液 浸泡，水洗后得到胶原蛋白纯品；
[0022]本发明使用较低浓度的（质量浓度为0.05~0.2%)酸溶液，目的是为了让肌腱组 织疏松和初步酸解，使其在捣碎机中可以捣成糊状固体物，方便用酶解进行蛋白片段级别 的分解；
[0023] (7)胶原复合:将胶原蛋白纯品真空干燥，粉碎，碾磨，过筛制成胶原蛋白粉末，将 胶原蛋白粉末溶解成质量浓度2~5%的胶原蛋白溶液，得到I型胶原、III型胶原或I/III型 胶原的共混物，将所得共混物(胶原蛋白溶液)平铺于经交联固定的生物膜基材的糙面上， 真空干燥，得到具有双层结构的组织工程支架。
[0024] 优选的，所述动物膜材是心包膜、肠膜或脂网膜中一种或两种以上。优选的，所述 动物膜材可以选取在屠宰4小时内的猪或牛的心包膜、肠膜或脂网膜等内脏膜。
[0025] 优选的，所述活泼试剂是小分子有机酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物或卤甲烷中一种 或两种以上;所述强氢键试剂为胍类化合物。
[0026] 优选的，胍类化合物为盐酸胍溶液。
[0027]优选的，所述非醛类化学交联剂是环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或 碳化二亚胺试剂中的一种或两种以上。
[0028]优选的，所述环氧化物是单环氧化物R<HQeH2λ双环氧化物或 低聚环氧化物中的一种或两种以上，其中R=H或CnH2n+i-，n = 0-10。优选的，所述低聚环氧化 物是聚环氧丙烷、聚环氧丙醇或环氧烷中的一种或两种以上。
[0029] 优选的，制备方法中，动物膜材与肌腱组织质量、有机溶剂、活泼试剂、强氢键试 剂、非醛类化学交联剂溶液的质量比为1: (5~10): (10~20): (10~20): (10~20)。
[0030] 优选的，所述酸溶液是盐酸和/或乙酸水溶液。
[0031]优选的，所述有机溶剂是乙酸酯类、氯仿、四氯化碳、乙醚、丙酮或无水乙醇中一种 或两种以上;所述表面活性剂是曲拉通、十二烷基磺酸钠、3-[(3-胆酰胺基丙基）二甲基铵 基]-1-丙磺酸盐、脱氧胆酸钠或羧甲基氨基甲烷中一种或两种以上;所述蛋白酶是胰蛋白 酶、胃蛋白酶或木瓜蛋白酶中一种或两种以上。
[0032]优选的，步骤(2)中，抽提萃取时间为24~48h。
[0033] 优选的，步骤(3)中，在30~60kHz条件下超声消化24~48h。
[0034] 优选的，步骤(6)使用蛋白酶溶液继续溶解，温度控制在10~20°C，析出胶原蛋白。 [0035]优选的，步骤(7)中，真空干燥条件独立选为:真空压强为0~10Pa，干燥时间48~ 72h。优选的，取粒径范围在200μπι以下的胶原蛋白粉末溶解成胶原蛋白溶液。
[0036] 优选的，步骤(7)中，溶解后的胶原蛋白溶液的质量浓度为2~5%。
[0037] 优选的，上述制备方法中，所述溶液为水溶液或缓冲溶液。
[0038]优选的，消毒是使用过氧乙酸、苯扎溴铵、洗必泰、新洁尔灭、叠氮化钠等广谱高效 消毒剂溶液浸泡4~24h。
[0039] 所述I型胶原、III型胶原或I/III型胶原的共混物粘附于经去抗原处理和非醛类 固定剂交联固定的生物膜基材的粗糙面上，真空干燥后形成胶原蛋白疏松层，而生物膜基 材和胶原蛋白疏松层共同构成具有双层结构的组织工程支架，该组织工程支架经剪裁，定 型，包装，灭菌，得到成品。
[0040] 所述具有双层结构的组织工程支架是通过生物蛋白胶或物理吸附将所得的I型胶 原、III型胶原或I/III型胶原的共混物粘附于生物膜基材的糙面上。
[0041] 所述灭菌既可通过一定剂量的γ射线辐照灭菌及杀灭病毒，也可通过其他方法有 效去除或灭活动物病毒，目前可知一定剂量的γ射线的有效福照剂量在15kGy以上，但本领 域技术人员也可以根据实际要求选择合适的辐照剂量。
[0042] 本发明的脱细胞基质源组织工程支架用于作为软组织损伤修复材料。本发明支架 可用于口腔粘膜、软骨、硬脑膜等软组织损伤后的修补，起到修复缺损及恢复功能的作用。 该支架也可承载细胞用于上述软组织损伤后的修复。由于其较好的贴附性能，该支架在手 术可免缝，直接贴附在软组织损伤区即可。
[0043]本发明相对于现有技术具有如下的有益效果:通过上述特定工艺处理制备得到具 有良好力学性能，较好生物相容性，较低免疫原性，可随着缺损组织修复逐渐降解吸收，可 控制降解速度，植入后不引起排斥反应，不作为永久异物存在，无任何残留毒性的脱细胞基 质源组织工程支架结构;且该脱细胞基质源组织工程支架可作为细胞(干细胞）、生长因子 的承载载体，也可制备成不同规格，用于损伤软组织的修补与重建(软骨缺损修复、口腔粘 膜修补、硬脑膜修补等）。
【附图说明】
[0044] 图1是本发明制备得到的脱细胞基质源组织工程支架的剖面结构示意图（其中，1 是生物膜基材，2是胶原蛋白疏松层）；
[0045] 图2是本发明制备得到的脱细胞基质源组织工程支架的胶原蛋白疏松层的扫描电 镜图。
【具体实施方式】
[0046] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚明白，以下结合附图以及实 施例，对本发明一种脱细胞基质源组织工程支架及其制备方法进行详细的说明。此处所描 述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。原理说明
[0047] 1.关于生物膜基材和胶原蛋白疏松层
[0048]本发明的动物膜材经去抗原处理和交联固定后，可得到一种力学强度好、免疫原 性低、降解时间可控的生物膜基材，但是这种生物膜基材本身存在孔隙率较低、孔径较小等 问题。而动物肌腱组织经过去抗原、交联固定、胶原蛋白提取和纯化的处理后，可得到一种 粒径可控且主要由Ι、ΠΙ型胶原蛋白组成的胶原蛋白粉末，胶原蛋白粉末经过水溶后形成 胶原蛋白溶液，真空干燥后，形成海绵结构的胶原蛋白疏松层。胶原蛋白疏松层结构疏松， 具有一定的孔径和孔隙率，但是这种胶原蛋白疏松层仍存在降解时间快、无力学支撑力等 不足。
[0049] 本发明一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，成功将生物膜基材与胶原蛋 白疏松层整合在一起，使胶原蛋白疏松层粘合固定在生物膜基材的糙面上，实现生物膜基 材和胶原蛋白疏松层的优势互补。
[0050] 柔韧而光滑的生物膜基材既可以保持住胶原疏松层的形貌与结构，又可以防止周 围结缔组织长入，起到屏障和减少关节面摩擦的作用，而且生物膜基材具有的较好力学性 能可克服单纯胶原支架力学性能差和降解速率过快的缺点。
[0051] 由I型、III型或Ι/ΙΙΙ型胶原组成的具有三维疏松结构胶原蛋白疏松层，孔径合 适，孔间连通，可以有利于宿主细胞的黏附和生长以及营养成分的运输和代谢产物的排出， 为组织再生性修复创造良好微环境;而且也有利于细胞粘附、增殖及分化，为细胞生长提供 良好微环境，更好诱导和促进组织修复再生;胶原蛋白本身具有特有的物理吸附性，也起到 一定的止血和封闭伤口的作用。
[0052] 2.关于去除抗原
[0053]根据现代免疫学理论，动物组织的抗原性主要是由蛋白质中某些特殊位置的活性 基团及特异构象引起的，这些活性基团主要是-〇H，-NH2，-SH等，而特异构象则主要是由于 胶原蛋白分子螺旋链的某些特殊氢键引起。在处理动物膜组织时，用一种或多种易与这些 活性基团起反应的活泼试剂(如酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物、卤甲烷等）与这些活性基团结 合，将胶原蛋白中的活性基团封闭起来，可以有效去除抗原。如此同时，再配合使用强氢键 试剂（如胍类化合物），置换引起特异构象的氢键，改变胶原蛋白构象，也可进一步去除抗 原。
[0054] 3.关于非醛类固定剂
[0055] 由于动物膜组织容易被微生物降解或分解，因此需要用固定剂交联固定。传统方 法是使用有残留毒性的戊二醛作固定剂，而本发明选用环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、 聚乙二醇或碳化二亚胺等易与蛋白质分子发生交联反应且无残留毒性的非醛类固定剂。环 氧化物作为本发明优选的非醛类固定剂，容易发生开环交联反应，控制反应条件可以使得 到的交联产物很稳定，不轻易降解。
[0056] 4.关于交联固定
[0057] 交联剂的活跃基团(羟基和羧基等)可以与胶原蛋白分子中的胺基发生反应，形成 网状的分子间和分子内交联结构，而这种稳定结构可以较好地对抗人体内蛋白酶的酶切 等，从而可以减慢胶原蛋白的降解速度。本发明通过控制非醛类固定剂的浓度和反应时间， 可以得到不同交联程度的材料，以此选择适宜的交联度材料满足临床用途对脱细胞基质源 组织工程支架材料的需求。此外，本发明还可以省略交联固定，制备非交联的脱细胞基质源 组织工程支架材料。
[0058] 以下实施例中，所述溶液如无特别说明，均为水溶液。实施例中，盐酸胍溶液为盐 酸胍的Tr is溶液。
[0059] 实施例1
[0060] 一种脱细胞基质源组织工程支架，如图1所示，以动物膜材通过预处理、脱脂、脱细 胞、交联固定、去除抗原等步骤处理后得到的生物膜基材1，在所述生物膜基材1的表面粘附 由动物肌腱组织通过预处理、脱脂、脱细胞、交联固定、去除抗原以及胶原蛋白提取及纯化 等步骤制得的胶原蛋白干燥得到的胶原蛋白疏松层2。其中，所述生物膜基材1有糙面和光 面，所胶原蛋白疏松层粘附于糙面上。
[0061 ] 实施例2
[0062] 一种脱细胞基质源的软骨支架，以动物膜材通过预处理、脱脂、脱细胞、交联固定、 去除抗原等步骤处理后得到的生物膜基材1，在所述生物膜基材1的表面粘附由动物肌腱组 织通过预处理、脱脂、脱细胞、交联固定、去除抗原以及胶原蛋白提取及纯化等步骤制得的 胶原蛋白干燥得到的胶原蛋白疏松层2。其中所述胶原蛋白疏松层具有孔隙，孔隙率为65~ 86 %，孔隙的孔径为50~500μηι。所述胶原蛋白疏松层通过物理吸附固定在生物膜基材的糙 面上。或者，所述胶原蛋白疏松层通过生物蛋白胶粘合固定在生物膜基材的糙面上。优选 的，所述胶原蛋白疏松层的厚度为0.1~2.9mm。所述软骨支架材料为方形的膜片状结构。所 述软骨支架材料的长度为10~80mm，宽度为5.0~60mm，厚度为0.2~3mm。本实施例所述的 支架可以作为自体软骨细胞、干细胞、生长因子或药物的输送载体，同时具有与软骨组织紧 密贴附、组织相容性好、细胞承载能力强和手术后可逐步降解等优点。
[0063] 实施例3
[0064] 本发明的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
[0065] (1)预处理:取新鲜的质量相等的动物心包膜和肌腱组织，洗净，使用新洁尔灭广 谱高效消毒剂溶液浸泡15h，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；
[0066] (2)脱脂:使用质量浓度为3.0%的丙酮溶液抽提萃取动物心包膜和肌腱组织，以 去除脂肪及脂溶性杂质，萃取时间为24h，丙酮溶液与动物心包膜和肌腱组织的质量比为 10:1；
[0067] (3)脱细胞:使用质量浓度为0.1%的曲拉通(Triton-100)并结合质量浓度0.1% 的胃蛋白酶(所述浓度为终浓度），在30kHz条件下超声消化动物心包膜和肌腱组织48h，以 完全去除组织中所含的细胞及其碎片；
[0068] (4)去除抗原:使用与动物心包膜与肌腱组织质量比20:1的活泼试剂酰胺，在pH值 为7的条件下反应48h，并用与动物心包膜和肌腱组织质量比为20:1的8mol/L盐酸胍溶液， 在pH值为8的条件下反应24h，以置换动物心包膜和肌腱组织中胶原蛋白分子螺旋链中的特 殊氢键，得到彻底去除抗原后的生物膜基材和肌腱组织；
[0069] (5)交联固定:使用与动物心包膜和肌腱组织质量比为20:1的聚环氧丙烷溶液，聚 环氧丙烷溶液的质量浓度为〇. 5 %，在pH值为7且搅拌的条件下，与经过去除抗原处理后的 生物膜基材反应2天，对生物膜基材中的胶原蛋白分子进行交联；
[0070] (6)胶原蛋白提取及纯化:使用质量浓度为0.2%的乙酸水溶液溶解经过脱细胞和 去除抗原处理后的肌腱组织，经组织捣碎机捣碎，然后在pH值为3的酸性条件下使用质量浓 度为0.4%的胃蛋白酶溶液继续溶解2天，温度控制在10°C，析出胶原蛋白，过滤，再使用质 量浓度为0.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液浸泡24h，以去除可能含有的脂质，水洗后得到 胶原蛋白纯品；
[0071 ] (7)胶原复合:将胶原蛋白纯品放入冷冻干燥机中，真空条件为1 OPa，干燥72h，使 用粉碎机粉碎，球磨机碾磨，过筛，取粒径范围在200μπι以下的胶原蛋白粉末;将胶原蛋白粉 末溶解成质量浓度5%的胶原蛋白溶液，得到I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原的共混物， 将得到的I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原混合物平铺于生物膜基材的糙面上，放入冷冻 干燥机中，真空条件为l〇Pa，干燥72h，得到具有双层结构的组织工程支架，经剪裁，定型，包 装，用辐照剂量为30kGy γ射线进行辐照灭菌，得到成品。
[0072] 经过上述制备方法得到的脱细胞基质源组织工程支架材料，具有降解速度快、细 胞承载量多、生物相容性好等优点，适用于修复重建速度较快的组织缺损部位，体内降解时 间为术后2个月到6个月。
[0073] 实施例4
[0074] 本发明的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
[0075] (1)预处理:取新鲜的质量相等的动物心包膜和肌腱组织，洗净，使用洗必泰广谱 高效消毒剂溶液浸泡4h，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；
[0076] (2)脱脂：使用质量浓度为3.5%的四氯化碳溶液抽提萃取动物心包膜和肌腱组 织，以去除脂肪及脂溶性杂质，萃取时间为30h，四氯化碳溶液、动物心包膜和肌腱组织的质 量比为5:1;
[0077] (3)脱细胞：使用质量浓度为0.5 %的羧甲基氨基甲烷（Tr i s)并结合质量浓度 0.3 %的木瓜蛋白酶(所述浓度为终浓度），在50kHz条件下超声消化动物心包膜和肌腱组织 24h，以完全去除组织中所含的细胞及其碎片；
[0078] (4)去除抗原:使用与动物心包膜与肌腱组织质量比10:1的活泼试剂丁酸酐，在pH 值为8的条件下反应24h，并用与动物心包膜和肌腱组织质量比为1:10的6mol/L盐酸胍溶 液，在pH值为7的条件下反应48h，以置换动物心包膜和肌腱组织中胶原蛋白分子螺旋链中 的特殊氢键，得到彻底去除抗原后的生物膜基材和肌腱组织；
[0079] (5)交联固定:使用与动物心包膜和肌腱组织质量比为20:1的聚环氧丙醇溶液，聚 环氧丙醇溶液的质量浓度为3%，在pH值为7且搅拌的条件下，与经过去除抗原处理后的生 物膜基材反应5天，对生物膜基材中的胶原蛋白分子进行交联；
[0080] (6)胶原蛋白提取及纯化:使用质量浓度为0.05 %的盐酸水溶液溶解经过脱细胞 和去除抗原处理后的肌腱组织，经组织捣碎机捣碎，然后在pH值为4的酸性条件下使用质量 浓度为〇. 2%的木瓜蛋白酶溶液继续溶解5天，温度控制在15°C，析出胶原蛋白，过滤，再使 用质量浓度为〇. 1 %的脱氧胆酸钠溶液浸泡48h，以去除可能含有的脂质，水洗后得到胶原 蛋白纯品；
[0081 ] (7)胶原复合:将胶原蛋白纯品放入冷冻干燥机中，真空条件为OPa，干燥48h，使用 粉碎机粉碎，球磨机碾磨，过筛，取粒径范围在200μπι以下的胶原蛋白粉末;将胶原蛋白粉末 溶解成质量浓度2%的胶原蛋白溶液，得到I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原的共混物，将 得到的I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原混合物平铺于生物膜基材的糙面上，放入冷冻干 燥机中，真空条件为OPa，干燥48h，得到具有双层结构的组织工程支架，经剪裁，定型，包装， 用辐照剂量为25kGy γ射线进行辐照灭菌，得到成品。
[0082] 经过上述制备方法得到的脱细胞基质源组织工程支架材料，具有生物相容性好， 免疫原性低，降解时间可控，细胞承载量大等优点，适用于修复重建偏慢的组织缺损部位， 可实现组织重建与支架材料降解同步的使用效果，体内降解时间可控制在术后6个月到2 年。
[0083] 实施例5
[0084] 本发明的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
[0085] (1)预处理:取新鲜的质量相等的动物心包膜和肌腱组织，洗净，使用新洁尔灭广 谱高效消毒剂溶液浸泡l〇h，并去除脂肪组织、纤维和绒毛组织；
[0086] (2)脱脂:使用质量浓度为2.5% 1:1氯仿乙醇溶液抽提萃取动物心包膜和肌腱组 织中含有的脂肪及脂溶性杂质，萃取时间为24h，氯仿乙醇溶液与动物心包膜和肌腱组织的 质量比为5:1;
[0087] (3)脱细胞：使用质量浓度为0.25 %的十二烷基磺酸钠（SDS)并结合质量浓度 0.25%的胰蛋白酶(所述浓度为终浓度），在40kHz条件下超声消化动物心包膜和肌腱组织 48h，以完全去除组织中所含的细胞及其碎片；
[0088] (4)去除抗原:使用与动物心包膜与肌腱组织质量比10:1的活泼试剂卤甲烷，在pH 值为7.2的条件下反应48h，并用与动物心包膜和肌腱组织质量比为10:1的3mol/L盐酸胍溶 液，在pH值为7.2的条件下反应48h，以置换动物心包膜和肌腱组织中胶原蛋白分子螺旋链 中的特殊氢键，得到彻底去除抗原后的生物膜基材和肌腱组织；
[0089] (5)交联固定:使用与动物心包膜和肌腱组织质量比为10:1的环氧烷溶液，环氧烷 溶液的质量浓度为3%，在pH值为7且搅拌的条件下，与经过去除抗原处理后的生物膜基材 反应8天，对生物膜基材中的胶原蛋白分子进行交联；
[0090] (6)胶原蛋白提取及纯化:使用质量浓度为0.2%的乙酸水溶液溶解经过脱细胞和 去除抗原处理后的肌腱组织，经组织捣碎机捣碎，然后在pH值为3的酸性条件下使用质量浓 度为0.3%的胃蛋白酶溶液继续溶解3天，温度控制在10°C，析出胶原蛋白，过滤，再使用质 量浓度为0.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液浸泡24h，以去除可能含有的脂质，水洗后得到 胶原蛋白纯品；
[0091] (7)胶原复合:将胶原蛋白纯品放入冷冻干燥机中，真空条件为5Pa，干燥24h，使用 粉碎机粉碎，球磨机碾磨，过筛，取粒径范围在200μπι以下的胶原蛋白粉末;将胶原蛋白粉末 溶解成质量浓度5%的胶原蛋白溶液，得到I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原的共混物，将 得到的I型胶原、III型胶原或Ι/ΙΙΙ型胶原混合物平铺于生物膜基材的糙面上，放入冷冻干 燥机中，真空条件为5Pa，干燥48h，得到具有双层结构的组织工程支架，经剪裁，定型，包装， 用辐照剂量为35kGy γ射线进行辐照灭菌，得到成品。
[0092] 实施例6
[0093]本发明方法的第(5)步骤的交联固定工艺中，可以选择聚环氧丙烷、聚环氧丙醇或 环氧烷中的至少两种;还可以选择非环氧化物类交联剂，可以是二酰二胺、二异氰酸酯、聚 乙二醇、碳化二亚胺等中的一种或多种，交联剂浓度为0.5%~5%，在pH值为7~8且搅拌的 条件下，与生物膜基材反应2~8天，可得不同交联程度的生物膜基材。
[0094] 实施例7
[0095] 本发明实施例3制备得到的低交联度(0~10%)的脱细胞基质源组织工程支架材 料，常规方法检测材料的热收缩温度为56~69°C，支架材料的厚度为1.5~3.0_。其中，胶 原蛋白疏松层的孔隙率为65~86%，孔径为50~300μπι，所述脱细胞基质源组织工程支架材 料具有较好的细胞承载能力。
[0096] 实施例8
[0097] 本发明实施例3制备得到的低交联度(0~10%)的脱细胞基质源组织工程支架材 料，常规方法检测材料的热收缩温度为56~69 °C，支架材料的厚度为0.5~1.0_。其中，胶 原蛋白疏松层的孔隙率为65~86%，孔径为50~300μηι，所述胶原蛋白不仅可以较好地与患 者的软组织贴合，而且还可以较好地附着在组织表面。
[0098] 实施例9
[0099] 取实施例3的脱细胞基质源组织工程支架材料，用于犬口腔粘膜缺损的修补实验， 将胶原蛋白疏松层侧贴附于犬口腔粘膜缺损区，同时用丝线缝合并辅以纱布膜进行包扎固 定，术后7天去除包扎包后，支架材料作为口腔修复膜能够较好地贴附在缺损区，术后3个月 外观观察缺损区已修复完毕，组织学观察可见支架材料已经开始降解，修复区有自体上皮 细胞和成纤维细胞的长入，并可见新生的胶原纤维组织。
[0100] 由此可见，本发明制备得到的脱细胞基质源组织工程支架材料具有较好的生物相 容性和物理贴附性，其临床应用前景较好。
[0101] 通过试验表明，其他实施例得到的脱细胞基质源组织工程支架材料也具有类似的 效果。
[0102] 实施例10
[0103] 取实施例4的脱细胞基质源组织工程支架材料，按1.0~4.0 X 106个/cm2的密度将 动物自体软骨细胞接种于所述脱细胞基质源组织工程支架材料的胶原蛋白疏松层，接种2 ~4小时后用于山羊膝关节软骨缺损的修补治疗，术后3个月可见缺损区已完全修复，组织 学观察修补区可见软骨细胞的存在，且植入的支架材料已有部分降解，并由新生的胶原纤 维生成。
[0104] 由此可见，本发明制备得到的脱细胞基质源组织工程支架材料具有较好的生物相 容性和可降解性，具有一定的临床应用前景。
[0105] 通过试验表明，其他实施例得到的脱细胞基质源组织工程支架材料也具有类似的 效果。
[0106] 实施例11
[0107] 本发明实施例4制备得到的中高交联度（11~35%)的脱细胞基质源组织工程支架 材料，常规方法检测材料的热收缩温度为70~90°C，支架材料的厚度为0.5~1.5mm。其中， 胶原蛋白疏松层的孔隙率为65~86%，孔径为50~300μηι，所述支架材料胶原层由胶原蛋白 制成，本身具有较好的吸附和粘合效果，并有一定的止血和封闭伤口的临床效果。该支架材 料基底层具有中高程度的交联度，在体内具有较为缓慢的降解速度，多在术后2年左右才完 全降解。
[0108] 实施例12
[0109] 取实施例4的脱细胞基质源组织工程支架材料，按1.0~4.0 X 106个/cm2的密度将 人源软骨细胞接种在单位面积脱细胞基质源组织工程支架材料的胶原蛋白疏松层，接种后 30分钟，检测得知单位面积脱细胞基质源组织工程支架材料的胶原蛋白疏松层粘附的细胞 数占总接种细胞数的90 %以上。
[0110]由此可见，实施例4制备得到的脱细胞基质源组织工程支架材料具有较好的细胞 承载力。 Com]通过试验表明，其他实施例得到的脱细胞基质源组织工程支架材料也具有类似的 效果。
[0112] 实施例13
[0113]取实施例4的脱细胞基质源组织工程支架材料，作为免缝脑膜补片用于犬硬脑膜 缺损的修复实验，将胶原蛋白疏松层侧贴附于犬硬脑膜面，生物膜基材层朝向颅骨面，支架 材料的面积要大于脑膜缺损区，即与缺损脑膜处正常组织边缘重叠约3~5mm，不做修复材 料与脑膜组织的缝合，逐层关闭头皮。术后6周打开手术区，可见支架材料与犬自体脑膜组 织粘合牢固，无脑脊液等外漏；同时，支架材料基材侧与颅骨、肌肉均无任何粘连、表面光 滑，胶原层侧与犬大脑组织无任何粘连、表面光滑。组织学观察可见支架材料与犬大脑组 织、肌肉等无任何粘连点，胶原层已完全降解，有少许成纤维细胞长入，无炎症反应。
[0114] 由此可见，本发明制备得到的脱细胞基质源组织工程支架材料具有较好的粘合效 果，具有较好的生物相容性和结构稳定性，可以用于脑膜修补手术中。
[0115] 通过试验表明，其他实施例得到的脱细胞基质源组织工程支架材料也具有类似的 效果。
[0116] 综上所述，动物膜材和肌腱组织经过本发明处理后，结构稳定性更高，免疫原性极 低，可适用于植入材料使用。经过多次体外实验和体内植入实验验证，本发明的脱细胞基质 源组织工程支架具有较强的细胞承载能力，可以将大量的细胞或生长因子输送到软组织损 伤区域，极大促进损伤软组织的修复与组织重建，该使用方法同样适用于其他组织工程产 品的临床应用。如图2所示，本发明的脱细胞基质源组织工程支架还具有较好的物理吸附效 果，可以与患者自体粘膜组织、硬脑膜组织粘合在一起，作为口腔修复膜、免缝型硬脑膜补 片等临床手术应用。
[0117] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种脱细胞基质源组织工程支架，其特征在于处理后的动物膜材作为生物膜基 材，在所述生物膜基材的表面粘附胶原蛋白疏松层。2. 根据权利要求1所述的一种脱细胞基质源组织工程支架，其特征在于:所述胶原蛋白 疏松层是由动物肌腫组织制得。3. 根据权利要求2所述的一种脱细胞基质源组织工程支架，其特征在于:所述生物膜基 材有糖面和光面，所胶原蛋白疏松层粘附于糖面上。4. 根据权利要求1所述的一种脱细胞基质源组织工程支架，其特征在于:所述胶原蛋白 疏松层的厚度为0.1~3.0mm，孔隙率为65~86%，孔径为50~300]im。5. 根据权利要求1-4任一所述的脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 包括的步骤如下： (1) 生物膜基材的制备； (2) 胶原蛋白的制备； (3) 胶原复合:将胶原蛋白粘附于生物膜基材的糖面上，干燥。6. 根据权利要求5所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于:包 括的步骤如下： (1) 预处理:取新鲜的动物膜材和肌腫组织，洗净，消毒，并去除脂肪组织、纤维和绒毛 组织； (2) 脱脂:使用有机溶剂抽提萃取动物膜材和肌腫组织，去除脂肪及脂溶性杂质； (3) 脱细胞:使用表面活性剂溶液并结合蛋白酶溶液，控制表面活性剂的质量终浓度为 0.1~0.5%，蛋白酶的质量终浓度0.1~0.3%，超声消化动物膜材和肌腫组织； (4) 去除抗原：使用活泼试剂，在pH值为7~8条件下与动物膜材与肌腫组织反应24~ 4她，然后用强氨键试剂，在pH值为7~8条件下与动物膜材与肌腫组织反应24~4她，得到彻 底去除抗原后的生物膜基材和肌腫组织； (5) 交联固定:使用质量浓度为0.5~5%的非醒类化学交联剂溶液，在抑值为7~8揽拌 条件下，与经过去除抗原处理后的生物膜基材反应2~8天； (6) 胶原蛋白提取及纯化:使用质量浓度为0.05~0.2%的酸溶液溶解经去除抗原处理 后的肌腫组织，捣碎，然后在pH值为3~5的酸性条件下使用质量浓度0.1~0.4%的蛋白酶 溶液继续溶解，析出胶原蛋白，过滤，再使用质量浓度为0.1~0.5%的表面活性剂溶液浸 泡，水洗后得到胶原蛋白纯品； (7) 胶原复合:将胶原蛋白纯品真空干燥后制成胶原蛋白粉末，将胶原蛋白粉末溶解成 胶原蛋白溶液后平铺于经交联固定的生物膜基材的糖面上，真空干燥。7. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于:所 述动物膜材是屯、包膜、肠膜或脂网膜中一种或两种W上。8. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于:所 述活泼试剂是小分子有机酸酢、酷氯、酷胺、环氧化物或面甲烧中一种或两种W上;所述强 氨键试剂为脈类化合物。9. 根据权利要求8所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于:脈 类化合物为盐酸脈溶液，所述盐酸脈溶液的浓度为3~8mol/L。10. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 所述非醒类化学交联剂是环氧化物、二酷二胺、二异氯酸醋、聚乙二醇或碳化二亚胺试剂中 的一种或两种W上。11. 根据权利要求10所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 所述环氧化物是单环氧化物巧低聚环氧化物中的 一种或两种W上，其中R=H或Cn出nu-，n = 0-10。12. 根据权利要求11所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 所述低聚环氧化物是聚环氧丙烷、聚环氧丙醇或环氧烧中的一种或两种W上。13. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 动物膜材与肌腫组织质量、有机溶剂、活泼试剂、强氨键试剂、非醒类化学交联剂溶液的质 量比为 1: (5~10): (10~20): (10~20): (10~20)。14. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 所述酸溶液是盐酸和/或乙酸水溶液。15. 根据权利要求6所述的一种脱细胞基质源组织工程支架的制备方法，其特征在于： 所述有机溶剂是乙酸醋类、氯仿、四氯化碳、乙酸、丙酬或无水乙醇中一种或两种W上;所述 表面活性剂是曲拉通、十二烷基横酸钢、3-[(3-胆酷胺基丙基)二甲基锭基]-1-丙横酸盐、 脱氧胆酸钢或簇甲基氨基甲烧中一种或两种W上;所述蛋白酶是膜蛋白酶、胃蛋白酶或木 瓜蛋白酶中一种或两种W上。16. 根据权利要求1-4任一所述的一种脱细胞基质源组织工程支架用于作为软组织损 伤修复材料。
【文档编号】A61L27/58GK105935454SQ201610188734
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】张伟, 王志杰, 唐容, 徐斌
【申请人】广州市美昊生物科技有限公司, 冠昊生物科技股份有限公司