基因的异常表达与肝癌不同分化程度的关系及应用
【专利摘要】本发明涉及基因的异常表达与肝癌不同分化程度的关系及应用。发明通过在TCGA数据库的中挑选肝癌患者的测序数据和临床信息，进行挑选和归类，数据分析获得与肝癌分化相关的差异表达基因，进行临床实验验证，显示TRAIP基因和NAT14基因的表达高低和肝癌的分化呈负相关，高度分化的肝癌组织中，TRAIP基因、NAT14基因的表达量较低，分化较差的组织中TRAIP基因、NAT14基因的表达量较高。本发明提供的分子标志物，可用来辅助诊断肝癌的分化程度，有很好的临床应用价值。
【专利说明】
基因的异常表达与肝癌不同分化程度的关系及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因的异常表达与肝癌不同分化程度的关系 及应用，更具体的涉及TRAIP基因、NAT14基因在制备诊治肝癌分化制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是我国常见的恶性肿瘤，2015年癌症统计数据显示，中国四种最常见肿瘤分 别是肺癌、胃癌、肝癌和食管癌，其中预计肝癌新发病约46.6万，继肺癌、胃癌和食管癌之 后，排名第四，但是，预计肝癌的死亡率达42.2万，继肺癌和胃癌之后，排名第三。
[0003] 在医生制定手术方案时，肝癌的分化程度是影响方案的重要因素之一。肝癌的治 疗方式主要包括手术切除、射频消融等局部治疗、介入栓塞、化疗、生物免疫治疗等。这些治 疗手段各有所长，各有一定的适应症和局限性。外科手术是肝癌治疗的主要手段，但在切除 大肝癌时切缘易残留微小的癌灶，并且对肝脏功能也有较大的负面影响，手术后易发生断 面的复发或肝功能不全等并发症。射频消融等局部治疗对较小的肝癌病灶有很好的消融作 用，且对肝功能影响不大，但是，当癌灶的体积较大时，往往存在消融不完全等问题。介入栓 塞治疗虽然对癌灶有很好的治疗作用，对于较大的肿瘤，或者多发性肿瘤尤为适合，但该方 法对肝脏功能有较大的负面影响，治疗过度容易引起肝功能不全等并发症。化疗虽属全身 性治疗，但选择性抑制作用不强，化疗药物往往"敌我"不分，毒性较大，因此单靠使用化疗 药物很难把癌细胞彻底消灭。中医中药在调动机体脏腑功能、提高人体抗病能力、减轻其它 治疗的副作用等方面有其长处，但对肿瘤的局部控制能力较差。生物免疫治疗属于肿瘤治 疗研究的重点，但现有的生物免疫治疗方法只能在残存肿瘤细胞数量较少的情况下发挥作 用。各种治疗方法的优点有机地结合起来，制定确切有效的综合治疗方案，扬长避短，发挥 各种治疗方法的优势以提高疗效，是进一步提高肝癌远期治疗效果的最重要措施。对于分 化程度高或较高的肝癌，医生更倾向于手术切除；如果分化程度差，要慎重选择手术切除。 由于手术前医生无法确切地知道肝癌细胞的分化程度，这需要将手术标本放在显微镜让病 理医生来检查。这样为医生制定适宜的手术方案增加难度。
[0004] 本发明通过在TCGA数据库的中挑选333例肝癌患者的测序数据和临床信息，进行 挑选和归类，并对所有原始数据集进行总体归一化处理后进行linear by linear association test，数据分析获得与肝癌分化相关的基因，进一步对筛选到的与肝癌分化 相关的差异表达基因进行实验验证，实验显示TRAIP基因、NAT14基因的表达高低和肝癌的 分化呈负相关，高度分化的肝癌组织中，TRAIP基因、NAT14基因的表达量较低，分化较差的 组织中TRAIP基因 、NATl 4基因的表达量较高。本发明提供与肝癌分化高度相关的分子标志 物，可用来动态监测肝癌的分化程度，具有重要的临床意义及应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供调节TRAIP和/或NAT14基因表达或蛋白含量的试剂在制备 调控肝癌分化制剂中的应用。
[0006] 本发明的目的在于提供抑制TRAIP和/或NAT14基因表达或降低蛋白含量的试剂在 制备肝癌分化诱导剂中的应用。
[0007] 为实现上述目的，发明通过生物信息学整合分析筛选到TRAIP基因、NAT14基因，进 而通过RT-PCR验证了他们与肝癌分化具有很好的相关性，可用于制备肝癌分化辅助诊疗制 剂，具有重要的临床应用价值。
[0008] 肝癌分化采用肝癌Edmondson-Steiner分级法：
[0009] I级:癌细胞呈高分化状态，核/质比接近正常；
[0010] Π 级:癌细胞中度分化，但核/质比增加，核染色更深；
[0011] m级:癌细胞分化较差，核/质比更高，核异质明显，核分裂多见；
[0012] IV级:癌细胞分化最差，胞质少，核染色质浓染，细胞形状极不规则，排列松散。
[0013] 肿瘤的诱导分化治疗是指利用分化诱导剂促进恶性肿瘤细胞向成熟细胞方向分 化，重建正常表型，恢复正常功能，并最终促进肿瘤细胞凋亡和抑制增殖，从而达到治愈肿 瘤的目的。肝癌中TRAIP和/或NAT14基因的低表达有利于肝癌的高分化，即抑制TRAIP和/或 NAT14基因的表达从而促进肝癌细胞向成熟细胞方向分化，从而达到治愈肝癌的目的。
[0014] 本领域人员熟知抑制基因的表达或降低蛋白含量通常可以采用下述方法中的一 种和/或几种:通过激活基因的抑制基因、激活基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技 术抑制基因表达、激活促进基因 mRNA降解的microRNA、导入促进基因编码蛋白降解的分子、 抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活基因的抑制基因、激活抑制基因表达 的蛋白、导入抑制基因表达的siRNA、激活促进基因 mRNA降解的microRNA、导入促进蛋白降 解的分子、抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。
[0015] -种肝癌分化诱导剂，所述诱导剂中含有抑制TRAIP和/或NAT14基因表达或降低 蛋白含量的试剂。优选的，试剂含有TRAIP和/或NAT14基因的特异性干扰RNA。
[0016] RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内 某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。s iRNA设计 完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的SiRNA可以通过磷酸钙共沉 淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。
[0017] 本发明的目的在于提供检测TRAIP和/或NAT14基因表达情况或蛋白含量的试剂在 制备诊断肝癌分化制剂中的应用。
[0018] 进一步，TRAIP和/或NAT14基因或其表达产物在高分化肝癌样本中低表达。TRAIP 和/或NATl4基因在不同肝癌分化组中相对表达量:I级〈Π 级〈m级〈IV级。
[0019] 进一步，诊断肝癌分化制剂包括用焚光定量PCR方法、基因芯片方法、northern杂 交方法或高通量测序方法检测样本中TRAIP和/或NAT14基因表达情况。
[0020] 用于荧光定量PCR方法检测肝癌中TRAIP和/或NAT14基因的产品含有特异性扩增 TRAIP和/或NAT14基因基因的引物;基因芯片包括与TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列杂交 的探针;northern杂交包括与TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列杂交的探针。
[0021] 优选的，荧光定量PCR方法检测基因 TRAIP和/或NAT14基因，采用特异的引物，检测 TRAIP基因的引物序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;检测NAT14基因的引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0022] 优选的，检测样本为肝癌组织。样本可以通过穿刺活检等方式取得。
[0023] 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的 初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复 性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0024] 基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1)固定在聚 合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶 基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列，与荧光标记的靶基因杂交进行检测。基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测 技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面:一是高度的灵敏性和准确性;二是快速 简便;三是可同时检测多种疾病。
[0025] 进一步，诊断肝癌分化制剂包括用免疫方法检测TRAIP和/或NAT14基因表达产物 含量。
[0026] 优选的，免疫方法检测TRAIP和/或NAT14基因表达产物含量为western blot和/或 ELI SA和/胶体金检测方法。
[0027] ELISA法为使用ELISA检测试剂盒检测TRAIP和/或NAT14基因表达产物含量。试剂 盒中的抗体可采用市售的TRAIP和/或NAT14单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括:包被 TRAIP和/或NAT14单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品， 稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
[0028] 胶体金法为使用胶体金试剂盒检测TRAIP和/或NAT14基因表达产物含量，抗体可 采用市售的TRAIP和/或NAT14单克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析 技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 TRAIP和/或NAT14单克隆抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0029] 优选的，检测样本为肝癌组织。
[0030] 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、双抗夹心法、竞争法、双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和 生物素的ELISA JLISA检测试剂盒中生色底物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。
[0031] 常用的免疫胶体金检测技术：（1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。（2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。（3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。（4)胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的 抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集 在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0032] 本发明的目的在于提供一种检测肝癌分化的试剂盒，试剂盒检测基因 TRAIP和/或 NAT14,采用特异的引物，检测TRAIP基因的引物序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;检测 NAT14基因的引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0033] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0034] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。
[0035]本发明目的是提供了一种检测肝癌分化的蛋白试剂盒，检测试剂盒检测TRAIP和/ 或NAT14蛋白量。进一步的，试剂盒还包括其他检测试剂。
[0036] 本发明目的是提供了一种检测肝癌分化的基因芯片，基因芯片包括与TRAIP和/或 NAT14基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0037] 图1是在肝癌不同分化程度组中2个基因 mRNA相对表达情况图
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0039]实施例1数据的选择 [0040] 1纳入排除标准
[0041 ] TCGA 数据库的nationwi dechi Idrens · org_c Iini cal_patient_lihc文件中共记录 377例肝癌患者的临床信息。本项目排除11181:〇^_〇1:1161'_111311811311〇7或11181:〇^_ neoadjuvant_treatment为Yes的患者37例，剩余患者340例纳入本研究。
[0042] 2测序平台数据选择：
[0043] 我们选择相对数据较多的UNC IlluminaHiseq_RNASeqV2平台，有case371例。其中 有临床信息的case有336例。
[0044] 3肝癌分化程度样本选择
[0045] 根据临床资料记载（仙1:;[0歷丨(16(311；[1(1代118.0坪_(31;[11；^&1_口&1:丨6111:_1;[11(3)，340例 患者中，高分化49例，中分化156例，低分化116例，更低分化12例，Notavai IabI e (数据不存 在)3例。去除NA后，使用333例患者的数据进行后续分析。
[0046] 实施例2数据分析
[0047]上述符合要求的样本中，通过转录组数据分析软件对TCGA数据库肝癌肿瘤组织分 级相关的转录组测序数据进行分析。分析方法为用coin包的Ibl. test函数linear by linear association test，具体做法是根据每个基因的表达量的四分位数将每个样本划 分到为4个表达量区间，然后检测表达量区间与tumor grade的相关性。采用标准是FDR〈 0.05,得到与肿瘤分级相关基因（包括正相关基因和负相关基因）。为了更好的研究与分化 程度相关的基因的功能，我们首先通过GeneC 〇diS3对分级相关基因进行GO功能聚类和KEGG 富集。结果显示，差异基因显著富集在有丝分裂细胞周期(mitotic cell cycle)、病毒转录 (viral transcription)、番面译终止（translational termination)、病毒感染周期（viral infectious cycle)等生物功能，以及细胞周期(Cell cycle)，核糖体(Ribosome)，PPAR，卵 母细胞减数分裂(Oocyte meiosis)，黄体酮介导的卵母细胞成熟(Progesterone-mediated oocyte maturation)，脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism)，丁酸甲酯代谢（Butanoate metabolism)，丙酮酸盐/酯代谢(Pyruvate metabolism)，p53,补体系统等信号通路。
[0048] 最后，结合上述分析结果，人为筛选出相关基因 TRAIP和NAT14基因，TRAIP和NAT14 基因的表达与肿瘤分化密切相关，在肝癌高分化组基因表达量较低，肝癌分化程度较差的 组织中基因表达量较高。
[0049] 实施例3临床样本的采集
[0050] 本发明中相关肝癌以及癌旁组织均取自医院中经手术治疗过的肝癌患者，并且与 患者本人签定知情书。切取离体后的癌以及癌5厘米以外的部分，分别用于实验的癌组织以 及癌旁组织，癌灶以及癌旁的诊断和分级均以最终的医院病理诊断为依据。样本均存放于-80 °C冰箱中待用。
[0051 ]肝癌 Edmondson-Steiner 分级法：
[0052] I级:癌细胞呈高分化状态，核/质比接近正常；
[0053] Π 级:癌细胞中度分化，但核/质比增加，核染色更深；
[0054] m级:癌细胞分化较差，核/质比更高，核异质明显，核分裂多见；
[0055] IV级:癌细胞分化最差，胞质少，核染色质浓染，细胞形状极不规则，排列松散。 [0056]经统计，132例原发性肝癌患者采集的样本中，22例为女性（占16.67%)，110例为 男性（占83.33%)，年龄在32-79之间，医院病理诊断显示除5例由于样本关系无法确认，127 例肝癌样本中9例为I级（高分化）、28例Π 级（中度分化）、59例ΙΠ 级（分化较差）、31例IV级 (分化最差）。
[0057] 实施例4实验验证
[0058] 1肝癌组织样本RNA抽提
[0059] 127例肝癌样本的RNA抽提采用试剂Trizol抽提，利用Trizol试剂破坏组织细胞， 释放细胞中的RN A。具体抽提过程如下：
[0060] (1)从-80°c冰箱中去取出样本组织，放入预冷后的灭菌研钵中进行研磨；
[0061] (2)研磨组织粉末移入EP管中，加1毫升的Trizol和200微升氯仿混匀；
[0062] (3)4°C最大转速离心10分钟，分层；
[0063] (4)加500微升异丙醇，室温静置后4°C最大转速离心15分钟；
[0064] (5)加入1毫升7 5 %乙醇洗涤RNA沉淀；
[0065] (6)4°C最大转速离心5分钟后，除去液体，自然干燥RNA;
[0066] (7)加入30-50微升DEPC水溶解RNA，测定浓度后，低温保存。
[0067] 提取组织的总RNA通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测 定RNA溶液的纯度。经1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
[0068] 2RNA 逆转录成 cDNA
[0069] 使用M-MLV Reverse Transcriptase逆转录cDNA，操作过程如下：RNA2微克； Random Primer 1 微升；Nuclease-Free H2O补至 17微升。
[0070] 反应条件:70°C下加热5分钟，然后立即放在冰上冷却5分钟，离心。
[0071] 在上面的反应体系中加入5XReaction M-MLV Buffer 5微升；dNTP Mixturel .25 微升；Ribonuclease Inhibitor 0.75微升;M-MLV Reverse Transcriptasel微升。上述反 应液混匀后，37°C下1-2小时。用相同体积的ddH20 25微升稀释原来的模版cDNA，-20°C保存 备用。
[0072] 3RT-PCR检测目的基因的表达量
[0073] (1)引物设计：
[0074] TRAIP基因扩增引物：
[0075] 上游引物：5'-CAGAAAGACAAGGAGAAAC-3'（SEQ ID N0.1)
[0076] 下游引物：5'-GCAGAGATACCACAGTAG-3'（SEQ ID N0.2)
[0077] 扩增长度:91bp。
[0078] NAT14基因扩增引物：
[0079] 上游引物：5'-CTCTCTGGGAAGGTTGAG-3'（SEQ ID N0.3)
[0080] 下游引物：5'-TCAGGCTTTATTAACAAACG_3'（SEQ ID N0.4)
[0081 ] 扩增长度:91bp。
[0082] (2)反应体系及反应程序：
[0083]将各样品cDNA取2μ1作模板，分别用目的基因引物和内参基因 β-actin引物进行扩 增。同时在60-95 °C进行溶解曲线分析。
[0084] 表1反应体系
L0086J 反应程序：95 °C预变性10秒，35个循环(95 °C变性5秒，58 °C延伸30秒），循环结束后 4°C保存。
[0087] 4统计学处理
[0088]采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P〈 0.05差异有显著性意义。
[0089] 5实验结果
[0090] 取5ylRNA，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，条带清晰，结果显示肝癌组织样本RNA抽提 合格。
[0091]各样本实时扩增曲线拐点清楚、整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极 限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线都是 单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；比较不同分化程度组间（I级、π级、m级、IV 级）2个基因的相对表达情况，TRAIP和NAT14基因在高分化时相对表达量较低，低分化时表 达量较高，并且表达趋势显示，2个基因的表达和肝癌的分化高度相关，随着肝癌分化程度 升高基因表达量不断下降(具体见图1)，验证结果与高通量数据分析结果一致。
【主权项】
1. 调节TRAIP和/或NAT14基因表达或蛋白含量的试剂在制备调控肝癌分化制剂中的应 用。2. 抑制TRAIP和/或NAT 14基因表达或降低蛋白含量的试剂在制备肝癌分化诱导剂中的 应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，抑制基因的表达或降低蛋白含量通常可以 采用下述方法中的一种和/或几种:通过激活基因的抑制基因、激活基因的抑制基因表达的 蛋白、采用RNA干扰技术抑制基因表达、激活促进基因 mRNA降解的microRNA、导入促进基因 编码蛋白降解的分子、抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。即通过激活基因的抑制基 因、激活抑制基因表达的蛋白、导入抑制基因表达的siRNA、激活促进基因 mRNA降解的 microRNA、导入促进蛋白降解的分子、抑制促进基因表达的因子及蛋白的表达。4. 检测TRAIP和/或NAT14基因表达情况或蛋白含量的试剂在制备诊断肝癌分化制剂中 的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，TRAIP和/或NAT14基因或其表达产物在高 分化肝癌样本中低表达。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，诊断肝癌分化制剂包括用荧光定量PCR方 法、基因芯片方法、northern杂交方法或高通量测序方法检测样本中TRAIP和/或NAT14基因 表达情况。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR方法检测样本中TRAIP和/或 NAT14基因表达的产品含有特异性扩增TRAIP和/或NAT14基因的引物； 基因芯片方法使用与TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列杂交的探针； northern杂交方法使用与TRAIP和/或NAT14基因的核酸序列杂交的探针。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR方法检测样本中TRAIP基因表 达的引物序列为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2;NAT14基因表达的引物序列为SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4。9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，诊断肝癌分化制剂包括用免疫方法检测样 本中TRAIP和/或NAT14基因表达产物含量，优选的，免疫检测方法检测TRAIP和/或NAT14基 因表达产物含量为western blot和/或ELISA和/胶体金检测方法。10. 根据权利要求5、6或9任意一项所述的应用，其特征在于，样本为肝癌组织。
【文档编号】A61P35/00GK105944102SQ201610527303
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】果春青, 杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司