修饰SiO2纳米载体的制备设备及制备方法
【专利摘要】本发明涉及修饰SiO2纳米载体的制备设备及制备方法；其制备设备包括陶瓷材料制成的反应容器本体、超声波换能器、转子搅拌桨和高频电磁线圈；制备方法是将SiO2纳米粒投入反应容器的双蒸水中；电磁搅拌混匀，重悬，加入十八烷基三甲基溴化铵（OTAB），室温电磁搅拌，离心，静置陈化去上清，双蒸水洗涤，再次重悬，离心，冷冻干燥，即可制成修饰SiO2纳米载体；本发明具有良好生物相容性、无免疫原性。所制备的修饰SiO2纳米载体可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大，不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。
【专利说明】
修饰S i 〇2纳米载体的制备设备及制备方法
技术领域
[00〇1]本发明涉及Si〇2纳米粒载体的制备技术，特别涉及修饰Si〇2纳米载体的制备设备和一种用十八烷基三甲基溴化铵修饰的Si02纳米粒的制备方法;使用该制备设备可以方便制备修饰si〇2纳米载体(OTAB-Si〇2_NP);用该方法制得的修饰Si〇2纳米载体，可以用于对癌症基因治疗。【背景技术】
[0002]近年来，随着基因转移技术的日趋成熟，癌症的基因治疗已成为生物科学和临床医学的研究热点之一。目前，基因治疗研究和临床应用中常用的病毒载体和非病毒载体，都存在无法克服的局限性。随着纳米技术的出现，纳米粒载体以其高转染效率、低毒性、无免疫原性等特点正引起越来越多的关注。癌症和肿瘤已经成为威胁人类健康的杀手，但是目前还没有一种药物可以治愈癌症和肿瘤，所用的治疗癌症的药物多含有毒性，其对癌细胞有抑制作用的同时对正常细胞也有毒害作用。寻找或开发一种可以将抑制癌细胞和肿瘤细胞的药物定向运输到靶细胞的纳米粒载体，且实现药物的缓释是目前研究的热点和难点。在纳米材料中，Si02具有良好的生物相容性、高反应活性表面、独特的跨膜能力、大离域键及无免疫原性等优点，可以与许多生物医药分子之间形成较强的键相互作用，使其在生物医药领域的药物传递和基因载体方面具有巨大的应用潜力。但是，Si02纳米粒(参见附图3)的表面能高，在使用中极易团聚，并且Si02纳米粒与大多数聚合物材料相容性差，此夕卜，Si02纳米粒表面电位为负值，不能携带负电荷的DNA分子。
[0003]因而十八烷基三甲基溴化铵修饰的Si〇2纳米粒的制备和应用尚未有报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的，是要提供一种修饰Si02纳米载体的制备设备;使用该制备设备可以在制备工艺中方便地操作制备修饰S i 〇2纳米载体。
[0005]本发明的另一目的，是还要提供一种具有良好生物相容性、无免疫原性的修饰 Si〇2纳米载体的制备方法。所制备的修饰Si〇2纳米载体的应用，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大，不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。
[0006]本发明所述一种修饰Si02纳米载体的制备设备，包括陶瓷材料制成的反应容器本体、超声波换能器、转子搅拌桨和高频电磁线圈；反应容器本体为有底的圆筒体，内底面正中央设置竖直向上的支撑轴；圆筒体上口有容器盖;所述支撑轴下部分是轴座，上部分是轴杆，轴座和轴杆两者之间有一轴台阶过度连接，且轴座直径大于轴杆直径;上述超声波换能器固定在反应容器本体的外底面;上述转子搅拌桨为金属导体方框架和桨叶组成，方框架上下两框边的中部上下对称地设有轴孔，左右两框边均分别固定有桨叶，方框架表面衬耐腐蚀材料;所述转子搅拌桨放置在反应容器本体的容腔内，其方框架通过轴孔套在支撑轴的轴杆上可以自由旋转；上述高频电磁线圈由带磁极靴的环形磁芯和线圈所组成;磁极靴有四个，对称地分布在环形磁芯的内环；四个磁极靴上均缠绕有线圈，并紧贴在反应容器本体外筒壁上。
[0007]本发明修饰S12纳米载体的制备方法是:将S12纳米粒投入反应容器的双蒸水中；电磁搅拌混匀，超声波振动使S12纳米粒重悬于双蒸水中；加入十八烷基三甲基溴化铵(OTAB)，室温电磁搅拌3h;离心30min，静置陈化12?20h去上清;沉淀物用双蒸水洗涤三次，返回反应容器再次重悬，离心;所得离心沉淀物冷冻干燥，即可制成修饰S12纳米载体;所述修饰Si02纳米载体颗粒的平均直径为20?50nm。
[0008]所述十八烷基三甲基溴化铵(别名OTAB或STAB;硬脂基三甲基溴化铵;溴化三甲基十八烷基钱;三甲基十八烷基溴化铵)是一种化学物质，分子式是C21H46BrN;原料为白色或微黄色固体;凝固点32°C，HLB值15.8;溶于水，稳定性好，耐热，耐光，耐强酸、强碱，可微生物降解;一般用作表面活性剂，还应用于催化剂，乳化剂，消毒剂，杀菌基，抗静电剂。
[0009]所述的双蒸水是重蒸水的一种，重蒸水是将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水。
[0010]本发明利用专门的修饰S12纳米载体的制备设备;使比重与水相差较大的S12纳米粒在充满微泡且高速旋转的双蒸水中得以悬浮;提高了 S12纳米粒的表面活性，利于十八烷基三甲基溴化铵中的氨基结合。当十八烷基三甲基溴化铵(OTAB)修饰S12纳米粒后所形成的沉淀物，其修饰层并不是理想的均匀包裹海绵层，而是处于大小不一、部分残缺粘连的团聚体;为了对该沉淀物整形，本发明设计了返回反应容器再次重悬工序;此时，开启变频器将高频电流工作频率调整为1000Hz，使转子搅拌桨以28000r/min的旋转速度搅拌双蒸水；同时调整变频器的高频电流强度，使反应容器外加高频电磁线圈所产生的磁场强度达5-8T;经高频磁场中高速旋转的双蒸水吹打产生分散团聚体的剪切力，S12纳米颗粒中和S12纳米颗粒表面海绵层中所携带互异的电荷，在强交变磁场的洛伦兹力作用下，按照变频器的电流频率产生强力振动;两力共同作用的结果，修饰S12纳米团聚体迅速瓦解，变成一个个的S12纳米颗粒表面均包裹特殊官能基团海绵体的球体。由此，可见，本发明使用专用的修饰S12纳米载体的制备设备，不但能够实现利用电磁搅拌和超声波振动，使得S12纳米颗粒重悬和修饰S12纳米载体颗粒再次重悬;还可以利用搅拌双蒸水的剪切力和强交变磁场的洛伦兹力实现修饰Si02纳米团聚体瓦解，变成一个个的修饰Si02纳米颗粒的球体。
[0011]本发明利用十八烷基三甲基溴化铵(OTAB)修饰S12纳米粒，使S12纳米粒的Zeta电位变为正值，S12纳米粒因此可以通过静电作用结合DNA，大大提高治疗基因的转染效率。
[0012]上述的Zeta电位又叫电动电位或电动电势，是指剪切面的电位，是表征胶体分散系稳定性的重要指标。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:用本发明获得的修饰S12纳米载体，平均直径为20?50nm，Zeta电位变为正值，亲水性强;通过修饰赋予了 S12纳米粒表面特殊的官能基团；参见附图4，该特殊的官能基团是带正电荷的氨基;在水介质中负载含羰基的抗肿瘤药物或肿瘤新生血管抑制剂具有两亲性质，不仅可有效结合DNA，而且可保护DNA免受破坏，并具有较高的体外基因转运效率;本发明使用专用的修饰S12纳米载体的制备设备操作简单，无须加热，成本低，易于规模生产，可以应用于对癌症基因治疗，它作为DNA结合载体材料安全，不存在毒性的风险，可有效解决现有肿瘤治疗药物副作用大，不能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。【附图说明】
[0014]图1为本发明修饰Si〇2纳米载体的制备设备示意图。[0〇15]图2为图1的A-A剖视不意图。[〇〇16] 图3为Si02纳米粒透视电镜图。[0〇17]图4为本发明修饰Si〇2纳米载体示意图。
[0018]图5为本发明修饰Si〇2纳米载体材料透视电镜图。[0〇19]图6为图5局部放大不意图。
[0020]图7为实施例2合成的修饰Si02纳米载体加入抗肿瘤LivinlshRNA质粒后的显微镜成像示意图。[0021 ]附图标记是:1反应容器本体;2超声波换能器;3转子搅拌桨;4高频电磁线圈；5容器盖;6轴座;7轴杆;8方框架;9桨叶；10轴孔;11磁极靴;12环形磁芯；13线圈。【具体实施方式】[〇〇22]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。[〇〇23] 实施例1一种修饰Si02纳米载体的制备设备，包括陶瓷材料制成的反应容器本体1、超声波换能器2、转子搅拌桨3和高频电磁线圈4;反应容器本体1为有底的圆筒体，内底面正中央设置有竖直向上的支撑轴；圆筒体上口有容器盖5;所述支撑轴下部分是轴座6，上部分是轴杆7，轴座6和轴杆7两者之间有一个轴台阶过渡连接，且轴座6直径大于轴杆7直径;上述超声波换能器2固定在反应容器本体1的外底面;上述转子搅拌桨3为金属导体方框架8和桨叶9所组成，方框架8表面衬耐腐蚀材料;方框架8上下两框边的中部分别设有上下对称的轴孔10，左右两框边分别固定有桨叶9;所述转子搅拌桨3放置在反应容器本体1的容腔内，其方框架8 通过轴孔10套在支撑轴的轴杆7上，由轴座6支撑可以自由旋转;上述高频电磁线圈4由带磁极靴11的环形磁芯12和线圈13所组成;磁极靴11有四个，中心对称地分布在环形磁芯12的内环；四个磁极靴11上均缠绕有线圈13,并紧贴在反应容器本体1外筒壁上。[〇〇24] 所述高频电磁线圈4外接高频移相电容和变频器;变频器输出频率1000-1200HZ可调的高频电流;所述超声波换能器2外接输出功率60w的超声波发生器;超声波发生器工作频率45-50kHz。[〇〇25]本发明修饰Si02纳米载体的制备方法是:将Si02纳米粒lg投入反应容器的双蒸水中；电磁搅拌混匀，超声波振动使Si02纳米粒重悬于双蒸水中；加入0.lg十八烷基三甲基溴化铵(0TAB)，室温电磁搅拌3h，离心30min，静置陈化12?20h去上清;沉淀物用双蒸水洗三次，返回反应容器再次重悬，离心，所得离心沉淀物冷冻干燥，即可制成修饰Si02纳米载体； 并进行透射电镜扫描(JEOL JEM-1200EX)，结果见图5、图6;所述修饰Si02纳米载体颗粒的平均直径为20?50nm〇
[0026]上述的将Si02纳米粒投入反应容器的双蒸水中，Si02纳米粒与双蒸水的固液质量体积比为1:4?8g/L。[〇〇27]上述的重悬是使用修饰Si02纳米载体的制备设备;开启变频器将高频电流工作频率调整为1100Hz，使转子搅拌桨3以30000r/min的旋转速度搅拌双蒸水;开启超声波发生器产生超声波振打，将S12纳米粒分散均匀;所述的超声波振动时间30min。
[0028]上述室温搅拌转速30000r/min。
[0029]上述的再次重悬是将洗涤收集的沉淀物返回修饰S12纳米载体的制备设备中，开启变频器将高频电流工作频率调整为1000Hz，使转子搅拌桨3以28000r/min的旋转速度搅拌双蒸水；同时调整变频器的高频电流强度，使反应容器外加高频电磁线圈4所产生的磁场强度达5-8T;经高频磁场中高速旋转的双蒸水吹打分散，使沉淀物颗粒表面形成特殊的官能基团海绵体。
[0030]上述的冷冻干燥是先将离心沉淀物在-60°C下冻结;然后将冻结的离心沉淀物在
0.9?I帕的真空下，再高速离心干燥;高速离心的转速为30000-36000r/ min;干燥时间2-4h0
[0031]实施例2
将所得修饰S12纳米载体可以进一步通过化学偶联交联携带负电荷的DNA分子、或携带含羰基的抗肿瘤药物或肿瘤新生血管抑制剂，从而应用于肿瘤分子成像诊断和siRNA干扰治疗见图7 ;具体步骤是:将制备得到的修饰Si02纳米载体30mg和抗肿瘤LivinlshRNA质粒6mg在50mL双蒸水中混合均匀，在室温下，600r/min搅拌24-48h使其充分反应，经静置陈化8?1h沉淀后，再用双蒸水洗净后，在20-60°C，5?10帕的真空下，干燥12-20h，得到以修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统。
[0032]所述抗肿瘤LivinlshRNA质粒和修饰Si02纳米载体的质量含量比为1:3。
[0033]以修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统的体内抗肿瘤活性测定:取小鼠S180腹水瘤细胞，用注射用生理盐水以3:1比例稀释后，每只小鼠于腹腔注射0.3 mL，小鼠喂养7天后，抽取小鼠S180腹水瘤细胞，计数后以注射用生理盐水稀释成浓度为2X 16个/mL的细胞悬液，皮下接种与小鼠右前肢上部。小鼠接种肿瘤7d后，取其中24只肿瘤体积多100 mm3昆明小鼠，随机分为3组，每组8只。具体分组如下:(I)对照组(NS组):生理盐水；(2)未修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统治疗组;(3)修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统治疗组;3组均采用静脉给药的方式。每2 d给药一次，每次对应组分别注射生理盐水lmL、2mg未修饰Si02纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统、2mg/ Si02纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统ImL;共给药7次。整个实验过程中每日观察小鼠生活状态，每2 d称其体重并使用游标卡尺测量小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V=1/2(AXB2)计算肿瘤体积。当给药以未修饰或修饰Si02纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统时，小鼠的肿瘤体积的增加得到了明显的抑制；与生理盐水组和未修饰的纳米载体组比较，修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统组的效果更好。
[0034]由上业已经证实，以修饰S12纳米载体的抗肿瘤药物传递系统，提高了药物的渗透性，可以作为抗肿瘤药物的载体使用，能很好的抑制肿瘤细胞增殖的问题。同时测试结果表明，本发明的新的以修饰S12纳米载体的抗肿瘤药物传递系统，对生物体的毒性很低，物理以及化学稳定性良好，质量好，制备的条件容易满足，原料来源丰富，成本低。
[0035]本发明预期可以用于治疗肿瘤的一种良好的载体，还可以作为化学药物、蛋白质、核酸的转运载体，是药物制备上的一大创新。
【主权项】
1.一种修饰Si〇2纳米载体的制备设备，包括陶瓷材料制成的反应容器本体(1);其特征 在于:还包括超声波换能器(2)、转子搅拌桨(3)和高频电磁线圈(4);反应容器本体(1)为有 底的圆筒体，内底面正中央设置有竖直向上的支撑轴；圆筒体上口有容器盖(5);所述支撑 轴下部分是轴座(6)，上部分是轴杆(7)，轴座(6)和轴杆(7)两者之间有一个轴台阶过渡连 接，且轴座(6)直径大于轴杆(7)直径;上述超声波换能器(2)固定在反应容器本体(1)的外 底面;上述转子搅拌桨(3)为金属导体方框架(8)和桨叶(9)所组成，方框架(8)表面衬耐腐 蚀材料;方框架(8)上下两框边的中部分别设有上下对称的轴孔(10)，左右两框边分别固定 有桨叶(9);所述转子搅拌桨(3)放置在反应容器本体(1)的容腔内，其方框架(8)通过轴孔 (10)套在支撑轴的轴杆(7)上，由轴座(6)支撑可以自由旋转;上述高频电磁线圈(4)由带磁 极靴(11)的环形磁芯(12)和线圈(13)所组成;磁极靴(11)有四个，中心对称地分布在环形 磁芯(12)的内环；四个磁极靴(11)上均缠绕有线圈(13)，并紧贴在反应容器本体(1)外筒壁 上。2.根据权利要求1所述的一种修饰Si02纳米载体的制备设备，其特征在于:所述高频电 磁线圈(4 )外接高频移相电容和变频器;变频器输出频率1000-1200Hz可调的高频电流;所 述超声波换能器(2)外接输出功率60w的超声波发生器;超声波发生器工作频率45-50kHz。3.—种修饰Si〇2纳米载体的制备方法，其特征是将Si〇2纳米粒投入反应容器的双蒸水 中；电磁搅拌混匀，超声波振动使Si02纳米粒重悬于双蒸水中；加入十八烷基三甲基溴化 铵，室温搅拌3h;离心30min，静置陈化12?20h去上清;沉淀物用双蒸水洗涤三次，返回反应 容器再次重悬，离心;所得离心沉淀物冷冻干燥，即制成修饰Si02纳米载体;所述修饰Si02纳 米载体颗粒的平均直径为20?50nm〇4.根据权利要求3所述的修饰Si〇2纳米载体的制备方法，其特征在于:所述的将Si〇2纳 米粒投入反应容器的双蒸水中，Si02纳米粒与双蒸水的固液质量体积比为1:4?8g/L。5.根据权利要求3所述的修饰Si02纳米载体的制备方法，其特征在于:所述的重悬是使 用修饰Si02纳米载体的制备设备;开启变频器将高频电流工作频率调整为1100Hz，使转子 搅拌桨(3)以30000r/min的旋转速度搅拌双蒸水;开启超声波发生器产生超声波振打，将 Si02纳米粒分散均匀;所述的超声波振动时间30min。6.根据权利要求3所述的修饰Si〇2纳米载体的制备方法，其特征在于:所述室温搅拌转 速30000r/min。7.根据权利要求3所述的修饰Si02纳米载体的制备方法，其特征在于:所述的再次重悬 是将洗涤收集的沉淀物返回修饰Si02纳米载体的制备设备中，开启变频器将高频电流工作 频率调整为1000Hz，使转子搅拌桨(3)以28000r/min的旋转速度搅拌双蒸水；同时调整变频 器的高频电流强度，使反应容器外加高频电磁线圈(4)所产生的磁场强度达5-8T;经高频磁 场中高速旋转的双蒸水吹打分散，使沉淀物颗粒表面形成特殊的官能基团海面体。8.根据权利要求3所述的修饰Si〇2纳米载体的制备方法，其特征在于:所述的冷冻干燥 是先将离心沉淀物在-60 °C下冻结;然后将冻结的离心沉淀物在0.9?1帕的真空下，再高速 离心干燥;高速离心的转速为30000_36000r/ min;干燥时间2_4h。9.一种修饰Si〇2纳米载体的应用，其特征在于:将制备的修饰Si〇2纳米载体进一步通过 化学偶联交联携带负电荷的DNA分子、或携带含羰基的抗肿瘤药物或肿瘤新生血管抑制剂， 从而应用于肿瘤分子成像诊断和siRNA干扰治疗；具体步骤是:将制备得到的修饰Si02纳米载体30mg和抗肿瘤LivinlshRNA质粒6mg在50mL双蒸水中混合均勾，在室温下，600r/min搅拌24-48h使其充分反应，经静置陈化8?1h沉淀后，再用双蒸水洗净后，在20-60°C，5?10帕的真空下，干燥12-20h，得到以修饰S12纳米载体介导的抗肿瘤基因治疗系统;所述抗肿瘤LivinlshRNA质粒和修饰S12纳米载体的质量含量比为1:3。
【文档编号】A61K47/48GK105944116SQ201610518509
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】雷世泽
【申请人】雷世泽