一种素馨苦苷溶液的制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开一种素馨苦苷溶液的制备方法及应用，其中，所述应用是将所述素馨苦苷用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物或保健品。本发明首先确定素馨苦苷对Aβ体外聚集具有抑制作用，然后进一步检测到素馨苦苷在细胞水平上能够影响对AD经典通路相关蛋白的表达水平，并且素馨苦苷对新生鼠原代神经元TAU?ps396的分布及表达变化也有影响，因此本发明可以确定素馨苦苷具有预防或治疗阿尔茨海默病的效果，素馨苦苷可发展为预防和治疗AD的药物或保健品。
【专利说明】
一种素馨苦苷溶液的制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药领域，尤其涉及一种素馨苦苷溶液的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，简称AD)是老年人常见的神经退行性疾 病，以记忆与认知功能障碍为主要症状，其典型的病理特征是脑内形成老年斑（senile plaques, SP)和神经纤维缠结（neurofibrilIary tangles, NFT)。
[0003] AD的发病机制是多种发病因素、多种通路和分子机制的相互参与，在AD发病机制 的众多假说中，Α?3级联假说被广泛认同。该假说认为由Αβ异常聚集形成老年斑而产生的毒 性可能是导致AD发生的主要原因[5,6]。邰在体内是由淀粉样前体蛋白（APP)经过β-分泌酶 与γ-分泌酶剪切而成，在正常的情况下，Αβ代谢保持平衡，不会产生细胞毒性，而病理情况 下Αβ代谢异常形成有毒聚集体从而引起神经毒性，导致AD病理学表现。
[0004] 另一病理假说是在阿尔茨海默病患者体内，异常过度磷酸化的Tau蛋白以配对 螺旋丝结构形成神经原纤维缠结并在神经元内聚积，Tau蛋白异常在AD患者神经变性和 学习记忆障碍的发生发展中起重要作用，细胞内tau蛋白过度磷酸化是AD最早出现的病理 改变之一。最近国外报道一些抗AD新药临床试验失败，其原因可能是治疗时间太晚和药 物靶点单一。国内外尚无能根本治疗AD的药物，最为常用的胆碱酯酶抑制剂仅能缓解症 状，而不能改变疾病的进程，并且西药效果欠佳，且易形成耐药性，不良反应明显。
[0005] 素馨苦苷作为一种抑菌活性物已有研究，但是至今尚未有任何关于素馨苦苷用于 治疗AD的报道。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种素馨苦苷溶液的制备方法 及应用，主要是将素馨苦苷用于制备预防或治疗阿尔茨海默病的药物或保健品，旨在提供 一种素馨苦苷的新应用。
[0007] 本发明的技术方案如下： 一种素馨苦苷溶液的配制方法，其中，包括将素馨苦苷溶解在DMSO或乙醇溶液中，振荡 混匀，制备成素馨苦苷母液，通过添加PBS缓冲液将所述素馨苦苷母液稀释成不同浓度的素 馨苦苷溶液。
[0008] 所述的素馨苦苷溶液的配制方法，其中，所述素馨苦苷母液的浓度为5mmol/L。
[0009] -种素馨苦苷的应用，其中，将所述素馨苦苷用于制备预防或者治疗阿尔茨海默 病的药物或保健品。
[0010] 有益效果:本发明首先确定素馨苦苷对Αβ体外聚集具有抑制作用，然后进一步检 测到素馨苦苷在细胞水平上能够影响对AD经典通路相关蛋白的表达水平，并且素馨苦苷对 新生鼠原代神经元TAU-p S396的分布及表达变化也有影响，通过本发明可以确定素馨苦苷 具有预防或治疗阿尔茨海默病的效果，素馨苦苷可发展为预防和治疗AD的药物或保健品。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明中ThT荧光法检测不同时间点素馨苦苷对Αβ体外聚集荧光强度变化 图。
[0012] 图2为本发明中圆二色谱法检测素馨苦苷对Αβ成纤维结构变化图。
[0013]图3为本发明素馨苦苷与Αβ共孵育Oh和12h的成纤维变化图。
[0014]图4a至4f为本发明检测的AD相关通路蛋白的凝胶显影图。
[0015]图5a至5i为本发明western blotting检测素馨苦苷作用后AD相关通路蛋白的表 达变化图。
[0016] 图6为本发明AD新生小鼠海马区原代神经元图。
【具体实施方式】
[0017] 本发明提供一种确定中药活性成分素馨苦苷具有治疗阿尔茨海默病的方法，为使 本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0018] 本发明提供一种素馨苦苷溶液的配制方法，其中，包括将素馨苦苷溶解在DMSO或 乙醇溶液中，振荡混匀，制备成素馨苦苷母液，通过添加PBS缓冲液将所述素馨苦苷母液稀 释成不同浓度的素馨苦苷溶液。
[0019] 本发明中用于治疗阿尔茨海默病的中药活性成分是迎春花素(为观办仏），迎春花 素又叫做素馨苦苷，是从木犀科茉莉花属植物迎春花中提炼出来的裂环烯醚萜葡萄苷类 (seco ir ido idglucos ides )，其化学结构式
_单体具有一定的抑菌活性， 对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为lmg/ml，对痢疾杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度 为0.5mg/ml，并且有研究表明，素馨苦苷可诱导RAW264.7细胞显著分泌TNF-α，同时还可激 活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路。
[0020] 进一步，本发明制备的所述素馨苦苷母液的浓度通常为5mmol/L，根据实验需要通 常通过添加I3BS缓冲液将母液进行稀释，通常制备的素馨苦苷终浓度为5ym 〇l/L，10ym〇l/L， 20ymol/L，50ymol/L 和100ymol/L和2 mmol/L等。
[0021] 进一步，本发明还提供一种素馨苦苷的应用，其中，将所述素馨苦苷用于制备预防 或者治疗阿尔茨海默病的药物或保健品。所述素馨苦苷可以为液体或者粉末状。由于传统 中药具有多靶点、多环节、多方式的作用机制，如今中药在治疗AD方面已经起到越来越重要 的作用。但是现如今通过使用素馨苦苷来治疗AD方面的研究尚未有报道，而素馨苦苷由于 其独特的药性可作为预防或治疗AD的有效药物或保健品。。
[0022] 下面通过实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0023]本发明通过先采用硫磺素T荧光法、圆二色谱法和原子力显微镜观察法去观察素 馨苦苷体外作用Αβ聚集的作用效果，初步确定素馨苦苷对Αβ体外聚集具有抑制作用，然后 进一步检测细胞水平上素馨苦苷对AD经典通路相关蛋白表达水平的影响，最后用免疫荧光 法检测新生鼠原代神经元TAU-p S396的分布及表达变化。本发明通过应用多种方法和手段 从分子水平到细胞水平，检测素馨苦苷对AD的治疗效果，结果表明中药活性成分素馨苦苷 具有治疗阿尔茨海默病的效果，素馨苦苷可以成为预防或治疗AD的药物或保健品。
[0024] 实施例1 ThT荧光法检测素馨苦苷对Αβ体外聚集的抑制效果 本发明采用硫磺素T法检测素馨苦苷对Αβ体外聚集的抑制效果，硫磺素T(Thioflavin T，ThT)是一种阳离子荧光试剂，1993年研究发现ThT分子可作为识别Α?3纤维结构并与之结 合的荧光探针，因而ThT法成为了监测与检测Αβ聚集的理想方法。具体地，首先对Αβ样品进 行预处理，取Αβ样品lmg，加入2ml的六氟异丙醇(HFIP)，振荡溶解过夜，取出样品水浴超声 15-20分钟，氮气吹干，然后再加入适量的DMSO(Sigma)充分溶解样品，水浴超声15-20分钟， 将样品-80 °C保存备用；之后配制各种母液，ThT溶解在Tris buffer (50 mmol/L Tris-base, 100 mmol/L NaCl，pH 7 · 4)中，浓度为I mmol/L;处理过的Αβ1_42溶解在110 yL的 DMSO中，浓度为2 mmol/L;Jasminin溶解在DMSO中，浓度为5imimol/L;EGCG溶解在ddH20中， 浓度为5 mmol/L;最后采用EGCG作为阳性对照组，体系总体积为100μΙ，设置组别如表1。
[0025] ThT终浓度为50ymol/L，Af3终浓度为50ymol/L，Jasminin终浓度设4个梯度分别为 10ymol/L，20ymol/L，50ymol/L 和100μ mol/L 〇EGCG终浓度为50ymol/L。将体系各成分加入 到96孔黑色酶标板中，在酶标仪中37°C孵育，检测荧光时间点分别为0，5，15，25，45，65，85， 115，145，205，265，325时的荧光值，根据得到的各组不同时间点的荧光值后作图，如图1所 示，图1为ThT荧光法检测不同时间点Jasminin对Αβ体外聚集荧光强度的变化图，从图中可 以看出Jasminin对Αβ体外聚集有明显的抑制作用，并且不同浓度的Jasminin对Αβ体外聚集 的抑制效果也不同，其中20μηιο1/1的Jasminin的抑制效果最佳，50ymol/L次之，lOOymol/L 再次之，l〇Miol/L的Jasminin在180分钟后效果不佳。
[0026] 实施例2 圆二色谱检测素馨苦苷对Αβ成纤维结构的影响 本发明采用圆二色谱检测素馨苦苷对Αβ成纤维结构的影响，具体地，通过圆二色谱 (circular dichroism spectra，CD)分析Jasminin对Αβ二级结构的影响，将蛋白溶解到5 mmol/L PBS，pH10.0的缓冲液中，以BCA法进行蛋白定量，浓度为400 ymol/L，将Jasminin溶 解于乙醇中，浓度为4mmo 1/L;将EGCG溶解于ddH20，浓度为5mmo 1/L。制备三组样品：（1 )Αβ， 终浓度为2 mmol/L; (2)Jasminin和Αβ终浓度均为2 mmol/L;(3)EGCG和Αβ终浓度均为2 mmol/L〇
[0027] 各组样品混合均匀并室温孵育12 h，采用J-815圆二色谱仪(JASCOJAPAN)于25°C 测定Αβ的⑶谱，参数设置如下，波长范围：255~190 nm;扫描速度:50 nm/min;灵敏度:50 mdeg;反应时间：0.25 s;带宽：1 nm;扫描次数:3,所得结果用0rigin8.0软件作图。如图2 所示，图2为圆二色谱检测Jasminin对Αβ成纤维结构变化图，从图2中可以看出，β折叠在 218 m m处有一特征峰，但不明显，原因是A β单体在孵育12 h后在溶液中形成沉淀，加入 Jasminin或EGCG孵育后，β折叠特征峰消失，并且在230mm处出现一个大而宽的负峰，由此可 知Jasminin和EGCG确实改变Αβ纤维结构，改变β折叠的形成。
[0028] 实施例3 原子力显微镜观察素馨苦苷对Αβ成纤维形态及数量变化的作用效果 进一步，本发明还采用原子力显微镜来观察素馨苦苷对Αβ成纤维形态及数量变化的作 用效果，具体地，将Αβ与Jasminin于37°C条件下共孵育12h，使Αβ终浓度为5ymol/L， Jasminin终浓度为20ymol/L，分别在0h、12h取样进行AFM制样，充分干燥后进行AFM 扫描观察。结果如图3所示，图3为Jasminin与Αβ共孵育Oh与12h成纤维结构及数量的变化， 从图3中可以看出，加入Jasminin孵育12h后Αβ形成纤维明显变短，数量较少，说明Jasminin 具有抑制Αβ聚集的作用。
[0029] 实施例4 在细胞水平上用western blotting法检测素馨苦苷作用后AD相关通路蛋白表达水平 的变化 本发明进一步在细胞水平上用western blotting法检测Jasminin作用后AD相关通路 蛋白表达水平的变化，其包括步骤： 1)、配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶对蛋白样品进行电泳，首先配置分离胶，需根据将要检测 的目的蛋白分子量大小，计算出胶的浓度;待分离胶凝集后，吸去酒精，配置浓缩胶，插入预 先准备好的梳子；待胶凝集好后，上蛋白样品，每孔蛋白上样量l〇-15yg左右，蛋白预染 Marker上样3μ1，上样要避免产生气泡，电泳时上层浓缩胶用80V电压，当样品至下层分离胶 时，用120V电压，一般电泳时间在2h左右，电泳时，内槽采用新配置的I X SDS电泳液，外槽可 用回收的电泳液。
[0030] 2)、电泳后采用PVDF膜进行转膜，具体地，电泳完成后将凝胶板放在电泳缓冲液中 浸泡几分钟。打开胶板，将胶放置于平板上，切除浓缩胶，根据Marker大小分离出所要的分 离胶并泡在电转液中。根据所取分离胶的大小剪取滤纸(三层），并根据滤纸大小剪取PVDF 膜，转膜前先将膜浸泡一下甲醇，尽量避免污染滤纸和膜，将已裁好滤纸和膜完全浸泡于电 泳转移缓冲液中以驱除留于滤纸的气泡。打开转移盒，将浸透后的海绵垫放于转移盒壁上， 再放一张电泳转移缓冲液浸湿的滤纸于海绵上。按"黑色胶板一海绵一3层滤纸（大)一凝 胶一膜一3层滤纸(小)一海绵"的顺序装置好(注意每放一层都需要赶走气泡），再倒一些电 转液到膜上，保持海绵，滤纸，膜的湿润。将缓冲液槽装入冰盒，将4 °C预冷的电泳转移缓冲 液注满电泳槽。连接好转移电极恒流100 mA转移1.5 h。将转膜后凝胶用考马斯亮兰染色 30min-lh，经脱色液脱色至无背景色后，观察胶上是否还有残余的蛋白条带，用于检测转膜 的效果，或用丽春红对PVDF膜进行染色，观察转膜条带并于封闭前洗掉丽春红。
[0031] 3)、转膜结束后将膜放入5%脱脂牛奶中37°C水平摇床上封闭2h。
[0032] 4)、一抗孵育，将所需检测抗体稀释至适当倍数加入封闭液中达到工作浓度，保证 膜的所有部分同溶液接触，一般采用37°C摇床孵育2h或4°C过夜，可根据抗体量和膜上抗原 量适当延长或缩短时间。
[0033] 5)、一抗孵育完成后，将膜取出放置于干净平皿中，加入1XTBST，在摇床上洗涤 15min，换液，反复3~5次。
[0034] 6)、二抗孵育，根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（5%BSA稀 释），洗涤完成后加入二抗3ml左右室温下于摇床孵育2h，保证膜的所有部分同溶液接触。
[0035] 7)、二抗孵育完成后，将膜条取出放置于干净的培养皿中，加入IX TBST，在摇床上 洗涤15min，换液，重复3次。
[0036] 8)、采用增强化学发光法进行显色，具体地，先将两种显色底物A液Iml，B液2μ1进 行混合，将混合物均匀滴加覆盖在膜表面1-2分钟，可见发光的条带，取出PVDF膜并用保 鲜膜把PVDF膜包起来，擦去多余的显色液，放入夹板中，在暗室中将X光片剪至合适大小， 覆盖在PVDF膜的上面，夹好夹子，进行压片曝光，曝光时间根据蛋白显现的荧光亮度决定， 也可不同时间多次压片，曝光完成，打开夹子，迅速将胶片放入显影液中，待出现条带后， 即可终止，取出放入定影液中，以胶片变透明为止，再用自来水冲洗，晾干，扫描拍照，得到 照片如图4a-4f所示。
[0037] 9)、数据图片整理及分析，利用quantity one光密度分析软件对图片进行灰度值 分析，并进行组间t检验;利用Graphpad软件进行数据整理作图分析，p〈0.05具有显著性的 统计学意义，所得分析结果如图5a_5i所示。
[0038] 本发明采用western blotting法主要检测的AD相关通路蛋白有APP, BACE-I， sAPPa，sAPP0，PP2A, p-PP2A，PSD95, Tau5，Tau_ps396，Tau-ps404，Tau_ps422,通过分析 得到的结果如图4a-4f、图5a-5i所示，从图5a-5i中可以看出，Jasminin作用后，AD相关通路 的蛋白表达量发生了变化，具体地，Jasminin作用后，AD相关通路降低了 APP、Tau-ps396、 Tau-pS404、Tau-ps422的表达，升高了 PSD95的表达，并且其变化是具有统计学意义的。 [0039] 实施例5 免疫荧光法观察素馨苦苷作用后新生鼠原代神经元TAU-pS396的分布及表达变化 进一步，本发明采用免疫荧光法观察素馨苦苷作用后新生鼠鼠原代神经元PTAU396的 分布及表达变化，具体地，首先将3 X Tg AD新生鼠海马区原代神经细胞培养在含有细胞爬 片的24孔板中，然后将培养好的原代神经细胞(第八天），以Iml的4% PFA固定20-30 min，以 4°C的I3BS洗2次，每次5 min，接着往孔板中加入0.2%TritonX-100，每孔加500μ1静置IOmin 后，用I3BS洗涤2次，每次5min;洗涤完成后，采用I 3BST配制10%goat抗体，4°C封闭Ih，往孔板 中加入一抗（MAP-2 :1:10000稀释，chicken polyclonal，Abeam: synaptophysin: 1: 200 稀释，rabbit monoclonal, Abcam，10% goat配制），每孔加300yl，4°C孵育过夜，孵育后米 用PBS洗涤3次，每次洗涤时间依次为5min，IOmin，15min;洗涤完成后，往孔板中加入二抗 (goat-anti-chichen_Alexa594或goat-anti-rabbit_Alexa488，均为 1: 200稀释，Abeam， 10% goat配制），每孔加入300μ1，室温孵育lh，孵育后采用I3BS洗涤3次，每次洗涤时间依次 为5min，10min，15min;洗涤完成后再往孔板中加入5μg/ml DAPI进行染色，每孔加入500μ1， 染色时间为4min，染色后采用PBS洗涤3次，每次洗涤时间依次为5min，10min，15min;接着采 用甘油或者PBS溶液进行封片，用中性树脂固定好细胞爬片并使其保持在4°C且避光，最后 采用共聚焦显微镜处理和分析数据。
[0040] 本发明通过免疫荧光法得到的实验结果如图6所示，图6为Jasminin作用后AD新生 鼠海马区原代神经元图，从图6中可以看出，在加入Jasminin培养24h后的原代神经元树突 较多，且长，树突分支末端与两个对照组相比，Tau-ps396形成点状聚集较少，说明Jasminin 减少Tau-ps396含量，对微管结构起稳定作用。
[0041]综上所述，本发明首先确定素馨苦苷对Αβ体外聚集具有抑制作用，然后进一步检 测到素馨苦苷在细胞水平上能够影响对AD经典通路相关蛋白的表达水平，并且素馨苦苷新 生鼠鼠原代神经元TAU-pS396的分布及表达变化也有影响，通过本发明确定素馨苦苷具有 预防或治疗阿尔茨海默病的效果，素馨苦苷可发展为预防和治疗AD的药物或保健品。
[0042]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可 以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。
【主权项】
1. 一种素馨苦苷溶液的配制方法，其特征在于，包括将素馨苦苷溶解在DMSO或乙醇溶 液中，振荡混匀，制备成素馨苦苷母液，通过添加 PBS缓冲液将所述素馨苦苷母液稀释成不 同浓度的素馨苦苷溶液。2. 根据权利要求1所述的素馨苦苷溶液的配制方法，其特征在于，所述素馨苦苷母液的 浓度为5mmol/L。3. -种素馨苦苷的应用，其特征在于，将所述素馨苦苷用于制备预防或者治疗阿尔茨 海默病的药物或保健品。
【文档编号】A61K36/63GK105963245SQ201610253704
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】应明, 钟亦逸, 刘琼, 贺震旦, 倪嘉缵
【申请人】深圳大学