一种生物补片的交联方法以及交联生物补片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物补片的交联方法以及交联生物补片。该交联方法工艺简单，交联效率较高，能够保留胶原的天然三维结构，所获得的交联生物补片的机械强度和柔韧性较高，长期保存不会出现发黄以及易于钙化的现象。本发明实施例提供一种生物补片的交联方法，所述生物补片为脱细胞后的细胞外基质，包括：步骤1)将所述生物补片置于含有脱水缩合剂的溶液中进行脱水缩合反应；其中，所述脱水缩合剂为碳化二亚胺；或者，将所述生物补片置于含有天然生物交联剂的溶液中，使得所述生物补片上的胶原分子与所述天然生物交联剂进行交联反应；步骤2)对所述生物补片进行清洗，停止反应。
【专利说明】
一种生物补片的交联方法以及交联生物补片
技术领域
[0001]本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种生物补片的交联方法以及交联生物补片。
【背景技术】
[0002]近年来，生物补片已用于各种组织器官的小面积损伤修复中，例如:皮肤、胸膜、颅骨、肿瘤等手术后的小面积损伤填补均会用到生物补片。在乳房整形手术中，患者大面积肌肉缺失，在将生物补片植入机体内时，能够起到固定支撑的作用，从而能够减少乳房假体移位、下垂，减小患者的机体排斥反应。
[0003]但是，生物补片在用于临床时，由于其机械强度较低，降解速率较快，仍然容易引发术后并发症，难以满足临床需求，鉴于此，人们通过在生物补片内引入交联剂，以改变胶原分子的结构来提高生物补片的机械性能和柔韧性。
[0004]现有的交联方法中最为常见的为:采用戊二醛通过缩醛反应来进行交联固定，以及采用环氧化合物进行交联固定，醛类物质与环氧化合物均为人工合成，毒性相对较高，尤其是采用缩醛反应所获得的生物补片降解时会释放出醛的残留毒性，表现出较大的细胞毒性。
[0005]专利号为CN200510120796.5中采用非醛类交联剂对所述生物补片进行交联固定，以提高生物补片的机械强度以及韧性，具体的，采用酰胺以及环氧化物与胶原分子中的氨基、巯基反应生成环氧键，以减少体内酶对生物补片的攻击位点，在此过程中，所述环氧化物不稳定，容易发生开环反应，并且所述环氧化物与胶原分子进行反应时，所述胶原分子需要与所述环氧化物中的两个或者多个环氧键结合才能交联形成网状结构，反应时间长，交联效率较低，难以实现产业化，所获得的产物在植入机体内时容易发生钙化现象，长期存在下变硬、变脆，从而使得力学性能降低，难以与原生物质长合在一起，虽然在该专利中，通过引入聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸等高分子聚合物链以提高生物补片的韧性，但是，该生物补片在植入机体内时容易引起三维结构的塌陷，发生纤维包裹，使得该生物补片与原生组织的降解速度不一致，难以与原生物质长合以及容易出现炎症反应的缺陷。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于，提供一种生物补片的交联方法以及交联生物补片。该交联方法工艺简单，交联效率较高，能够保留胶原的天然三维结构，所获得的交联生物补片的机械强度和柔韧性较高，长期保存不会出现发黄以及易于钙化的现象。
[0007]为达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]—方面，本发明实施例提供一种生物补片的交联方法，包括:
[0009]步骤I)将脱细胞后的细胞外基质置于含有脱水缩合剂的溶液中进行脱水缩合反应，其中，所述脱水缩合剂为碳化二亚胺；
[0010]或者，将脱细胞后的细胞外基质置于含有天然生物交联剂的溶液中，使得所述生物补片上的胶原分子与所述天然生物交联剂进行交联反应；
[0011]步骤2)对所述生物补片进行清洗，停止反应。
[0012]可选的，所述碳化二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐。
[0013]优选的，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有:N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酸酰胺。
[0014]进一步优选的，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有酸性缓冲剂，使得反应体系的pH值为4.5-6.5。
[0015]可选的，所述酸性缓冲剂为2-N吗啉乙磺酸。
[0016]优选的，所述天然生物交联剂选自花青素、核黄素、核糖和京尼平中的任意一种。
[0017]可选的，所述步骤2)中的清洗溶液选自磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液、hank液和水中的一种或者几种。
[0018]优选的，所述步骤I)中脱水缩合反应的温度为20_30°C，反应时间为6_12h。
[0019]可选的，所述步骤I)中交联反应的温度为30-37°C，反应时间为12h-48h。
[0020]另一方面，本发明实施例提供一种通过上述所述的方法制备获得的交联生物补片。
[0021]本发明实施例提供的一种生物补片的交联方法以及交联生物补片。该交联方法工艺简单，交联效率较高，其中，所述生物补片中的胶原分子在脱水缩合剂的存在下发生自身脱水缩合反应，使得胶原分子的羧基和氨基生成分子内或者分子间的酰胺键，而脱水缩合剂并没有成为实际交联的一部分，在步骤2)中可以清洗掉，从而能够保持胶原的天然三维结构，细胞毒性小，而天然生物交联剂几乎无细胞毒性，与人工合成的化合物相比，所获得的生物补片的生物相容性好，安全性好，通过上述交联方法所获得的生物补片具有较高的机械强度和柔韧性，长期保存不会出现发黄以及易于钙化的现象。
【附图说明】
[0022]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0023]图1为本发明实施例提供的一种生物补片的交联方法的流程图；
[0024]图2为本发明实施例提供的一种碳化二亚胺与胶原分子发生交联反应的机理图；
[0025]图3为本发明实施例提供的在N-羟基-琥珀酸酰胺存在下碳化二亚胺与胶原分子发生交联反应的机理图；
[0026]图4为本发明实施例提供的实施例1和对照例在不同反应阶段的收缩温度增加量与自由氨基的消耗量的关系曲线图；
[0027]图5为本发明实施例提供的交联之前的生物补片的DSC图谱；
[0028]图6为本发明实施例提供的生物补片A的DSC图谱。
【具体实施方式】
[0029]现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0030]本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过
【申请人】获取。
[0031 ] 一方面，本发明实施例提供一种生物补片的交联方法，参见图1，包括:
[0032]步骤I)将脱细胞后的细胞外基质置于含有脱水缩合剂的溶液中进行脱水缩合反应，其中，所述脱水缩合剂为碳化二亚胺；
[0033]或者，将脱细胞后的细胞外基质置于含有天然生物交联剂的溶液中，使得所述生物补片上的胶原分子与所述天然生物交联剂进行交联反应；
[0034]步骤2)对所述生物补片进行清洗，停止反应。
[0035]所述碳化二亚胺是一种多肽缩合剂，碳化二亚胺与胶原分子进行交联的反应机理参见图2所示，碳化二亚胺I与胶原分子2的羧基耦合形成O-异酰基脲活化中间体3，这一活化中间体3受到胶原分子2中-NH2的进攻脱去，形成酰胺4和脲5，活性中间体3可以与另一胶原分子2的羧酸反应生成酸酐6，酸酐6与胶原分子2中的-NH2反应也得到酰胺4，在此过程中，碳化二亚胺仅起到脱水缩合作用，并不成为交联产物的一部分。
[0036]本发明实施例提供的一种生物补片的交联方法。该交联方法工艺简单，交联效率较高，其中，所述脱细胞后的细胞外基质中的胶原分子在脱水缩合剂的存在下发生自身脱水缩合反应，使得胶原分子的羧基和氨基生成分子内或者分子间的酰胺键，而脱水缩合剂并没有成为实际交联的一部分，在步骤2)中可以清洗掉，从而能够保持胶原的天然三维结构，细胞毒性小，而天然生物交联剂几乎无细胞毒性，与人工合成的化合物相比，所获得的生物补片的生物相容性好，安全性好，通过上述交联方法所获得的生物补片具有较高的机械强度和柔韧性，长期保存不会出现发黄以及易于钙化的现象。
[0037]本发明的一实施例中，所述碳化二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐。
[0038]由于1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的细胞毒性小，具有良好的水溶性，可以将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐与胶原分子在水溶液中进行脱水缩合反应，并且在反应完成之后1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐容易用水清洗，能够进一步减少碳化二亚胺的残留，从而进一步减小细胞毒性反应。
[0039]本发明的一实施例中，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有:N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酸酰胺。
[0040]由于碳化二亚胺在与胶原分子中的羧基反应生成O-异酰基脲活化中间体3时，参见图2，该活化中间体3不稳定，会重排生成N-酰基脲7副产物，当所述脱水缩合剂包括N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酸酰胺时，N-羟基苯并三氮唑与N-羟基-琥珀酸酰胺可以与0-异酰基脲活化中间体3的羧基形成较为稳定的中间体，在此以N-羟基-琥珀酸酰胺为例进行说明，参见图3，N-羟基-琥珀酸酰胺8可以与O-异酰基脲活化中间体3的羧基形成较为稳定的中间体9，所述中间体9与胶原分子2中的氨基反应生成酰胺4，从而能够提高产率，减少副反应的发生。
[0041]本发明的一实施例中，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有酸性缓冲剂，使得反应体系的pH值为4.5-6.5。
[0042]在上述pH值下，能够最大程度上提高交联效率与交联度。
[0043]其中，对所述酸性缓冲液的种类不做限定。
[0044]本发明的一实施例中，所述酸性缓冲液为2-N吗啉乙磺酸。
[0045]在碳化二亚胺/N-羟基-琥珀酸酰胺/2-N吗啉乙磺酸体系中，能够提高脱水缩合的反应速度，缩短反应时间。
[0046]其中，对所述天然生物交联剂的种类不做限定。
[0047]本发明的一实施例中，所述天然生物交联剂选自花青素、核黄素、核糖和京尼平中的任意一种。
[0048]其中，花青素是纯天然的抗衰老的营养补充剂，能够营养皮肤，增强皮肤免疫力，通过对弹性蛋白酶和胶原蛋白酶的抑制使皮肤变得光滑而富有弹性，在将花青素引入细胞外基质中时，由于花青素分子中含有较多的酚羟基、醇羟基以及醚键，能够与所述细胞外基质中的胶原分子中的羟基、氨基和羧基形成氢键，帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，从而提高细胞外基质的机械强度，同时，所述花青素能够为机体再生提供营养，从而加快机体恢复，减慢所述生物补片在体内的降解速率;核黄素又称为维生素B2，为一种安全性较高的天然生物交联剂，核黄素分子可以在胶原纤维之间形成一系列生化“桥梁”，从而能够提高细胞外基质的交联度，提高细胞外基质的机械强度;核糖是一种五碳醛糖，核糖分子中存在醚键、醇羟基，同样能够与所述细胞外基质的胶原分子的氨基和羧基产生氢键，从而能够形成交联产物;所述京尼平是一种从栀子中提取的环烯醚萜苷，是一种天然的生物交联剂，其毒性远低于人工合成交联剂，例如，戊二醛、环氧化合物等，所述京尼平与胶原分子进行交联反应时，机理为:所述京尼平上的烯碳原子受到胶原分子的氨基的亲核进攻，开环形成杂环胺化合物，京尼平上的酯基团与氨基反应生成酰胺释放出甲醇，可见，所述京尼平可以与所述细胞外基质进行交联反应形成网状结构，从而能够提高细胞外基质的机械强度。
[0049]其中，对所述步骤I)中脱水缩合反应的温度和时间不做限定。
[0050]本发明的一实施例中，所述步骤I)中脱水缩合反应的温度为20_30°C，反应时间为
6-12ho
[0051]该反应较为温和，交联度效率较高。在反应过程中，可以通过实时取样的方式对反应的交联效率进行检测。
[0052]具体的，与现有技术中的环氧化合物相比，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与胶原分子发生交联反应时，每减少一个氨基就生成一个酰胺键，而一个环氧化合物中的两个环氧基需要与两个氨基发生反应才能够形成交联产物，由于反应过程中分子间的相互作用，环氧化物与两个氨基均反应所消耗的能量大于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐消耗两个氨基所消耗的能量，因此，交联效率较高，反应条件较为温和。
[0053]其中，对所述步骤I)中交联反应的温度和时间不做限定。
[0054]本发明的一实施例中，所述步骤I)中交联反应的温度为30-37°C，反应时间为12h_48h0
[0055]该反应也较为温和，交联效率也较高。同样的，在反应过程中，可以通过实时取样的方式对反应的交联效率进行检测，具体反应机理不再赘述。
[0056]其中，对所述反应过程中交联效率的检测方法不做限定。所述交联效率可以通过升高温度检测自由氨基的消耗量来获得。若升高单位温度氨基的消耗量小，说明自由氨基的数量少，交联效率较高。
[0057]其中，对所述步骤2)中的清洗溶液不做限定。
[0058]本发明的又一实施例中，所述步骤2)中的清洗溶液选自磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液、Hanks液和水中的一种或者几种。Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液。
[0059]例如，可以用磷酸盐缓冲液进行清洗，也可以先采用磷酸盐缓冲液进行清洗，再用水进行清洗。
[0060]其中，对清洗的温度不做限定，本发明的一实施例中，所述清洗的温度为2-40°C。[0061 ]其中，当所述清洗溶液为磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液或者Hanks液时，对所述清洗溶液的浓度不做限定。本发明的一实施例中，所述清洗溶液浓度为0.01-0.2mol/L。
[0062]本发明的又一实施例中，所述方法还包括:
[0063]在所述步骤I)之前对所述细胞外基质采用物理交联方法进行交联;或者，
[0064]在所述步骤2)之后对所述生物补片采用物理交联方法进行交联。
[0005]在本发明实施例中，通过物理交联与化学交联相结合，能够进一步提高所述生物补片的机械强度。
[0066]其中，对所述脱细胞后的细胞外基质的获取不做限定。
[0067]本发明的一实施例中，所述方法还包括:获取脱细胞后的细胞外基质;具体为:
[0068]SlOl、将动物膜组织表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0069]S102、将SlOl所获得的膜组织在I %的双氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0070]S103、将杀菌消毒后的膜组织在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0071]S104、将S103所获得的膜组织在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质。
[0072]其中，对所述动物膜组织的获取不做限定。
[0073]所述动物膜组织选自小肠粘膜、腹膜、心包膜、羊膜或者隔膜中的任意一种。
[0074]另一方面，本发明实施例提供一种通过上述所述的交联方法制备获得的交联生物补片。该生物补片能够保持天然的三维结构，细胞毒性小，交联度高，并且该生物补片的机械强度和柔韧性较高，长期保存可不会出现发黄以及易于钙化的现象，该生物补片在植入机体时，具有良好的生物相容性和安全性，利于机体的再生，能够与原生组织很好地长合在一起。
[0075]其中，对所述交联生物补片的机械强度不做限定。
[0076]本发明的一实施例中，所述交联生物补片的拉伸强度为11-12N。拉伸强度是指在外力作用下，材料抵抗永久变形和破坏的能力。
[0077]其中，对所述交联生物补片的交联度不做限定。
[0078]本发明的一实施例中，所述交联生物补片的交联度为78%_79.5%。
[0079]其中，对所述交联生物补片的交联度的测试方法不做限定。
[0080]胶原的交联度可以利用三硝基苯硫酸(TNBS)和氨基酸官能团的化学反应，通过检测其紫外吸光度值来测量交联胶原基质中自由氨基数量，以自由氨基数量的变化来表征胶原的交联度。
[0081]其中，对所述交联生物补片的热稳定性不做限定。
[0082]本发明的一实施例中，所述交联生物补片的变性温度为80_84°C。本发明实施例中，生物补片的热稳定性也有极大的提高。
[0083]其中，对所述交联生物补片的变性温度的测量不做限定。
[0084]可以采用差示扫描量热分析法(DSC)对所述交联生物补片的变性温度进行测量。
[0085]实施例
[0086]下面的实施例用来说明本发明，并不是想限制本发明的范围。以下实施例仅以具体实施过程中各组分的实际添加浓度为例进行说明，实际使用时，各组分的浓度并不对本发明目的的实现构成影响。
[0087]对照例
[0088]为了描述方便，将所述对照例中所获得的交联生物补片记为H;
[0089]生物补片H的制备方法具体为:
[0090]SlOl、将牛心包表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0091]S102、将SlOl所获得的牛心包在在I %的双氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0092]S103、将杀菌消毒后的牛心包在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0093]S104、将S103所获得的牛心包在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质；
[0094]S105、将所获得的脱细胞后的细胞外基质浸泡在置于含有环氧化物的溶液中，在30 0C下进行交联反应，反应3-14天；
[0095]S106、将S105所获得的生物补片依次用0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液和水清洗，获得交联生物补片H。
[0096]实施例1
[0097]为了描述方便，将所述实施例1中所获得的交联生物补片记为A;
[0098]生物补片A的制备方法具体为:
[0099]SlOl、将牛心包表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0100]S102、将SlOl所获得的牛心包在在I %的双氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0101 ] S103、将杀菌消毒后的牛心包在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0102]S104、将S103所获得的牛心包在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质。
[0103]S105、将所获得的脱细胞后的细胞外基质浸泡在置于含有脱水缩合剂的溶液中，所述细胞外基质中的胶原蛋白分子与所述脱水缩合剂在20 V下进行交联反应，反应6h;该脱水缩合剂为0.15M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.06M的琥珀酸酰胺的混合水溶液，所述混合水溶液中添加有0.15M的2-N-吗啉乙磺酸溶液，反应体系的pH值为4.5；
[0104]S106、将S105所获得的生物补片依次用0.0lmol/L的磷酸盐缓冲液和水清洗，获得交联生物补片A。
[0105]实施例2
[0106]为了描述方便，将所述实施例2中所获得的交联生物补片记为B;
[0107]生物补片B的制备方法具体为:
[0108]SlOl、将羊小肠粘膜表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0109]S1 2、将S1I所获得的羊小肠粘膜在在I %的双氧水中浸泡I h，再在7 5 %的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0110]S103、将杀菌消毒后的羊小肠粘膜在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0111]S104、将S103所获得的羊小肠粘膜在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质。
[0112]S105、将S104所获得的细胞外基质在3000yW/cm2的紫外线辐照下进行物理交联；
[0113]S106、将S105所获得的细胞外基质浸泡在含有脱水缩合剂的溶液中，在30°C下反应12h，该脱水缩合剂为0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液，该反应体系的pH值为5.5;
[0114]S107、将S106所获得的生物补片依次用0.2mol/L的氯化钠溶液和水清洗，获得交联生物补片B。
[0115]实施例3
[0116]为了描述方便，将所述实施例3中所获得的交联生物补片记为C;
[0117]生物补片C的制备方法具体为:
[0118]SlOl、将隔膜表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0119]S102、将SlOl所获得的隔膜在在I %的双氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0120]S103、将杀菌消毒后的隔膜在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0121]S104、将S103所获得的隔膜在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质。
[0122]S105、将S104所获得的细胞外基质浸泡在含有脱水缩合剂的溶液中，在25°C下反应1h，该脱水缩合剂为0.1M的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液；
[0123]S106、将S105所获得的生物补片依次用0.lmol/L的Hanks液和水清洗；
[0124]S107、将S106所获得的细胞外基质在3000yW/cm2的紫外线辐照3h进行物理交联，获得交联生物补片C。
[0125]实施例4
[0126]为了描述方便，将所述实施例4中所获得的交联生物补片记为D;
[0127]生物补片D的制备方法具体为:
[0128]SlOl、将隔膜表面的脂肪组织和结缔组织去除；
[0129]S102、将SlOl所获得的隔膜在在I %的双氧水中浸泡lh，再在75%的次氯酸乙醇溶液中浸泡0.5h，对所述膜组织进行杀菌消毒；
[0130]S103、将杀菌消毒后的隔膜在IM的氢氧化钠溶液中浸泡Ih进行脱细胞；
[0131]S104、将S103所获得的隔膜在85%的丙酮溶液中震荡Ih进行脱脂，获得脱细胞后的细胞外基质。
[0132]S105、将S104所获得的细胞外基质浸泡在含有天然生物交联剂的溶液中，在30°C下反应12h，该天然生物交联剂为0.1M的京尼平溶液；
[0133]S106、将S105所获得的生物补片依次用0.lmol/L的Hanks液和水清洗；
[0134]S107、将S106所获得的细胞外基质在3000yW/cm2的紫外线辐照3h进行物理交联，获得交联生物补片D。
[0135]实施例5
[0136]为了描述方便，将所述实施例5中所获得的交联生物补片记为E;
[0137]所述实施例5与所述实施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交联剂为花青素，交联反应的温度为37°C，反应时间为24h。
[0138]实施例6
[0139]为了描述方便，将所述实施例6中所获得的交联生物补片记为F;
[0140]所述实施例6与所述实施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交联剂为核黄素，交联反应的温度为35°C，反应时间为48h。
[0141]实施例7
[0142]为了描述方便，将所述实施例7中所获得的交联生物补片记为G;
[0143]所述实施例7与所述实施例4基本相同，不同的是，所述天然生物交联剂为核糖，交联反应的温度为35°C，反应时间为40h。
[0144]实验例
[0145]对实施例1-7所获得的交联生物补片A-G和对照例中所获得的交联生物补片H分别进行机械强度、交联度以及热稳定性测试。
[0146]1、机械强度测试
[0147]分别检测生物补片A-G的拉伸强度，可以得出:本发明实施例提供的生物补片A-G的拉伸强度分别为12N、11.8N、I IN、11.2N、11.5N、11.8N和11.6N，对照例中生物补片H的拉伸强度为8N。
[0148]2、交联度测试
[0149]利用三硝基苯硫酸(TNBS)和氨基酸官能团的化学反应，通过检测其紫外吸光度值来测量交联胶原基质中自由氨基数量，以自由氨基数量的变化来表征胶原的交联度，并在7天后测量质量失衡率。
[0150]测试结果:实施例1-7所提供的交联生物补片A-G的交联度分别为:79.5%、78.5%、78%、78.6%、79%、79.1%和78.3%，7天后质量失衡率分别为0.29%、0.35%、
0.25%、0.27%、0.3%、0.31%和0.29。对照例中生物补片H的交联度为58%，7天后质量失衡率为0.3%。
[0151]3、交联效率测试
[0152]通过在反应过程中分别对实施例1-7和对照例在不同的反应阶段取样，采用升高温度的方法检测自由氨基的消耗量。
[0153]通过实验发现:实施例1-7升高单位温度氨基的消耗量小，交联效率明显高于对照例;参见图4，为实施例1和对照例在不同反应阶段取样后，收缩温度增加量与自由氨基的消耗量的关系曲线，可以得知:在整个反应过程中，实施例1的曲线的平均斜率即A [ΝΗ2]/ΔTs相对于对照例更小，说明升高单位温度消耗自由氨基的量更小，表明实施例1具有更高的交联效率。
[0154]4、热稳定性测试
[0155]对本发明实施例提供的生物补片以及交联之前的生物补片用差示扫描量热法(DSC)进行热稳定性测试。
[0156]测试结果:参见图5，为交联之前的生物补片的DSC检测结果，它以样品吸热或放热的速率，即热流率dH/dt(单位毫焦/秒)为纵坐标，以温度T为横坐标，可以测定多种热力学和动力学参数，可以得出:交联之前的生物补片的变性温度为56.1°C;参见图6，为交联生物补片A的DSC检测结果，可以得出在交联之后的生物补片A的变性温度约为83.2°C，而交联生物补片G的DSC检测结果经文献报道其变性温度为70°C，因此，可以得知:本发明实施例提供的生物补片的热稳定性有极大的提高。
[0157]综上所述，本发明实施例提供的制备方法工艺简单，交联效率较高，其中，所述脱细胞后的细胞外基质中的胶原分子在脱水缩合剂的存在下发生自身脱水缩合反应，使得胶原分子的羧基和氨基生成分子内或者分子间的酰胺键，而脱水缩合剂并没有成为实际交联的一部分，在步骤2)中可以清洗掉，从而能够保持胶原的天然三维结构，细胞毒性小，而天然生物交联剂几乎无细胞毒性，与人工合成的化合物相比，所获得的生物补片的生物相容性好，安全性好，并且通过上述交联方法所获得的生物补片具有较高的机械强度和柔韧性，长期保存不会出现发黄以及易于钙化的现象。
[0158]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1.一种生物补片的交联方法，所述生物补片为脱细胞后的细胞外基质，其特征在于，包括: 步骤I)将所述生物补片置于含有脱水缩合剂的溶液中进行脱水缩合反应;其中，所述脱水缩合剂为碳化二亚胺； 或者，将所述生物补片置于含有天然生物交联剂的溶液中，使得所述生物补片上的胶原分子与所述天然生物交联剂进行交联反应； 步骤2)对所述生物补片进行清洗，停止反应。2.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述碳化二亚胺为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。3.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有:N-羟基苯并三氮唑或N-羟基-琥珀酸酰胺。4.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述含有脱水缩合剂的溶液中还添加有酸性缓冲剂，使得反应体系的PH值为4.5-6.5。5.根据权利要求4所述的交联方法，其特征在于，所述酸性缓冲剂为2-N吗啉乙磺酸。6.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于， 所述天然生物交联剂选自花青素、核黄素、核糖和京尼平中的任意一种。7.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述步骤2)中的清洗溶液选自磷酸盐缓冲溶液、氯化钠溶液、hank液和水中的一种或者几种。8.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述步骤I)中脱水缩合反应的温度为20-30 0C，反应时间为6-12h。9.根据权利要求1所述的交联方法，其特征在于，所述步骤I)中交联反应的温度为30-37 0C，反应时间为12h-48h。10.—种通过权利要求1-9任一项所述的方法制备获得的交联生物补片。
【文档编号】A61L27/50GK105963783SQ201610284706
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】冉永峰
【申请人】陕西瑞盛生物科技有限公司