一种恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法及其试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法，包括：1)配制体积百分数为0.01?0.05％亚甲蓝的水溶液；2)将脱细胞血管放入装有上述水溶液的透明容器中，置于紫外光照射1?4小时；3)清洗脱细胞血管去除残留物。本发明的方法能够显著恢复脱细胞血管的残余应力和残余应变，不具有溶血作用，符合国家医用材料要求。
【专利说明】
一种恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法及其试剂
技术领域
[0001] 本发明涉及小口径人工血管领域，尤其涉及一种恢复脱细胞血管残余应力和残余 应变的方法及其试剂。
【背景技术】
[0002] 大量研究表明心血管疾病病发率伴随年龄的增长而增长，随着中国人口的老龄化 严重，将出现越来越多的心脑血管患者，其中相当一部分心脑血管患者会出现血管堵塞和 血管坏死，这种情况下就需要血管移植。目前可将他人正常血管移植体内，但此方法供给体 数量少，价格昂贵，且具有强烈的排异;也有用自身其他部分血管移植，如:大隐静脉，乳动 脉等，但此方法会损坏其他部位组织，因此从治疗条件看发展人工血管尤为重要。
[0003] 目前大口径人工血管已经应用的比较成熟，但相比自体血管移植的远期通畅率仍 相差甚远，几乎仅为自体血管通畅率的一半;而在小口径血管的制备中使用的材料除了大 口径血管常用的高分子材料外，生物材料、复合材料均被应用到制备中，虽然出现了不少在 小口径血管研究上的突破，但在临床上的应用仍极为有限，效果极差，远期通畅率不好。究 其原因，可能是由于血管材料性能与原血管差异较大导致的，当血液与人工血管管壁接触 时，由于血管壁粗糙度高、弹性较差，不能像正常血管那样根据血液的脉动进行收缩，容易 形成应力集中，引发了血小板破裂、聚集形成血栓造成血管狭窄，进而影响血管的通畅率， 并有报道表明细胞外基质架构对动脉粥样硬化等心血管疾病具有重要影响。因此发展与人 体血管材料类似，力学性能相仿的人工血管尤为重要。
[0004] 近年来，脱细胞血管一度成为了研究的热点，脱细胞血管的制备原理是利用物理、 化学、生物等方法将异体血管中的细胞清除，保留细胞的外基质，细胞外基质贡献了血管的 大部分力学性能，因此脱细胞血管保留原有血管的大部分力学性能，这有助于细胞的粘附 与生长。近年来，对脱细胞血管力学性质的研究报道不少，但绝大多数对脱细胞血管力学研 究主要是在血管常规的力学性能研究，譬如血管消化前后弹性模量的变化、爆破压力、缝线 耐受力等机械性能的检测指标，且他们的研究结论较为一致，脱细胞血管的爆破压力、缝线 耐受力测试与未处理血管没有显著性差异，弹性模量增大了。表面上看，经过消化过后的血 管去除排异反应的同时，机械性能并没有太多变化，然而本发明研究发现消化处理破坏了 平滑肌细胞、内皮细胞、弹性纤维、胶原纤维相互之间的连接使得脱细胞血管的残余应力减 小，而残余应力对保持血管原有的生理状态意义重大。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术中的缺陷，本发明提供一种恢复脱细胞血管残余应力和残余应变 的方法，包括：1)配制体积百分数为0.01-0.05%亚甲蓝的水溶液;2)将脱细胞血管放入装 有上述水溶液的透明容器中，置于紫外光照射2-4小时;3)清洗脱细胞血管去除残留物。
[0006] 作为优选，本发明恢复脱细胞血管力学性能的方法，包括：1)配制含有50-200u/ml 肝素，体积百分数为〇. 01-0.03 %亚甲蓝和体积百分数为0.125 %的双氧水的水溶液;2)将 脱细胞血管放入装有上述水溶液的透明容器中，置于紫外光照射2-4小时;3)清洗脱细胞血 管去除残留物。
[0007]作为进一步优选，步骤1)还包括向水溶液中通入氧气。
[0008] 本发明还提供一种用于恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的试剂，所述试剂包 括体积百分数为〇. 〇 I -〇. 03 %亚甲蓝的水溶液。
[0009] 作为优选，本发明的试剂中还包括抗凝剂和/或杀菌剂。
[0010]进一步优选，抗凝剂包括但不限于肝素，EDTA，草酸钠，枸橼酸盐中的一种或几种。 更优选，50-200u/ml肝素。
[0011] 进一步优选，杀菌剂包括但不限于双氧水。更优选，体积百分数为0.125%的双氧 水。
[0012] 本发明还提供一种体积百分数为0.01-0.03%亚甲蓝水溶液用于恢复脱细胞血管 残余应力和残余应变的用途。
【附图说明】
[0013] 图1戊二醛交联与脱细胞血管张开角均值比较
[0014] 图2不同条件下的光氧化交联张开角均值比较 [0015]图3正常血管、脱细胞血管与最佳交联血管张开角比较 [0016]图4正常血管、脱细胞血管、交联血管内外壁应变均值比较
【具体实施方式】
[0017] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明 书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0018] 制备例1:脱细胞血管的制备
[0019] 1.1大鼠左颈总动脉的获取
[0020] 所有大鼠均来自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心，动物性别为雄性， 体重300g±25,采用断颈法将大鼠处死。待大鼠死亡后，将大鼠固定在泡沫板上，然后使用 无菌镊子和剪刀将大鼠颈部的毛剪掉，破开颈部寻找到大鼠左颈总动脉，找到大鼠左颈总 动脉后，沿着左颈总动脉下端(连接心脏处)至上端(动脉分叉处)逐步将附着其上的神经和 肌肉组织去除使其仅保留血管。待去除左颈总动脉表面的神经与肌肉后，用相机拍下在体 管并测量其长度，之后从左颈总动脉下端(连接心脏处）、上端(动脉分叉处)剪下血管并用 相机拍下其离体照片并测量其长度。
[0021] 1.2大鼠左颈总动脉的预处理
[0022]取下大鼠左颈总动脉之后，立即放入装有PBS溶液的容器内，取用镊子将残留在血 管壁上的神经纤维与肌肉组织撕掉，用注射器往血管内腔灌注PBS溶液将滞留在血管内部 的血液冲洗干净，冲洗5-8次即可，然后进行预处理，预处理步骤如下：
[0023] 1)取得的大鼠左颈总动脉放于装有三蒸水的EP管内，并在摇床上低渗处理24小时 以便使血管内皮细胞和平滑肌细胞破裂，温度为37°C，转速120r/min;
[0024] 2)在低渗处理之后将EP管内的蒸馏水倒掉，装入PBS溶液，然后放于-80 °C冰箱、37 °C水浴锅交替处理3次，每次处理时间2小时，-80°C、37°C水浴锅处理分别1小时，旨在进一 步破坏血管壁细胞；
[0025] 3)反复冻融之后，将EP内的PBS溶液倒掉，再往EP管内加入70 %的酒精，并用注射 器往血管内腔灌注酒精使其充满液体，然后在室温下处理24小时进行去脂处理，并在第2、 4、8、14小时换液，最后一次换成PBS溶液。
[0026] 1.3大鼠左颈总动脉的消化处理
[0027] 在大鼠左颈总动脉经过预处理后，紧接着便进行消化处理，消化处理的具体步骤 如下：
[0028] 1)预处理后的大鼠左颈总动脉放入PBS溶液的EP管内，用注射器向血管内部灌注 溶液进行清洗，清洗5-8次，然后置于摇床上处理2小时，每隔半小时换液，每次换液时同样 用注射器进行冲洗，温度为37°C，转速120r/min;
[0029] 2)待经预处理的血管清洗完毕后，将其放入0.125 %胰酶溶液中处理1.5小时，并 置于摇床上，转速120r/min，温度37 °C，放入胰酶溶液之前用注射器将胰酶溶液向血管腔内 灌注，使其腔内充满溶液，且每隔半小时用注射器灌注一次；
[0030] 3)将经过胰酶消化处理后的血管放入PBS溶液的EP管内，并置于床上处理2小时， 每隔半小时换液，期间每次用注射器冲洗，温度为37°C，转速120r/min。
[0031 ]制备例2:脱细胞血管的戊二醛交联-对照组
[0032]戊二醛交联一般是酸催化交联，戊二醛上的醛基会与羟基或者氨基进行反应，可 将单体、线型高分子转变成三维网状结构的物质，从而提高胶原纤维的拉伸强度及抗降解 能力，并对其生物力学性质有一定的影响，因此本发明选用戊二醛作为其中一种交联试剂， 方法如下：
[0033] ①用PBS将50%的戊二醛溶液稀释为0.25% ;
[0034]②用注射器将0.25%的戊二醛溶液向脱细胞血管管腔内注入，使管腔内充满液 体，之后再整根浸泡于溶液中30分钟，环境为4 °C冰箱内；
[0035]③交联完成后取出血管放入PBS中，并用注射器反复冲洗内部，然后置于摇床上6 小时，间每隔一小时换液。
[0036] 制备例3_5(本发明组1-3)
[0037] 实验步骤如下：
[0038] ①0.01%亚甲蓝+紫外照射（2h)
[0039] 1)配置含有10011/1111肝素、0.01%亚甲蓝的去离子水；
[0040] 2)向配置的溶液中通氧，并加入双氧水溶液使其浓度为0.125% ;
[0041] 3)将脱细胞血管放入装有配置溶液的透明EP管内，并用注射器向脱细胞血管管腔 灌注溶液，然后置于中波长的紫外光下照射2小时；
[0042] 4)待脱细胞血管经过紫外交联完后，将其放入PBS溶液的EP管内，并置于摇床上处 理2小时，每隔半小时换液，转速为120r/min，温度为37°C。
[0043] ②0.03%亚甲蓝+紫外照射(4h)
[0044] 1)配置含有100u/ml肝素、0.03%亚甲蓝的去离子水；
[0045] 2)向配置的溶液中通氧，并加入双氧水溶液使其浓度为0.125% ;
[0046] 3)将脱细胞血管放入装有配置溶液的透明EP管内，并用注射器向脱细胞血管管腔 灌注溶液，然后置于中波长的紫外光下照射4小时；
[0047] 4)待脱细胞血管经过紫外交联完后，将其放入PBS溶液的EP管内，并置于摇床上处 理2小时，每隔半小时换液，转速为120r/min，温度为37°C。
[0048] ③0.005%亚甲蓝+紫外照射Ih
[0049] 1)配置含有100u/ml肝素、0.005%亚甲蓝的去离子水；
[0050] 2)向配置的溶液中通氧，并加入双氧水溶液使其浓度为0.125% ;
[0051] 3)将经过预处理的脱细胞血管放入装有配置溶液的透明EP管内，并用注射器向脱 细胞血管管腔灌注溶液，然后置于中波长的紫外光下照射1小时；
[0052] 4)待脱细胞血管经过紫外交联完后，将其放入PBS溶液的EP管内，并置于摇床上处 理2小时，每隔半小时换液，转速为120r/min，温度为37°C。
[0053] 效果例1:张开角测定
[0054] 分组:正常血管组，脱细胞血管组，交联剂对照组，本发明组1-3,每组各用3根血管 进行测定，遴选每根血管在点0 %、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %的张开角，并求得在各个点 的平均值，通过各点的平均值可求得每根血管的平均值，然后再将每根血管的平均值再求 平均值以求得正常血管组，脱细胞血管组，交联血管组的张开角平均值。
[0055]张开角的测量方式如下：
[0056]①取出新鲜的大鼠左颈总动脉血管(或脱细胞血管，交联血管），浸泡在PBS缓冲液 中；
[0057]②在显微镜下进行观察，拍摄照片；
[0058]③用手术刀将血管沿轴向切成圆环，血管环宽度Imm;
[0059]④在显微镜下对每个环的横向（血管管腔朝向水平)和竖向（血管管腔朝上)进行 观察，拍照；
[0060]⑤将血管环剪开，静止一段时间（约1分钟），观察并拍摄图片；
[0061]⑥用image tools处理所拍摄的图片，测量张开角，并进行分析。
[0062] 测定结果如图1-3 [0063]测走结果表明：
[0064] 1)脱细胞血管的张开角均值小于正常血管的张开角均值，且具有显著性差异，表 明经过消化处理的血管管壁残余应力减小。
[0065] 2)经过戊二醛交联的脱细胞血管张开角没有增大反而大幅度减小且具有极显著 性差异，表明经戊二醛交联后的血管壁残余应力减小了。
[0066] 3)本发明组1-3通过亚甲蓝处理+紫外照射后的脱细胞血管相对于亚甲蓝处理前 的脱细胞血管，残余应力均有恢复。通过〇.01%亚甲蓝+紫外照射两小时的交联方式对脱细 胞血管的残余应力恢复最明显。通过SPSS作T检验发现，0.005 %亚甲蓝+紫外照射Ih交联方 法与0.01%亚甲蓝+紫外照射2h的每组张开角均值具有显著性差异;0.03%亚甲蓝+紫外照 4h相比0.01%亚甲蓝+紫外照射2h的张开角均值略小，但不具有显著性差异。
[0067]效果例2
[0068]残余应变测定:反映血管内外壁力学情况
[0069] 分组:正常血管组，脱细胞血管组，交联剂对照组，本发明组1，每组各用3根血管进 行测定，遴选每根血管在点0 %、20 %、40 %、60 %、80%、100 %的应变值并求得在各个点的 平均值，通过各点的平均值可求得每根血管的平均值，然后再将每根血管的平均值再求平 均值以求的正常血管组，脱细胞血管组，交联血管组的内外壁残余应变平均值。
[0070] 本发明在计算血管的残余应变时为了使结果更接近血管的实际情况采用image too 1 实
[0071] 测血管内外壁周长。
[0072]具体操作步骤如下：
[0073] 1)取出新鲜的大鼠左颈总动脉血管(或脱细胞血管、交联血管），浸泡在PBS缓冲液 中；
[0074] 2)在显微镜下进行观察，拍摄照片；
[0075] 3)用手术刀将血管沿轴向切成圆环，血管环宽度Imm;
[0076] 4)在显微镜下对每个环的横向（血管管腔朝向水平)和竖向（血管管腔朝上)进行 观察，拍照；
[0077]
[0078] 5)将血管环剪开，静止一段时间（约1分钟），观察并拍摄图片；
[0079] 6)用image tools处理所拍摄的图片，测量整根血管长度、血管环横向长度、血管 环剪开前内外壁周长、血管环剪开后内外壁周长，然后根据格西-格林的应变张量公式求得 残余应变，公式为
表示剪开前血管环的 内壁周长，LunItia/5表示剪开前血管环的外壁周长，LQ- stres，表示剪开后血管环的内壁周长， Lo-stresse0表示剪开后血管环的外壁周长。
[0080] 测定结果如图4
[0081] 实验结果表明：
[0082] 通过比对3组正常血管、3组脱细胞血管和3组交联血管内外壁残余应变均值，并作 相应的T检验，可以得出结论：
[0083] 1)正常血管的外壁残余应变均值的绝对值大于内壁残余应变均值的绝对值，且存 在极显著性差异;脱细胞血管的内壁残余应变均值的绝对值与外壁残余应变均值的绝对值 不存在显著性差异。
[0084] 2)正常血管内壁残余应变均值与脱细胞血管的内壁残余应变均值不存在显著性 差异;正常血管的外壁残余应变均值大于脱细胞血管的外壁残余应变均值且存在极显著性 差异。
[0085] 3)在对脱细胞血管与交联血管的残余应变均值比较中发现，脱细胞血管与交联血 管内壁残余应变变化不大，不存在显著性差异，而交联血管外壁残余应变均值比脱细胞血 管的外壁残余应变均值大，存在显著性差异。
[0086] 效果例3:交联血管的血液相容性实验
[0087] 选取本发明组1交联血管3组，阴性对照3组，阳性对照3组，通过分光光度计测得数 值如下：
[0088] 表1脱细胞血管血液相容性相关数值
[0090]根据红细胞溶血率(Erythrocyte hemolysis rate，EHR)计算公式： rnno11 实验组OD均值-阴性对照组Ο?均值 阳性照组OD均值-阴性对照组OD均值
[0092] 可得经交联后的脱细胞红细胞溶血率为2.8%。因此可以判定经交联后的脱细胞 血管不具有
[0093] 溶血作用。
[0094] 效果例4:交联血管的细胞毒性实验
[0095] 细胞相对增殖率（（Relative growth rate ,RGR)计算公式如下： Γηη〇Λ? 实-验组OD 均值 1ΑΛα/
[0096] RGR = ---- X100% 对照组OD均值
[0097] 其中毒性反应0-1级为合格医用材料。
[0098] 表2细胞毒性实验的反应分级标准
[0102] 细胞毒性实验表明该交联血管符合医用材料的要求。
[0103] 任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行 修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与 技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)配 制包含体积百分数为0.01-0.03 %亚甲蓝的水溶液;2)将脱细胞血管放入装有上述水溶液 的透明容器中，置于紫外光照射2-4小时;3)清洗脱细胞血管去除残留物。2. 如权利要求1所述恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法，其特征在于，包括如 下步骤：1)配制含有50-20011/ 1111肝素，体积百分数为0.01-0.03%亚甲蓝和体积百分数为 0.125%的双氧水的水溶液;2)将脱细胞血管放入装有上述水溶液的透明容器中，置于紫外 光照射2-4小时;3)清洗脱细胞血管去除残留物。3. 如权利要求1或2所述恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的方法，其特征在于，步 骤1)还包括向水溶液中通入氧气。4. 一种用于恢复脱细胞血管恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的试剂，其特征在 于，包括体积百分数为〇. 〇 1 -〇. 03 %亚甲蓝水溶液。5. 如权利要求4所述试剂，其特征在于，所述水溶液中还包括抗凝剂和/或杀菌剂。6. 如权利要求5所述试剂，其特征在于，所述抗凝剂包括但不限于肝素，EDTA，草酸钠或 枸橼酸盐中的一种或几种。7. 如权利要求5所述试剂，其特征在于，所述抗凝剂为50-200u/ml肝素。8. 如权利要求5所述试剂，其特征在于，所述杀菌剂为双氧水。9. 如权利要求8所述试剂，其特征在于，所述双氧水的体积百分数为0.125 %。10. 如权利要求4至9中任意一项所述试剂用于恢复脱细胞血管残余应力和残余应变的 用途。
【文档编号】A61L27/36GK105963784SQ201610291908
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】叶志义, 王贵学, 骆青松, 潘君
【申请人】重庆大学