一种补骨脂查尔酮及其类似物的用图

一种补骨脂查尔酮及其类似物的用图
【专利摘要】本发明公开了一种补骨脂查尔酮及其类似物的用途，所述用途是指以补骨脂查尔酮或/和其类似物作为活性成分用于制备激活维甲酸相关孤核受体-α的组合物。本发明的研究结果显示：补骨脂查尔酮及其类似物可直接激活RORα的活性，并呈现剂量依赖性，并浓度依赖性地激活RORα蛋白和RORαmRNA表达及能够有效的调控其下游生物钟基因BMAL1的表达；说明补骨脂查尔酮及其类似物是一个很好的RORα正向激活剂，可用于预防或治疗由RORα介导的相关疾病，具有广泛应用前景。
【专利说明】
一种补骨脂查尔酮及其类似物的用途
技术领域
[0001] 本发明是涉及一种补骨脂查尔酮及其类似物的用途，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 孤核受体（Orphan nuclear receptor)是一大类目前没有发现和确定天然配体的 核受体。维甲酸相关孤核受体-α (Retinoic acid-related orphan receptora，RORa) 广泛分布于机体的各个组织，是一种属于类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子，它 能够直接进入细胞核调节靶基因的转录，从而参与多种重要生理过程的调节，在形态发育、 细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥 重要作用。
[0003] 研究发现，RORa与多种疾病相关，可作为药物治疗的靶点。例如：
[0004] 1)与心血管疾病的相关性，研究指出：RORa的rsl〇519096和其下游信号BMALl 的rs3816358的单核苷酸多态性（SNPs)与372例的年轻患者的非杓型表型高血压显著相 关（Hypertens Res. 2014 Nov 20.);褪黑素作为体内的RORa激活剂能够降低男性原发 性高血压病人的夜间血压（J Biol Chem. 1994;269:28531-28534 !Hypertension. 2004; 43:192-197) ;R0Ra基因突变小鼠患有严重的动脉粥样硬化症（Circulation. 1998; 98:2738-2743.) ;R0Ra受体调控具有抑制动脉粥样作用的高密度脂蛋白（HDL)的成分蛋 白 ApoAI 和 V 的表达上升（J Biol Chem. 1997 ;272:22401-22404 ;Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005 ；25:1186-1192.)〇
[0005] 2)与代谢性疾病的相关性，研究表明：胰腺和胰岛内ROR家族基因呈现昼夜循 环差异性地表达（Mol Cell Endocrinol.2013;365:129-138.)，其胰岛素分泌是被RORa 调控的（FEBS Lett. 2014 ;Mar 18 ;588(6) :1071-1079.) ;R0Ra 也改变肝细胞的葡萄糖 利用率 Ofepatology. 2014 ;0ct 25. doi: 10. 1002/h印· 27577.) ;R0Ra 是一个调节肥胖和 能量平衡的核受体（FEBS Lett. 2009;583:2031-2036.);选择性激活RORa可能在肥胖 和动脉粥样硬化的治疗中有效（Lau P，Nixon SJ，Parton RG，et al.J Biol Chem.2004; 279:36828-36840.);维甲酸相关孤核受体α基因导入促进CYP8B1的昼夜节律和空腹 时的表达、增加肝脏胆固醇量、增加血清和胆汁酸池的12a-羟基胆汁酸水平（J Biol Chem. 2013 ;288:37154-65. ) ;7 a -羟基固醇（7 a -OHC)是胆汁酸代谢的关键中间体， 7 a -OHC可以刺激ROR a靶基因的表达，如葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表 达（J Biol Chem. 2010 ;285:5013-5025.)。
[0006] 3)与小脑萎缩症和神经退行性疾病的相关性，研究表明：脊髓小脑性共济失调 是成年发病的多聚谷氨酰胺神经退行性疾病。在成人脊髓小脑性共济失调小鼠中，RORa 介导的浦肯野细胞的发展决定了疾病的严重程度，RORa的部分损失增强共济失调蛋白 I(ATXNl)突变的致病性（Cell. 2006;127:697-708.) ;R0Ra控制浦肯野细胞树突状分化 的早期步骤（JNeurosci. 2006 ;26:1531-1538.) ;R0Ra过表达可以防止氧化应激诱导的 神经元的细胞凋亡（JNeurochem. 2006;96:1778-1789.);在缺氧状态下，RORa也具有神 经元和星形胶质细胞的神经保护功能（J Neurosci. 2011 ;31:14314-14323.)，这种改善神 经退行性病变的保护作用是通过RORa诱导S0D2和GPxl表达实现的（Antioxid Redox Signal. 2014 ;21:2083-2094.)。
[0007] 4)与骨质疏松症和类风湿关节炎的相关性，研究表明：骨髓来源的间充质干细胞 表达RORa，它能够促进间充质干细胞的成骨分化，直接激活小鼠骨涎蛋白表达近7倍。该 研究还显示，RORa突变staggerer小鼠的胫骨的总骨矿物质含量、密度、区域和长度低于 RORa 杂合子和野生型小鼠 （Proc Natl Acad Sci USA. 2000 ;97:9197-9202.);作为 RORa 激活剂的褪黑素对骨功能的影响可能有三个方面：（I)提高成骨细胞的分化和活性；（II) 增加成骨细胞骨保护素的表达，防止破骨细胞的分化；（III)清除破骨细胞产生的自由基 和骨吸收活性（J Osteoporos. 2010 ;2010:830231.);噻唑烧二酮（Thiazolidine diones) 具有良好的抗风湿性性关节炎的效果，其机制被发现是通过RORa核内信使介导的，并为 风湿性关节炎等治疗提供了一种新的治疗方法（J Biol Chem. 1996 ;271:13515-13522.)。
[0008] 5)与癌症的相关性，研究表明：褪黑素可以经过激活RORa而抑制人乳腺癌的 增长（MolCell Endocrinol. 2001 ;176:111-120.);在人乳腺癌组织和细胞系中，RORa 表达呈下调趋势，SEMA3F的mRNA水平也下降，并且乳腺癌预后较差，重新恢复RORa 表达伴随增强SEMA3F的表达，可以抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的肿瘤生长（Cancer Res. 2012;72:1728-1739.) ;R0Ra的激活剂噻唑烷二酮衍生物CGP52608的药物处理， 在mRNA和蛋白水平上显著降低5-脂肪氧合酶的表达，CGP52608药物处理也可以完全抑 制由亚油酸和花生四稀酸诱导的前列腺癌DU145细胞的增殖作用（Int J Cancer. 2004; 112:87-93.) ;R0Ra 通过PKCa 通路减弱结肠癌的Wnt/0-catenin信号（Mol Cell. 2010; 37:183-195.) ;R0Ra激活剂褪黑素还增强过氧化氢诱导的人早幼粒细胞性白血病HL-60 细胞的凋亡（Mol Cell Biochem. 2011 ;353:167-176.);在肝癌细胞内，SPARC，PLG，G6PC， NR1D2和AGRP基因是能够被RORa调控的（PLoS 0ne.2011;6:e22545.) ;R0Ra表达下调 与肝癌患者预后较差有关，其表达量是显著与血清甲胎蛋白、病理分级、肿瘤复发率和血管 浸润密切相关（Tumour Biol. 2014 ;35:7603-7610.) 〇
[0009] 6)与炎症性疾病的相关性，研究表明：RORa能够抑制羟基类固醇磺基转移 酶（SULT2A1)的表达，也能够增强AMPK活性，改善脂肪肝、脂肪性肝炎和肝纤维化（Mol Endocrinol. 2013 ;27:106-115 ;!fepatology· 2012 ;55:1379-1388.) ;R0Ra 还能够通过诱 导S0D2和GPxl的表达降低氧化应激，防止非酒精性脂肪性肝炎的发生发展（Antioxid Redox Signal. 2014 ;21:2083-9204.) ;R0Ra基因突变SG/SG小鼠比野生型小鼠表现出对 LPS诱导的炎症程度有更高的反应性，SG/SG小鼠肺部的炎性细胞数量、IL-I β、IL-6和 巨噬细胞炎性蛋白-2 (ΜΙΡ-2)分泌量也高出野生型小鼠，这种炎症的高反应性与NF κ B活 性调控无关（Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 ;289:L144-L152.) ;R0Ral 和 ROR a 4的过表达能够抑制TNF- a刺激的P50和p65的向核内移位，进而抑制血管内皮细胞 的血管细胞粘附分子-I (VCAM-I)和细胞内粘附分子-I (ICAM-I)表达（FEBS Lett. 2004 ; 557:269-274 J.Arterioscler Thromb Vase Biol.2005;25:710-716·);高浓度的 RORa 激活剂的褪黑素可以抑制NF-κ B表达和与DNA的结合能力，这种作用可能经由ERK/AKT/ PKC通路，并由此降低血管内皮细胞的增殖（JPineal Res. 2008 ;44:107-114.)。
[0010] 综上所述可见：R〇Ra与心血管疾病（如：动脉粥样硬化、高血压），代谢性疾病 (如：糖尿病、肥胖、糖代谢异常、高血脂症），神经性疾病（如：小脑萎缩症、神经退行性疾 病），骨骼性疾病（如：骨质疏松症、类风湿关节炎），癌症疾病（如：乳腺癌、肝癌、前列腺 癌、结肠直肠癌），炎症相关疾病（如：慢性阻塞性肺疾病、非酒精性脂肪肝炎）等多种疾 病相关，RORa激活剂可以在很广泛的范围中得以应用，因此，本领域迫切需要开发有效的 RORa激活剂。
[0011] 补骨脂查尔酮（Bavachalcone)是属蔷薇目豆科补骨脂（又名：破故纸、婆固 月旨、胡韭子）的主要活性成分。2005年由Ming Hong Lee等人首次从补骨脂（Psoralea corylifolia)中分离出来，并命名为Bavachalcone，其CAS号为：28448_85_3,分子式为： 0???，分子量为：324. 4,化学结构式为
现有研究仅表明补 骨脂查尔酮及其类似物对多种常见植物病害具有很好的抑菌活性，至今未见补骨脂查尔酮 及其类似物的其它用途报道。

【发明内容】

[0012] 本发明的目的是提供一种补骨脂查尔酮及其类似物的用途，以拓宽补骨脂查尔酮 及其类似物的应用范围。
[0013] 本发明所述的补骨脂查尔酮及其类似物的用途，是指以补骨脂查尔酮或/和其 类似物作为活性成分用于制备激活维甲酸相关孤核受体-a (Retinoic acid-related orphan receptor α，RORa )的组合物。
[0014] 进一步说，本发明所述的补骨脂查尔酮及其类似物的用途，是指以补骨脂查尔酮 或/和其类似物作为活性成分用于制备维甲酸相关孤核受体-a (Retinoic acid-related orphan receptor α，RORa )的激活剂。
[0015] 进一步说，本发明所述的补骨脂查尔酮及其类似物的用途，是指以补骨脂查尔酮 或/和其类似物作为活性成分用于制备预防或治疗由维甲酸相关孤核受体-a (Retinoic acid-related orphan receptor a，R〇Ra)介导的相关疾病的组合物。
[0016] 上述组合物为药物组合物、保健品组合物或食品组合物。
[0017] 所述的相关疾病为心脑血管疾病、代谢性疾病、神经性疾病、骨骼性疾病、癌症疾 病或炎症疾病中的至少一种。
[0018] 所述的心脑血管疾病为高血压、动脉粥样硬化中的至少一种；所述的代谢性疾病 为糖尿病、糖代谢异常、肥胖、高血脂症、胆汁代谢异常中的至少一种；所述的神经性疾病为 小脑萎缩症、神经退行性疾病中的至少一种；所述的骨骼性疾病为骨质疏松症、类风湿关节 炎中的至少一种；所述的癌症疾病为乳腺癌、肝癌、结肠直肠癌、前列腺癌、早幼粒白血病中 的至少一种；所述的炎症疾病为无菌性炎症、慢性阻塞性肺病、非酒精性脂肪肝炎、肺炎中 的至少一种。
[0019] 所述的补骨脂查尔酮及其类似物为具有式I结构的化合物或所述化合物的药学 上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体化合物：
[0020]
[0021] 其中：&、R2、R3、R4、R5、R 6、R7、Rs、R9各自独立地选自氢、ORa、OCOORa、OCONRaRb、 0S02Ra、OSO3Ra中的任一种；所述的Ra和Rb各自独立地选自氢、取代或未取代的Cl~C12 烷基、取代或未取代的C2~C12烯基、取代或未取代的C2~C12炔基、取代或未取代的 C6~C30芳基、取代或未取代的Cl~C30杂芳基中的任一种。
[0022] 作为优选方案，其中的R1选自氢、羟基或烷氧基，R3选自羟基或烷氧基，R 4、Rs、R9 各自独立选自氢或羟基，R2、R5、R6各自独立选自氢，R7选自羟基。
[0023] 作为进一步优选方案，所述的补骨脂查尔酮及其类似物为具有如下结构式的化合 物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体化合物：
[0024]
[0025] 本发明所述组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达 体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射 剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。
[0026] 本发明所述活性成分的有效施用剂量可随所用的组合物、给药的模式和待治疗的 疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的活性化合物每天以约〇. 5_20mg/kg体重的 剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式 给药。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态载体密切混合的活性化合物。可调节此 剂量方案以提供最佳治疗，例如：由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量， 或将剂量按比例地减少。
[0027] 另外，本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，还可通过多种本领 域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的类似物，比如化学合成或从植物中提取 等。
[0028] 本发明中所述术语的定义如下：
[0029] 术语"Bavachalcone"与"补骨脂查尔酮"可互换使用，其英文同义词还有 "RoussochalconeB"、"Broussochalcone B"，均指化合物：
[0030] (E)-I-[2, 4-Dihydroxy-5-(3-methyl-2-butenyl)phenyl]-3-(4-hydroxyphenyl )-2-propen_l-〇ne
[0031] 【（E) -I- [2, 4-二羟基-5- (3-甲基-2- 丁烯基）苯基]-3- (4-羟基苯基）-2-丙 烯-1-酮】。
[0032] 术语"C1-C12烷基"是指具有1-12个碳原子的直链或支链烷基或环烷基，例如：甲 基、亚甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环 己基、环庚基，或类似基团。
[0033] 术语"C2-C12烯基"是指具有2-6个碳原子的、具有一个或多个双键的直链或支链 的烯基或环烯基，例如：乙烯基、稀丙基、卜丙烯基、异丙烯基、卜丁烯基、2- 丁烯基、环己稀 基、环庚烯基、1，3-环己二烯基、1，4-环己二烯基、或类似基团。
[0034] 术语"C2-C12炔基"是指具有2-12个碳原子的、具有一个或多个三键的直链或支 链的炔基，例如：乙炔基、丙炔基、或类似基团。
[0035] 术语"C6~C30芳基"是指具有6~30个碳原子的芳基，包括单环或二环芳基，例 如：苯基、萘基、或类似基团。
[0036] 术语"C1~C30杂芳基"是指具有1~30个碳原子的杂芳基，例如：吡咯基、吡啶 基、呋喃基、或类似基团。
[0037] 术语"取代"是指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：Cl~ClO 烷基、C3~ClO环烷基、Cl~ClO烷氧基、卤素、羟基、羧基（-C00H)、Cl~ClO醛基、C2~ ClO酰基、C2~ClO酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基 的取代苯基，所述的取代基选自卤素、Cl-ClO烷基、氰基、0H、硝基、C3~ClO环烷基、Cl~ ClO烷氧基或氨基。
[0038] 术语"药学上可接受的盐"是指所述化合物与药学上可接受的无机酸或有机酸所 形成的盐，所述的无机酸包括：盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有机酸包括：甲酸、 乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸（1，5)、亚细亚酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、 二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、 葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸。
[0039] 术语"互变异构体"是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团 异构体，例如：烯醇与相应的酮。
[0040] 术语"立体异构体"是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，例 如：顺反异构体、对映异构体、构象异构体等。
[0041] 术语"前体化合物"是指在体外无活性，但能够在生物体内进行代谢或化学反应转 化为本发明的活性成分，从而发挥其药理作用的化合物。
[0042] 术语"组合物"是指在组合物中，除了含有主要活性成分之外，还可含有少量的且 不影响有效成分的次要成分和/或药学上可接受的载体。例如，可以含有甜味剂以改善口 味、抗氧化剂以防止氧化，以及各种制剂所必要的辅料。
[0043] 术语"药学上可接受的"是指适用于人而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态 反应），即有合理的效益/风险比的物质。
[0044] 本发明的研究结果显示：补骨脂查尔酮及其类似物可直接激活RORa的活性，并 呈现剂量依赖性，并浓度依赖性地激活ROR α蛋白和ROR a mRNA表达及能够有效的调控其 下游生物钟基因 BMALl的表达；说明补骨脂查尔酮及其类似物是一个很好的RORa正向激 活剂，可用于预防或治疗由RORa介导的相关疾病，具有广泛应用前景。
【附图说明】
[0045] 图1显示了不同浓度的补骨脂查尔酮对RORa报告基因的激活；
[0046] 图2显示了补骨脂查尔酮对RORa蛋白表达量的影响；
[0047] 图3显示了补骨脂查尔酮对RORa mRNA表达量的影响；
[0048] 图4显示补骨脂查尔酮对生物钟基因 BMALl mRNA表达量的影响；
[0049] 图5显示了异补骨脂查尔酮对RORa mRNA表达量的影响。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0051] 实施例
[0052] 1.实验材料和设备
[0053] I. 1实验试剂
[0054] 细胞株：HUVEC细胞株购自美国ATCC公司（HUVEC，CRL-1730)。
[0055] 抗体：HRP-conjugated Monoclonal Mouse Anti-glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogease (GAPDH，KC-5G5)购自上海康成生物有限公司； Anti-ROR a antibody (ab60134)购自 abeam 公司。
[0056] 试剂盒：the Promega Luciferase Assay System(Promega，USA) ;High_Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 贝勾自 Applied Biosystems 公司。
[0057] 试剂：Trizol Reagent 购自美国 Invitrogen 公司；15596-026 购自 Applied Biosystems公司；RIPA裂解液（弱，P0013D)、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型，P0010)、 Triton X-100/曲拉通X-100(ST795)、苯甲基磺酰氟PMSF(100mM，ST506)均购自碧云天生 物技术研究所；十二烷基磺酸钠 （sodium dodecyl sulfate，SDS)、β-疏基乙醇、甘氨酸 (Glycine)、Tris碱、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺（ammonium persulfate，APS)、 四甲基乙二胺（tetramethylenediamine，TEMED)、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin， BSA)、Tween-20 均购自 Sigma 公司；ECL Tmmobi I on Western Chemiluminescent HRP Substrate (WBKLS0500)购自Millipore公司；蛋白质转印膜（硝酸纤维素膜，NC膜）购自 美国 Pall 公司；HD Transfection Reagent (E231A)购自美国 Promega ;细胞培养基 DMEM 高糖、DMEM低糖、RPMI1640, FCS，0. 25%胰蛋白酶均购自美国GIBCO ;氨苄青霉素（A6140)、 DMSO 购自 Sigma ;EDTA 购自上海生物工程；Tryptone (LP0042)购自 0X0ID。
[0058] 1. 2实验仪器
[0059] CO2细胞培养箱（HEPA CLASS 100,美国Thermo公司），生物安全柜（Delta serAes，美国Labconco)，细胞培养皿、96孔细胞培养板（美国CornAng公司），全波长扫描 式多功能读数仪（VarAoskan Flash，Thermo scAentAfAc，美国），GSP_9050MBE 隔水式恒温 培养箱、BJ-I⑶细菌超净台（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），PureYAeldTM PlasmAd MAdAprep System(美国 Promega A2492)，倒置相差显微镜（AX71，日本 Olympus)，PCR 扩 增仪（thermocycler，德国BAometra公司），蛋白质电泳及转印系统（美国BAORAD公司）， QL-901Vortex、LX-IOO手掌型离心机、LX-200迷你离心机、TS-I型脱色摇床、TS-8转移脱 色摇床、TS_8 Transference DecolorAng Shaker均为江苏海门市其林贝尔仪器制造有限 公司生产，塑料薄膜封口机（FS-200型，温州正雄机械有限公司），JY92-2D超声波细胞粉碎 机（宁波新芝生物科技股份有限公司），2600C自动X线胶片洗片机，Ancubator shaker恒 温摇床（ZHWY-211B、ZHWY-100B，上海智诚）。
[0060] 2.实验方法
[0061] 2.1细胞培养
[0062] HUVEC用含有10% FCS的DMEM (低糖）培养基培养于IOcm培养皿中，于饱和湿度 的含5% CO2细胞培养箱37°C恒温培养，生长至80 %~90 %融合时进行传代，PBS洗2遍， 0. 25 %胰酶（含0. 02% EDTA)消化约4min，加入含血清的DMEM培养基终止消化，收集细胞， 室温800 rpm/min，3min离心，弃上清，加入含有10% FCS的培养基，1 :3传代培养。取4-8 代细胞用于实验。
[0063] 2. 2报告基因
[0064] 细胞接种的前一天，铺24孔板，待细胞长到80%时进行转染。在对24孔板进行 转染当天，稀释2 μ g的DNA到50 μ L的无血清培养基中，然后取2 μ L FuGENE HD转染试 剂（Promega公司，美国）添加到50 μ L的无血清培养基中DNA与转染试剂混合孵育15分 钟后，添加到各孔中。转染4-6小时之后，吸掉旧培养基，加入新鲜培养基，一小时后，加入 补骨脂查尔酮或其类似物，使其终浓度为2. 5 μ Μ、5 μ Μ、10 μ M和20 μ Μ。16小时之后，吸掉 旧培养基，用PBS洗两遍，加70 μ L的裂解液裂解细胞，放于摇床摇荡5min，12000rpm，4°C， 5min离心，加双荧光检测液检测。
[0065] 2. 3蛋白免疫印迹分析
[0066] 2. 3.1总蛋白的提取
[0067] 1)弃去培养基，每皿细胞加3mL 4°C预冷的PBS洗涤细胞，弃去PBS后置于冰上；
[0068] 2)融解RAPA裂解液，使用前加入PMSF，使PMSF的最终浓度为ImM，摇匀至于冰上；
[0069] 3)每IOOmm皿加入200 μ L裂解液，于冰上裂解5分钟；
[0070] 4)用细胞刮刀将细胞刮下，收集到灭菌的I. 5mL的离心管中；
[0071 ] 5)超声波细胞破碎仪超声破碎，直至充分裂解；
[0072] 6) 4°C，12000rpm/mAn 离心 lOmin，取上清。
[0073] 2. 3. 2 BCA法测定蛋白浓度
[0074] 1)配制BCA工作液：根据样品数量，按体积比50 :1的比例将BCA试剂A与B配制 为适量工作液，充分混匀；完全溶解蛋白标准品，用PBS稀释至0. 5mg/mL的浓度；
[0075] 2)将标准品按0，1，2,4,8，12，16,2(^1^加到96孔板的标准品孔中，？83补足到 20 μ L ；
[0076] 3)将蛋白样品适当稀释后加20 μ L样品到96孔板孔中；
[0077] 4)各孔加入200 μ L BCA工作液，于恒温微孔板震荡仪上37 °C反应30min ;
[0078] 5)酶标仪测定562nm吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
[0079] 2. 3. 3制备SDS-PAGE凝胶电泳蛋白样品
[0080] 根据蛋白浓度，用PBS调整上样体积、上样总量一致，用4X的loading buffer按 照4 :1体积加入上样缓冲液，混匀；恒温水浴锅中95°C，5min变性，进行后续SDS-PAGE凝胶 电泳分离或储存于-80 °C冰箱。
[0081] 2. 3. 4 Western Blot
[0082] 1)制胶（SDS-PAGE凝胶）：根据目的蛋白的分子量制备12%的聚丙烯酰胺分离 胶，将配制好的凝胶液体注入玻璃板，无水乙醇200 μ L封胶，待分离胶凝固后配制并注入 4%的浓缩胶，插入I. 5mm厚度的10孔梳子；
[0083] 2)电泳：装好凝胶板，加入I X电泳缓冲液，在凝胶泳道中加入蛋白预染Marker 和各组样品，用BAORAD迷你型蛋白质电泳转印系统分离蛋白，从80V开始电泳，50min后转 为120V继续电泳至染料接近凝胶底部，停止电泳；
[0084] 3)转膜（湿转法）：把NC膜和4张滤纸及4张纤维垫浸泡在存有转移缓冲液（甲醇 20% )的盘中，由下至上按照"2张纤维垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-2层纤维垫" 的顺序，注意排除气泡，置于转膜槽中，一侧加冰，将整个转膜槽埋于冰盆中，恒流400mA，Ih 转膜；
[0085] 4)封闭：将膜浸在含5 %脱脂奶粉或5 % BSA的封闭液（用TBS-Tween缓冲液溶 解），室温慢摇Ih;
[0086] 5)蛋白质免疫检测：将膜封闭于含有一抗（稀释比例为I :1000)的杂交袋中，置 于洗脱摇床上，4°C孵育过夜；第二天，用TBS-T缓冲液快速洗膜8minX3次；再将膜封入 HRP偶联的二抗（稀释比例为I :1000)杂交袋中，室温慢摇Ih ;用TBS-T缓冲液快速洗膜 8minX3 次；
[0087] 6)底物化学发光及显影：用纸吸干膜上的水分，平放于保鲜膜上，加 ECL(A:B 1:1 配制）反应2min，用纸吸去多余的ECL，用保鲜膜包好平放于暗盒中，蛋白面向上，暗室内将 转印膜对感光胶片曝光，自动洗片机洗片；
[0088] 7)结果与分析：将胶片扫描，用凝胶分析软件Quantity One计算各条带光密度 值，进行统计分析。
[0089] 2. 4 RNA提取及荧光定量PCR
[0090] 1)吸掉细胞废液，PBS洗两遍，60mm皿加 ImL trizol，室温放置5min ;
[0091] 2)每ImL Trizol中加0· 2mL氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其 充分混匀，室温静置5分钟；4°C，12000rmp离心15分钟；
[0092] 3)将上层水相转入新的I. 5mL EP管中（约400-500 μ L)，加入0· 5mL异丙醇，混 匀后室温放置IOmin ;4°C，12000rmp离心10分钟；
[0093] 4)小心倒掉上清，留取沉淀；加 ImL现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉 淀一次，4°C、7500rmp离心5分钟；
[0094] 5)倒掉上清，留取沉淀；再加 ImL乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，4°C、 7500rmp离心5分钟；
[0095] 6)小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约10分钟，此时RNA沉淀变 透明）；注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）；再在管中加20 μ L的 DEPC水溶解，在55-60°C下孵育10分钟助溶；
[0096] 7)对RNA测浓度，统一调成0. 5 μ g/ μ L，进行逆转录；将cDNA放于-80°C备用；
[0097] 8)按照说明书进行荧光定量PCR。
[0098] 2. 5生物钟RNA的提取
[0099] 1)前一天细胞铺板，120万/皿；待细胞长到80%后，用0. 3%血清的培养基饥饿 处理细胞16小时；
[0100] 2) 16小时后，用50%血清的培养基处理两个小时，之后再换成0. 5%血清培养基 培养，其中一部分细胞加20 μM的补骨脂查尔酮进行相同的处理；
[0101] 3)以饥饿16小时后为零时刻，每隔四个小时收集细胞RNA，共收集48小时；
[0102] 4)收集结束后，统一抽提RNA，逆转录，PCR。
[0103] 2. 6数据处理和统计学分析
[0104] 使用GraphPad PrAsm 5软件或SPSS15. 0软件进行数据处理，数据以均数土标准 差（mean土SD)表示，组间比较采用配对t-检验进行统计学分析，组内比较采用单因素方差 分析法（one-way AN0VA)分析处理，p < 0.05认为有显著性差异，具有统计学意义。
[0105] 3.实验结果
[0106] 图1显示了不同浓度的补骨脂查尔酮对RORa报告基因的激活。由图1可见：转 染RORa报告基因5小时后，加正常培养基1小时孵育后，再用2. 5 μ Μ、5 μ M、10 μ Μ、20 μ M 四个浓度处理ROR α报告基因6小时后，由双荧光报告基因的检测结果说明：补骨脂查尔 酮浓度依赖性地激活细胞内RORa的表达。其中的数据由三个独立实验平均值土标准差； *P〈0. 05,与 CTRL 组比；#P〈0. 01，与 CTRL 组比较。
[0107] 图2显示了补骨脂查尔酮对RORa蛋白表达量的影响，其中的A图显示了 RORa及 GAPDH总水平变化，B图显示了 RORa条带统计结果；由图2可见：脐静脉内皮细胞（HUVEC) 在不同剂量的补骨脂查尔酮处理24小时后，由免疫印迹法的评价结果说明：补骨脂查尔 酮浓度依赖性地激活细胞内RORa活性。其中的数据由三个独立实验平均值土标准差； *P〈0. 05,与 CTRL 组比；#P〈0. 01，与 CTRL 组比较。
[0108] 图3显示了补骨脂查尔酮对RORamRNA表达量的影响，由图3可见：脐静脉内皮细 胞（HUVEC)在不同剂量的补骨脂查尔酮处理24小时后，由荧光定量PCR方法的检测结果说 明：补骨脂查尔酮浓度依赖性地激活细胞内RORa活性。其中的数据由三个独立实验平均 值土标准差；*P〈0. 05,与CTRL组比；#P〈0. 01，与CTRL组比较。
[0109] 图4显示了补骨脂查尔酮对生物钟基因 BMALl mRNA表达量的影响，由图4可见： 脐静脉内皮细胞（HUVEC)先用0. 3%血清处理16小时，然后用50%血清培养基和50%血 清+20 μ M补骨脂查尔酮的培养基处理2小时，最后用0. 5%血清或0. 5%血清+20 μ M补骨 脂查尔酮处理细胞，由每隔4小时收集的RNA结果说明：补骨脂查尔酮能调控生物钟基因 BMALl的表达。
[0110] 图5显示了异补骨脂查尔酮对RORa mRNA表达量的影响，由图5可见：脐静脉内皮 细胞（HUVEC)在20 μ M剂量的异补骨脂查尔酮处理24小时后，由荧光定量PCR方法的检测 结果说明：异补骨脂查尔酮具有激活细胞内RORa活性。其中的数据由三个独立实验平均 值土标准差；*Ρ〈0. 05,与CTRL组比。
[0111] 实施例中所述的缩略语的全称如下表所示：
[0112]
[0114] 综上研究结果可见：补骨脂查尔酮及其类似物可直接激活RORa的活性，并呈现 剂量依赖性，并浓度依赖性地激活ROR α蛋白和ROR a rnRNA表达及能够有效的调控其下游 生物钟基因 BMALl的表达；说明补骨脂查尔酮及其类似物是一个很好的RORa正向激活剂， 可用于预防或治疗由RORa介导的相关疾病，具有广泛应用前景。
[0115] 最后有必要在此说明的是：本领域的技术人员可以在上述实施例基础上，进行补 骨脂查尔酮其它类似物的上述活性论证实验，在此不再一一列举。此外应理解，在阅读了本 发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所做的等价形 式同样落于本申请权利要求书所要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种补骨脂查尔酬及其类似物的用途，其特征在于：W补骨脂查尔酬或/和其类似 物作为活性成分用于制备激活维甲酸相关孤核受体-a (RORa)的组合物。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：W补骨脂查尔酬或/和其类似物作为活 性成分用于制备维甲酸相关孤核受体-a (RORa)的激活剂。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：W补骨脂查尔酬或/和其类似物作为活 性成分用于制备预防或治疗由维甲酸相关孤核受体-a (RORa)介导的相关疾病的组合 物。4. 根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于：所述组合物为药物组合物、保健品组 合物或食品组合物。5. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的相关疾病为屯、脑血管疾病、代谢性 疾病、神经性疾病、骨骼性疾病、癌症疾病或炎症疾病中的至少一种。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的屯、脑血管疾病为高血压、动脉粥 样硬化中的至少一种；所述的代谢性疾病为糖尿病、糖代谢异常、肥胖、高血脂症、胆汁代谢 异常中的至少一种；所述的神经性疾病为小脑萎缩症、神经退行性疾病中的至少一种；所 述的骨骼性疾病为骨质疏松症、类风湿关节炎中的至少一种；所述的癌症疾病为乳腺癌、肝 癌、结肠直肠癌、前列腺癌、早幼粒白血病中的至少一种；所述的炎症疾病为无菌性炎症、慢 性阻塞性肺病、非酒精性脂肪肝炎、肺炎中的至少一种。7. 根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的补骨脂查尔酬及其类似 物为具有式I结构的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体 或前体化合物：其中：Ri、Rz、R3、Rzp Rs、Re、R7、Rs、Rg各自独立地选自氨、OR曰、OCOOR曰、OCONRal^b、OSO 2尺曰、 OSOsRa中的任一种；所述的Ra和化各自独立地选自氨、取代或未取代的Cl~C12烷基、取 代或未取代的C2~C12締基、取代或未取代的C2~C12烘基、取代或未取代的C6~C30 芳基、取代或未取代的Cl~C30杂芳基中的任一种。8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的补骨脂查尔酬及其类似物为具有 式I结构的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体化 合物，其中：Ri选自氨、径基或烷氧基，R 3选自径基或烷氧基，R 4、Rs、Rs各自独立选自氨或径 基，Rz、Rs、Re各自独立选自氨，R 7选自径基。9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的补骨脂查尔酬及其类似物为具有 如下结构式的化合物或所述化合物的药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体或前体物合化
【文档编号】A61P11/00GK105982881SQ201510064923
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】许锦文, 党延启, 凌霜
【申请人】上海中医药大学