水套式培养箱高温灭菌方法
【专利摘要】本发明水套式培养箱高温灭菌方法，包括：第一步，水套内的水经水套出水口、水箱进水口流入水箱；第二步，当水套内无水时，对水套进行加热；第三步，当培养箱箱体内腔的温度上升到设定值时，停止对水套加热，并使培养箱箱体内腔的温度保持在设定值温度，进行高温灭菌；第四步，完成高温灭菌后，培养箱内腔自然冷却至第一设定温度时，打开水泵、水套出水口及水箱进水口，使水在水套与水箱之间循环流动；第五步，箱体内腔温度降至第二设定温度后，使内胆充满纯净水。本发明水套式培养箱高温灭菌方法能实现高温干热空气灭菌或湿热灭菌，可以弥补目前水套式二氧化碳培养箱不能实现高温灭菌的缺陷，大大提高了培养研究实验的成功率。
【专利说明】
水套式培养箱高温灭菌方法
技术领域
[0001] 本发明主要涉及一种灭菌方法，尤其涉及一种水套式培养箱高温灭菌方法。
【背景技术】
[0002] 二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体 内的生长环境，如稳定的温度（37°C )、稳定的CO2水平（5% )、恒定的酸碱度（PH值：7. 2~ 7. 4)、较高的相对饱和湿度（多95% )，来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。广泛应 用于细胞、组织培养和某些特殊微生物的培养，常见于细胞动力学研究、哺乳动物细胞分泌 物的收集、各种物理、化学因素的致癌或毒理效应、抗原的研究和生产、培养杂交瘤细胞生 产抗体、体外受精（IVF)、干细胞、组织工程、药物筛选等研究领域。
[0003] 二氧化碳培养箱加热方式有气套式加热和水套式加热。气套式加热是通过遍布箱 体气套层内的加热器直接对内腔进行加热，又叫六面直接加热。气套式培养箱的内部加热 系统一般由：不锈钢内胆、加热电缆、空气间隔层、保温层组成，由于加热电缆直接对内胆加 热，具有加热升温快，结构简单，可方便地进行高温灭菌处理等优点。
[0004] 水套式加热是通过一个独立的水套层包围内部的腔体来维持温度恒定的，水套式 培养箱的内部加热系统一般由：不锈钢水套内侧构成内胆、注水层、不锈钢水套外层，加热 电缆、保温层组成。
[0005] 水套式培养箱的加热方式是通过加热电缆对水套外壁进行加热，加热水套内水， 然后水温通过内壁不锈钢间接加热培养箱内胆腔内空间，具有加热均匀，内胆温度腔偏差 小，温度稳定性高的优点，由于水的热容量很大，因此，断电后相比气套式培养箱，温度下降 得更慢，有利于生物样品的保存。由于水套式培养箱具有温度均匀性好，温度稳定，断电后 更长的保温时间，因此，深受用户青睐，但是，由于水套注水量很大，一般约有50升水，因此 至今无法进行高温消毒灭菌，一般水套式培养箱在工作中都通过内部HEPA过滤器进行空 气循环过滤内部空气以防止不利于细胞/组织培养的污染源生长（污染源：见下所述）。行 业内对两种不同加热方式的二氧化碳培养箱又称之为气套式二氧化碳培养箱和水套式二 氧化碳培养箱。
[0006] 二氧化碳培养箱是对细胞/组织进行体外培养的一种装置。在生物活体内，生物 体有自身的免疫系统保护细胞/组织，但是在体外培养时，没有任何保护自己的免疫屏障。 对于二氧化碳培养箱的基本参数：温度、二氧化碳浓度和湿度，大多数培养箱都能满足研究 实验的需要。然而，对于细胞来说，非常理想的培养环境同样也适合所述污染源的生存。二 氧化碳培养箱中的主要污染源：细菌、真菌（霉菌和酵母菌）、病毒、支原体、非同种细胞。经 研究实验表明，以上污染源一旦生长，细胞/组织培养最后基本只能放弃，实验无法挽救， 对于许多取样困难的实验研究来说损失无法估量。因此，培养箱内腔空间洁净度要求显得 非常关键。
[0007] 目前，为保证二氧化碳培养箱内腔洁净度要求，二氧化碳培养箱的灭菌、消毒技术 主要有干热、湿热、紫外灯照射、消毒剂擦拭等。高温干热空气灭菌（温度大于100°c )和 湿热（温度90°C~97°C，湿度大于95% )灭菌是现今世界公认的最有效的两种灭菌技术。 目前市场上流行的气套式二氧化碳培养箱已经普遍采用干热和湿热灭菌技术；水套式二氧 化碳培养箱消毒普遍采用的是紫外灯照射和消毒剂擦拭或HEPA过滤洁净，而没有能实现 干热或湿热灭菌的水套式二氧化碳培养箱。紫外灯照射法的有效性受很多因素，如遮挡、时 间、强度、照射距离，湿度等影响，消毒效果很难保证；消毒剂擦拭法对培养箱腔体内部设计 的死角、各种器件因无法擦拭等因素导致消毒效果也很有限；而HEPA过滤无法清除生长的 微生物并可能产生二次污染。
[0008] 因此，对于水套式二氧化碳培养箱，若能实现干热和湿热灭菌，为保证水套式二氧 化碳培养箱工作空间达到实验所需的清洁度及无菌环境要求来说将是突破性的技术进步。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种能实现水套式二氧化碳培养箱高温灭菌的水套式培 养箱高温灭菌方法。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明水套式培养箱高温灭菌方法，包括：第一步，水套内 的水经水套出水口、水箱进水口流入水箱；第二步，当水套内无水时，对水套进行加热；第 三步，当培养箱箱体内腔的温度上升到设定值时，停止对水套加热，并使培养箱箱体内腔的 温度保持在设定值温度，进行高温灭菌；第四步，完成高温灭菌后，培养箱内腔自然冷却至 第一设定温度时，打开水栗、水套出水口及水箱进水口，使水在水套与水箱之间循环流动； 第五步，箱体内腔温度降至第二设定温度后，使内胆充满纯净水。
[0011] 所述第三步中，设定值温度为湿热灭菌90°C~97°C，干热灭菌120°C~140°C。
[0012] 所述第三步中，保持在设定值温度的时间为2小时~9小时。
[0013] 所述第四步中，第一设定温度为50°C~70°C。
[0014] 所述第五步中，第二设定温度为37°C。
[0015] 本发明水套式培养箱高温灭菌方法能实现高温干热空气灭菌（温度大于100°C ) 或湿热（温度90°C~97°C，湿度大于95%)灭菌，可以弥补目前水套式二氧化碳培养箱不 能实现高温灭菌的缺陷，大大提高了培养研究实验的成功率。
【附图说明】
[0016] 图1为水套式培养箱结构示意图；
[0017] 图2为水套式培养箱第一次加水示意图；
[0018] 图3为水套式培养箱正常工作示意图；
[0019] 图4为本发明水套式培养箱高温灭菌方法高温灭菌模式示意图；
[0020] 图5为水套式培养箱水循环系统不意图；
[0021] 图6为本发明水套式培养箱高温灭菌方法实施例培养箱内腔中心点90°C升温温 度变化曲线图；
[0022] 图7为本发明水套式培养箱高温灭菌方法实施例培养箱内腔中心点升温、降温温 度变化曲线图；
[0023] 图8为传统气套式培养箱90°C高温湿热灭菌的温度变化曲线图；
[0024] 图9为本发明水套式培养箱高温灭菌方法90°C高温湿热灭菌的温度变化曲线图。
[0025] 本发明水套式培养箱高温灭菌方法附图中附图标记说明：
[0026] 1-箱体 2-水套 3-水套出水口
[0027] 4-水套进水口 5-水箱 6-水箱进水口
[0028] 7-水箱出水口 8-第一循环通道 9-外部进水口
[0029] 10-加热单元 11-第二循环通道 12-水栗
[0030] 13-排水口 14-单向常闭型电磁阀15-水套排气通道
[0031] 16-安全阀 17-水箱排气通道 18-高水位传感器
[0032] 19-低水位传感器 20-温度传感器 21-液位传感器
[0033] 22-保温层
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图对本发明水套式培养箱高温灭菌方法作进一步详细说明。
[0035] 由于一些技术原因，本领域无人关注并深入研究解决，市场上也从未出现过带高 温灭菌功能的水套式培养箱。这是由于一般水套培养箱内有约50升水，热容量特别大，升 温特别慢，通常情况下，即使从室温15°C加热到常用工作温度37. (TC需要一天时间；如要 加热到最低灭菌温度90°C，则需要很大功率和很漫长的时间，即使加热到90°C，由于水套 培养箱保温性能好，降温将更漫长（可能长达几天），缺乏实用性。
[0036] 同时，由于灭菌温度很高，接近水的沸点，在水套内的大量水一旦沸腾将产生高压 蒸汽，造成危险。很多观点认为，将水套内水抽干，可以加热内胆腔体，但是由于水套内的水 变为空气，空气是温度的不良导体，将大大影响加热升温速度，可能长时间无法加热至最低 灭菌温度90°C，导致该方法缺乏实用性。对此，本发明人在发明的初期也存在非常大的疑 惑，担心无法快速加热至灭菌温度而使本方法对用户无实用意义。
[0037] 最后，对于水套内抽出的约50升水的放置问题也会导致培养箱的体积臃肿而缺 乏实用性，或因为体积过大，占地面积过大而不受用户欢迎。
[0038] 经过本发明的实验，以上问题都获得了解决，并且某些性能更好。
[0039] 图8为传统90°C高温湿热灭菌气套式培养箱的温度变化曲线；升温阶段：约2小 时；90°C灭菌阶段：保持9小时；降温恢复阶段：约14小时。
[0040] 图9为采用本发明的水套式培养箱90°C高温湿热灭菌的温度变化曲线。
[0041] 由以上2个图可见，对比传统气套式培养箱，本发明水套式培养箱高温灭菌方法 的降温恢复速度大大加快了，约4小时，时间缩短了约10小时，这意味着更快的灭菌周期， 或者相同灭菌周期，可以延长有效灭菌时间。相对传统气套式培养箱灭菌性能大幅度提升。
[0042] 从水套出水口放出水后，水套内仍然残留少量水，一旦加热，温度过高残余水则可 能会沸腾，产生蒸汽，因此，在本发明中，我们增加了专用通气口、安全泄压阀、温度保护装 置，并针对以上所述装置进行了测试，测试结果完全符合安全要求。为防止水套内水管堵 塞，我们增加了双重的水位传感器，确保水套内水完全排除后才开始灭菌升温流程。
[0043] 水套式培养箱，包括：水套2，水套2设置在中空的培养箱箱体1的腔体内，水套2 为一面敞开、五面盛水的隔水夹层。水套2内上部装有高水位传感器18和低水位传感器 19。当水套2内水位高于高水位传感器18的探头时，信号会传至控制装置，控制装置发出 信号停止供水；当水套2内水位低于低水位传感器19的探头时，信号会传至控制装置，控制 装置发出信号经由第二循环通道11从水套进水口 4进行补水。
[0044] 水套2内下部装有液位传感器21，当液位传感器21感知水套2内无水，信号传到 控制装置，控制装置发出指令信号给水套2外侧的加热单元10对水套2进行加热。水套2 内下部装有一个温度传感器20,当水套2内水温升到设定值时，通过控制装置发出指令信 号停止对水套2加热。
[0045] 在水套2底部与水箱5连接的第一循环通道8内设有单向常闭型电磁阀14,设备 正常运行时阀门关闭。水套2内腔需要实施高温灭菌前，向常闭型电磁阀14通过控制装置 发出指令信号打开，从水套出水口 3放出循环水至水箱5。
[0046] 水套2顶部有通气口，其上连接有水套排气通道15,在内腔进行高温灭菌时，若水 套2夹层内有残余水，残余水升温后会释放水蒸汽，水蒸汽通过所述水套排气通道15排出， 保持水套2夹层内空气压力与外部大气压力一致。同时，在水套排气通道15内设有机械式 安全阀16,在高温灭菌过程中若发生所述水套排气通道15堵塞，水套2夹层内空气压力大 于外界大气压时，安全阀16打开释放压力，始终保持水套2夹层内空气压力与外部大气压 力一致。
[0047] 在高温灭菌模式打开时，水套2外侧五个面的加热单元10打开，给水套2加热，水 套2内腔温度升至高温灭菌设定值时，为保持高温灭菌设定值温度对水套2内腔进行灭菌， 控制装置可任意打开或关闭任一加热单元10。当液位传感器21感知水套2内无水时，控制 装置发出指令对水套2进行加热。温度传感器20测定水套2夹层内水温升到设定值时，控 制装置发出指令信号停止对水套2加热。
[0048] 水箱5上部有一水箱进水口 6,通过第一循环通道8与水套2底部的水套出水口 3 相通。水箱5底部有一排水口 13,水套内的水受污染后需要换水时排水口 13打开排出循环 水。水箱5上部有排气口，其上连接有水箱排气通道17,为保持水箱5内气压与外部大气压 相一致。水箱5底部的水箱出水口 7处设有一单向常闭型电磁阀14,循环水系统运行时受 控制装置指令打开。水箱5的容积大于水套2的容积，这样设计的目的是：1)保证在本发 明水套式培养箱高温灭菌过程中，水箱5能够完全容纳从水套2放入到水箱5的水；2)培 养箱长期工作致使水套2内的水位低于低水位传感器19的探头时，控制装置发出信号开启 补水系统，水箱5内多余的水可作补水用。
[0049] 循环单元包括一个第二循环通道11及微型水栗12。当水套2首次加水或水套2 内循环水更换时，水栗12通过控制装置发出指令信号打开，从培养箱外部经由外部进水口 9吸入纯净水，通过水套2顶部水套进水口 4给水套2加水。当水套2夹层内水位升至高水 位传感器18的探头时，信号传至控制装置，控制装置发出指令信号，水栗12停止工作，停止 给水套2加水。
[0050] 在开启高温灭菌模式前，水套2底部的单向常闭型电磁阀14受控制装置发出指令 打开，水套2夹层内水经水箱进水口 6流入水箱5。在高温灭菌模式进行时，循环单元停止 工作。在高温灭菌模式结束时，水箱5底部的单向常闭型电磁阀14和水栗12同时打开，循 环水被水栗12吸附经由第二循环通道11通过水套进水口 4进入水套2内。
[0051] 需要更换水套2夹层内循环水时，水套2底部的单向常闭型电磁阀14和水箱出水 口 7受控制装置发出指令打开，水套2内水经水箱进水口 6流入水箱5,再经过水箱出水口 7排出箱体1外。
[0052] 需要清洗水套2和水箱5时，控制装置发出指令，水栗12开启，水套2底部的单向 常闭型电磁阀14打开，水箱5底部的单向常闭型电磁阀14打开，循环水在水套2和水箱5 之间循环流动，清洗完毕，打开水箱5底部排水口 13,排出循环水。
[0053] 当水套2内的水位低于低水位传感器19的探头时，信号传至控制装置，控制装置 发出指令，水栗12开启，水箱5底部的单向常闭型电磁阀14打开，水栗12从水箱5吸附水 经水套进水口 4给水套2内补水。当水套2内水位高于高水位传感器18的探头时，信号传 至控制装置，控制装置发出指令，水栗12关闭，水箱5底部的单向常闭型电磁阀14关闭，补 水停止。
[0054] 第一次加水，如图2所示，箭头表示水流方向，控制装置发出指令，水栗12开启，外 部进水口 9打开，水流如图1所示，从外部进水口 9经过第二循环通道11通过水套进水口 4流入水套2,当水套2内水位升至高水位传感器18的探头时，信号传至控制装置，控制装 置发出指令，水栗12关闭，停止供水。
[0055] 图3所示，所有阀门关闭，水栗12关闭。当培养箱内腔中心点温度低于设定值 时，例如设定值是36. 8°C，信号传至培养箱控制装置，发出指令，则布置于水套2底部的加 热单元10打开加热，当培养箱内腔中心点温度高于设定值时，例如设定值是37°C，信号传 至培养箱的控制装置，发出指令，则布置于水套2底部的加热单元10停止加热，如此反复， 以保证培养箱箱体1内腔温度在设定温度范围内变化，例如保证培养箱箱体1内腔温度在 36. 8°C~37. 2°C范围内变动。为防止实验运行中培养箱内腔中心点温度计损坏，造成主控 系统失灵，则启动应急方案，温度传感器20暂时起到上述测定功能，防止实验失败。
[0056] 图4所示为本发明水套式培养箱高温灭菌方法高温灭菌模式示意图。开启高温灭 菌模式，控制装置发出指令，单向常闭型电磁阀14打开，循环水从水套2内从水套出水口 3 流出，经过第一循环通道8从水箱进水口 6流入水箱5内，当循环水完全从水套2流入水箱 5之后，液位传感器21感知无水信号传至控制装置，发出指令，布置在水套2外侧的左、右、 下、后四个方向的加热源10和外门上的加热元器件同时通电，对水套2进行加热，当培养箱 箱体1内腔温度升到设定值时（例如设定值90°C )，控制装置发出指令，所有加热单元停止 加热。此时培养箱箱体1内腔温度会继续升高，当温度升到极限值时，例如92°C，培养箱箱 体1内腔温度开始下降，当培养箱箱体1内腔温度下降到设定值（例如设定值90°C)，信号 传至控制装置，相关加热单元再次通电对水套2加热，当培养箱箱体1内腔温度升到设定值 时（例如设定值90°C)，控制装置发出指令，所有加热单元10停止加热。如此循环反复，使 培养箱箱体1内腔温度保持在设定值温度（例如设定值90°C )持续设定时间长度，例如设 定时间9个小时，即持续保持培养箱箱体1内腔温度在90°C达9个小时，此时所有加热单元 10停止对水套2加热，以此达到对培养箱箱体1内腔进行90°C高温高湿灭菌。
[0057] 本发明水套式培养箱高温灭菌方法实现90°C高温高湿灭菌情况。
[0058] 打开水栗12及外部进水口 9,使水套2充满纯净水；关闭水栗12及外部进水口 9 的阀门，打开单向常闭型电磁阀14,让水从水套出水口 3流出，经过第一循环通道8从水箱 进水口 6流入水箱5内储存；水套五面五组加热源10同时通电。内腔中心温度升到90°C 时，加热单元10停止加热，同时测量培养箱外部可触及部位各关键点所达到的温度；自水 套2内腔中心点温度达到90°C后，PC电脑间隔5秒记录内腔中心点温度参数；自水套2内 腔中心点热电偶输出温度达到90°C后，所有加热单元10断电，不触碰培养箱任何零部件情 况下，让培养箱自然冷却；当水套2内腔中心点温度从90°C降至60°C时，记下所需时间；同 时打开水栗12、单向常闭型电磁阀14,让水在水套2与水箱5之间循环流动；当水套2内腔 中心点温度降至37°C时，关闭水循环系统，同时记下从60°C降至37°C所需时间。
[0059] 每隔15分钟分别对水套2的底部、背部、左侧面、右侧面，顶部、玻璃门及水套2内 腔中心点、上壁、下壁及玻璃的温度及加温的时间进行记录，具体为表1~表3所示：
[0060] 实施例一，环境温度：30°C ;升温时间：10 :30~12 :45
[0062] 表 1
[0063] 说明：
[0064] 1)培养箱腔体内胆中心温度从30°C升到90°C所用时间是2小时15分钟；
[0065] 2)培养箱腔体内胆中心温度升至90°C时，加热单元10断电后，培养箱腔体内胆中 心温度最高升至90.9 °C。
[0066] 实施例二，环境温度：29°C ;升温时间：10 :15~13 :15
[0067]
[0068] 表 2
[0069] 说明：
[0070] 1)培养箱腔体内胆中心温度从29°C升到90°C所用时间是3小时；
[0071] 2)培养箱腔体内胆中心温度升至90°C时，加热单元10断电后，培养箱腔体内胆中 心温度最高升至90. 4°C。
[0072] 实施例三，环境温度：34°C ;升温时间：09 :30~11 :00
[0074] 表 3
[0075] 说明：
[0076] 1)内胆中心温度从36°C升到90°C所用时间是1小时30分钟（水套内的水已在一 天前放出）；
[0077] 2)内胆中心温度升至90°C时，加热电缆断电后，内胆中心温度最高升至90. 5°C ;
[0078] 3)内胆中心温度从90°C断电后降至60°C时用时2小时；
[0079] 4)内胆中心温度60°C循环水（循环水共40升）进入水套开始循环冷却，内胆中 心温度降至37 °C用时42分钟。
[0080] 每隔10分钟分别对水套2的底部、背部、左侧面、右侧面，顶部、玻璃门及水套2内 腔中心点、上壁、下壁、左壁、右壁及玻璃的温度及加温的时间进行记录，具体为表4所示：
[0081] 实施例四，环境温度：27°C ;升温时间：10 :00~12 :35
[0084] 表 4
[0085] 说明：
[0086] 1)内胆中心温度从31. 8°C升到90°C所用时间是2小时35分钟；
[0087] 2)内胆中心温度升至90°C时，加热电缆断电后，内胆中心温度最高升至90. 9°C ;
[0088] 3)内胆中心温度从90°C断电后降至60°C时用时2小时57分钟；
[0089] 4)内胆中心温度60°C循环水（循环水共48升）进入水套开始循环冷却，内胆中 心温度降至37 °C用时58分钟。
[0090] 由此可见，本发明水套式二氧化碳培养箱实现高温灭菌可行。能实现高温干热空 气灭菌（温度大于l〇〇°C，加热时间加长或功率加大）或湿热灭菌（温度90~97°C，湿度 大于95 %，湿度采用同气套式相同的自然蒸发方式），可以弥补目前水套式二氧化碳培养 箱不能实现高温灭菌的情况，大大提高了培养研究实验的成功率。
[0091] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，其他人员在不违背本发明创造精神的前提下作出等同的变型或替换均包含在本申 请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 水套式培养箱高温灭菌方法，其特征在于，包括如下步骤： 第一步，水套内的水经水套出水口、水箱进水口流入水箱； 第二步，当水套内无水时，对水套进行加热； 第三步，当培养箱箱体内腔的温度上升到设定值时，停止对水套加热，并使培养箱箱体 内腔的温度保持在设定值温度，进行高温灭菌； 第四步，完成高温灭菌后，培养箱内腔自然冷却至第一设定温度时，打开水栗、水套出 水口及水箱进水口，使水在水套与水箱之间循环流动； 第五步，箱体内腔温度降至第二设定温度后，使内胆充满纯净水。2. 根据权利要求1所述的水套式培养箱高温灭菌方法，其特征在于，所述第三步中，设 定值温度为湿热灭菌90°C~97°C，干热灭菌120°C~140°C。3. 根据权利要求2所述的水套式培养箱高温灭菌方法，其特征在于，所述第三步中，保 持在设定值温度的时间为2小时~9小时。4. 根据权利要求1所述的水套式培养箱高温灭菌方法，其特征在于，所述第四步中，第 一设定温度为50°C~70°C。5. 根据权利要求1所述的水套式培养箱高温灭菌方法，其特征在于，所述第五步中，第 二设定温度为37 °C。
【文档编号】A61L2/06GK105983111SQ201510058536
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】吴峻, 张云春, 孙大炜
【申请人】上海力申科学仪器有限公司