三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究。首先在纯水体系中模拟三聚氰胺诱导结石的形成过程，探究诱导机理。其次在人工尿液中模拟抑制剂消石作用，并测量不同抑制剂调控下，结石的生长速率，通过比较体外的热力学动力学数据，获取最佳的消石方法，最终指导动物体内实验。与现有技术相比，本发明角度新颖，方法简单易行，并实现了体外模拟对体内实验的指导作用，系统模拟的结石的生长和抑制过程。
【专利说明】
三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究
技术领域
[0001]本发明属于生命医学技术领域，尤其是涉及一种三聚氰胺促进肾脏尿酸结石形成的机理及其消石研究方法。【背景技术】
[0002]泌尿系结石是生物体内病理矿化的产物，包括肾结石、输尿管结石、膀胱结石和尿道结石。尿酸结石常见于肾和输尿管，其发病率随国家与地区的不同而不同，占泌尿系结石的5%?40%，仅次于草酸钙结石。近年来随着我国经济的发展，生活水平的提高，人们的饮食习惯也在起着显著的变化，其中一个主要的变化就是鱼肉类食品及乙醇饮料摄取量的增加，尿酸在血液中浓度不断增加，从而导致尿酸结石发病率呈上升趋势。因此，研究尿酸结石在泌尿系结石中最新的比例变化并进一步探讨尿酸结石的成因，成为泌尿系结石研究的一个重要方面。
[0003]2007年的“宠物粮食污染”和2008年“三鹿奶粉”事件爆发后，人们才开始对于三聚氰胺引起的肾结石展开研究。到目前为止，人们把主要的精力集中在对三聚氰胺检测方法和技术以及儿童泌尿系结石的诊疗研究及预后上。发展了重量法、硫酸电位滴定法、HPLC、 HPLC-MS、GC-MS和ELISA试剂盒法，比色法等三聚氰胺检测方法。Wu等人(Wu，C.F.;Liu， C.C.；ffu,M.T.Urinary melamine and adult urolithiasis in Taiwan.Clin.Chim.Acta.2010，411，184-189.)研究结果显示在小儿肾结石形成原因中，无论是尿酸结石还是妈结石，低剂量三聚氰胺都起了主要作用。Sun等人(Sun N，Shen Y,Sun Q,et al.Melamine related urinary calculus and acute renal failure in infants ? Zhonghua Erke Zazhi 2008;46:810-815.)第一次研究了结石成分发现结石由三聚氰胺(29.2 % )，尿酸(52.2 % )，剩余物质(18.6 % )，没有鉴定到三聚氢酸存在。
[0004]而关于三聚氰胺如何诱导结石形成的机理，如何影响纳米结晶与结石形貌以及改变结石形成的热力学与动力学过程等方面的研究相对较少，对三聚氰胺导致结石形成过程的体外模拟还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是从分子化学的角度去研究三聚氰胺诱导尿酸结石的机理，并找到消除结石的药物。这一问题的解决，不仅能够对三聚氰胺及其它化学物质引起肾结石形成的影响及机制进行阐释，还能对现有的结石理论进行论证和补充；不仅能为结石后续非手术性治疗提供理论参考，还能对食品工业中添加剂的控制和筛选提供指导；不仅能为结石预防医学提供新的思路，还可以对化学结晶的形貌与结构控制提供新的方法。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0007]一种三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究，其特征在于，包括以下步骤:
[0008](1)水体系下探究三聚氰胺对尿酸结石的形成的诱导作用研究:
[0009]设置对照实验，将各组溶液超声，静置，形成结石，洗涤，烘干样品，通过对照实验发现水体系下三聚氰胺对尿酸结石的形成诱导规律；
[0010](2)根据(1)中最佳比例，从动力学角度，进一步在人工尿液体系中模拟三聚氰胺-尿酸结石的形成过程，并探究结石抑制剂柠檬酸、酒石酸钠分别对结石形成速率的影响；
[0011](3)根据动力学数据指导体内动物实验；
[0012](4)在高尿酸小鼠的基础上建立三聚氰胺诱导结石模型；
[0013](5)消石:用不同的抑制剂灌胃，找到合适的抑制剂和使用控制方法。[0〇14]本发明方法从分子角度、从动力学热力学角度出发，在人工尿液中分别模拟不同抑制剂对结石的形成过程，测定结石生长速率，利用紫外可见分光广度计测得结石生长动力学数据，从而综合比较不同情况下的生长速率，步骤简单，对体内研究有一定的指导作用。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0015]1、本发明实现了体外模拟指导体内动物实验的技术，实验方法简单、安全。
[0016]2、本发明的方法在动物实验过程中，克服了传统的老鼠体内尿酸含量过低的困难，设计了先建立高尿酸模型，再利用三聚氰胺促进肾结石的形成这一思路，并成功实现。
[0017]3、本发明的方法较传统的动物模型，结石形成周期短，传统的一个月时间，本发明方案仅5天便可批量产生小鼠肾结石。
[0018]4、本发明不仅能为结石后续非手术性治疗提供理论参考，还能对食品工业中添加剂的控制和筛选提供指导；不仅能为结石预防医学提供新的思路，还可以对化学结晶的形貌与结构控制提供新的方法。【附图说明】
[0019]图1为实施例1所得纯水体系中不同比例三聚氰胺诱导尿酸结石体积比较图。
[0020]图2为实施例1所得产物在不同调控下的反应速率图。
[0021]图3为实施例1步骤(3)中高尿酸模型小鼠肾脏染色切片图。(是第3天肾脏病理改变 HEX 400)[〇〇22]图4为实施例1步骤(4)中小鼠肾脏第3天在HEX400的倍数下得到的肾脏病理改变照片。(第3天肾脏病理改变HE X 400)【具体实施方式】[〇〇23]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。[〇〇24] 实施例1
[0025]本实施例三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究，包括以下步骤:[〇〇26](1)水体系下探究三聚氰胺对尿酸结石的形成的诱导作用研究:称取168mg尿酸放置于烧杯中，加入l〇〇〇mL蒸馏水，煮沸后形成尿酸的过饱和溶液(lmM)。将尿酸过饱和溶液冷却至体温(?37.5 °C )，并调节pH至6。取一定体积的尿酸饱和溶液，分别向其中加入三聚氰胺粉末，溶解，使三聚氰胺浓度为〇 ? 2mM、0 ? 4mM、0 ? 5mM、0 ? 6mM、0 ? 8mM、1 ? OmM、2 ? OmM。充分混合后，先超声lOmin，然后置于37.5 °C的恒温槽中静置24h，最后将沉淀用3000rmp离心 5min，再分别有蒸馏水、乙醇洗涤数次，冷冻干燥。[〇〇27]图1中，尿酸与三聚氰胺在不同摩尔浓度比例下反应情况图:2—7分别是5:1、5:2、 5:3、5:4、1:1、1:2。图1是纯水体系中不同比例三聚氰胺诱导尿酸结石体积比较图，通过设置对照实验，可以看出，单独的尿酸不易形成结石，而加入三聚氰胺以后可以产生结石，且随着三聚氰胺加入量的不断增大，沉淀体积逐渐增大，当三聚氰胺与尿酸的摩尔浓度比达至ljl:l时，沉淀体积达到最大，继续增加三聚氰胺，体积不再膨胀。通过体外模拟找到了上述结石形成的最有利条件。
[0028](2)根据(1)中最佳比例，从动力学角度，进一步在人工尿液体系中模拟三聚氰胺-尿酸结石的形成过程，并探究结石抑制剂柠檬酸、酒石酸钠分别对结石形成速率的影响:1.不同浓度柠檬酸对三聚氰胺促进尿酸结石的抑制效果探究:用人工尿液配制10mM浓度的尿酸、10mM三聚氰胺溶液，取4个锥形瓶，编号1、2、3、4，分别四只锥形瓶中加入20mL10mM尿酸溶液，再分别向4个瓶中分别加入蒸馏水、0.5mM柠檬酸、ImM柠檬酸、2mM梓檬酸各lmL，将4瓶溶液在磁力搅拌混合均匀，接着在磁力搅拌下，分别滴加20mL10mM的三聚氰胺溶液，滴加结束后，立即超声5min，静置，每隔20min取上清液，利用紫外-可见分光光度计测溶液中尿酸的吸光度，尿酸在紫外光有两个吸收峰A = 236nm、A = 291nm，而三聚氰胺在紫外光下没有吸收，可以在A = 291nm处测溶液中尿酸的吸光度值A，由于三聚氰胺会与尿酸逐渐反应生成沉淀，澄清液中尿酸的浓度逐渐降低，吸光度A逐渐减小。根据朗伯一比耳定律:A = -lgT=e be，吸光度与浓度成正比，因此根据记录的吸光度值，可绘制尿酸的吸光度随时间的变化曲线。再将时间t时刻的A除以t = 0时的吸光度值A〇,然后对(A/A〇)取对数，同样根据朗伯一比耳定律:六=-]^1=￡13(3，111(4/^()) = 111((3/(3())，再做111((3/(3())对时间的关系图，斜率即为反应速率。
[0029]n.酒石酸钠的抑制效果研究:将柠檬酸换成酒石酸钠、其他条件不变，重复上述实验。以上每组实验均重复3遍取平均值。
[0030]图2为实施例1所得产物在不同调控下的反应速率图。(a)为柠檬酸调控下尿酸的吸光度曲线，(b)为酒石酸钠调控下的尿酸的吸光度曲线。图(a)中，相对于空白组来说，当加入少量的尿酸时，体系中尿酸下降速率较快，结石产生速率较快，但当尿酸浓度为2mM时， 尿酸迅速与降低，与柠檬酸结合，体系无结石产生。表明高浓度的柠檬酸具有消石作用。图 (b)中随着酒石酸钠的浓度不断增大，尿酸浓度降低速率相对于空白对照组来说，变化不大，因此，酒石酸钠的抑制效果一般。[〇〇31](3)根据动力学数据，指导体内动物实验，建立小鼠三聚氰胺-尿酸结石模型:[〇〇32] 1.分组建模:随机将小鼠分为3组，2个给药组，1个溶媒体对照组，每组20只。各组老鼠每日自由使用饲料和水。配制50mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液供溶媒体对照组使用。
[0033]n.腹腔注射:将氧嗪酸钾加入到10g/L甲基纤维素钠溶液中，配制成400m/L的稳定悬浊液。对照组每日腹腔注射0.2mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液，两个给药组分别每日注射、0.2mL尿酸400mg/Kg。隔天取血，测尿酸含量。每隔5天解剖肾脏，测小鼠肾体比，肾脏染色切片，观察肾组织变化。
[0034]图3为实施例1种第(3)步高尿酸模型小鼠肾脏染色切片图，图(a)是空白老鼠第3 天的肾脏染色切片图，图(b)是氧嗪酸钾组小鼠第三天肾脏染色切片图。图片是在400倍的显微镜下拍摄获得的。通过(a)(b)对比可以看出，氧嗪酸钾组肾脏未出现结石，但肾组织出现损坏，肾小管肿大，大量炎性细胞在肾小球囊腔、肾小管及间质中。表明，单独的高尿酸不会使小鼠肾脏产生结石，但是会导致肾组织损坏。[〇〇35](4)三聚氰胺结石模型的建立
[0036]I ?分组建模:将三聚氰胺设定为1 OOmg/Kg、150mg/Kg、200mg/Kg，三个剂量组。同时设对照组进行造模预试验。随机将小鼠模型分为三组，第一组为氧嗪酸钾对照组20只，第二组为低剂量三聚氰胺诱导组20只，第三组为高剂量三聚氰胺诱导组20只。
[0037]n.腹腔注射和灌胃:对照组每天腹腔注射0.4mL400mg/Kg的氧嗪酸钾溶液，低剂量组(A组)每日腹腔注射0.2mL氧嗪酸钾200mg/Kg后立即灌胃0.2mL100mg/Kg的三聚氰胺溶液。中剂量实验组(B组)每日腹腔注射0 ? 2mL氧嗪酸钾300mg/Kg后立即灌胃0 ? 2mL150mg/Kg 的三聚氰胺溶液。高剂量实验组(C组)每日腹腔注射0.2mL氧嗪酸钾400mg/Kg后立即灌胃 0.2mL200mg/Kg的三聚氰胺溶液。连续实验31天，每隔3天、5天、7天、7天、9天解剖一次，为了方便观察小鼠肾脏，将肾脏进行纵向染色切片，染色后细胞质为红色，细胞核为蓝色，再放到显微镜下观察肾组织变化和结石情况。[〇〇38]图4为实施例1步骤(4)小鼠肾脏第3天在HEX400的倍数下得到的肾脏病理改变照片。(a)(b)低剂量组；(c)(d)中剂量组；(e)(f)高剂量组;从图可得，向高尿酸小鼠中灌胃低剂量和中剂量的三聚氰胺一段时间后，小鼠肾脏未均出现结石，但肾组织损伤十分严重。高剂量组的组织切片中发现大量的褐色的尿酸结石，表明高剂量下的诱导效果最佳。
[0039](5)消石:将产生结石的小鼠分三组，分别灌胃高、中、低剂量的梓檬酸，高剂量为 1500mg/Kg、中剂量1000mg/Kg、低剂量为500mg/Kg。其他抑制剂:柠檬酸、酒石酸钠、碳酸钠、 磷酸二氢钠等抑制剂操作同上。
[0040]实施例2
[0041]—种三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究，其特征在于，包括以下步骤:[〇〇42](1)水体系下探究三聚氰胺对尿酸结石的形成的诱导作用研究:设置对照实验，1个空白组，空白组为ImM的尿酸饱和溶液组;6个对照组为不同梯度比例的三聚氰胺和尿酸混合溶液组(对照组尿酸和三聚氰胺摩尔浓度比依次为:5:1、5:2、5:3、5:4、1:1、1:2)。将各组溶液超声5min后静置，形成结石，洗涤并烘干样品，通过对照实验发现，单独的尿酸溶液不形成结石，加入三聚氰胺后会促进其形成结石，当三聚氰胺与尿酸摩尔浓度比为1:1时， 产生结石体积最大。[〇〇43](2)根据(1)中最佳比例，从动力学角度，进一步在人工尿液体系中模拟三聚氰胺-尿酸结石的形成过程，并探究结石抑制剂柠檬酸、酒石酸钠分别对结石形成速率的影响。用人工尿液分别配制10mM的三聚氰胺和尿酸溶液，并向其中加入不同摩尔浓度的柠檬酸溶液 (低剂量组:.5mM;中剂量组:ImM;高剂量组:2mM)。尿酸在紫外光有两个吸收峰:A = 236nm、 入= 291nm，而三聚氰胺在紫外光下没有吸收，可以在A=291nm处测溶液中尿酸的吸光度值 A，由于三聚氰胺会与尿酸逐渐反应生成沉淀，澄清液中尿酸的浓度逐渐降低，吸光度A逐渐减小。根据朗伯一比耳定律:A = -lgT=ebc，吸光度与浓度成正比，因此根据记录的吸光度值，可绘制尿酸的吸光度随时间的变化曲线。再将时间t时刻的A除以t = 0时的吸光度值A〇， 然后对(A/Ao)取对数，同样根据朗伯一比耳定律:A = -lgT=ebc，ln(A/Ao) = ln(c/co)，再做ln(c/CQ)对时间的关系图，斜率即为反应速率。酒石酸钠调控操作及浓度同柠檬酸组。 [〇〇44](3)根据动力学数据指导体内动物实验，由于小鼠体内尿酸含量较低，先建立小鼠高尿酸结石模型:
[0045] 将小白鼠平均分为4组，一组空白组、三组高尿酸组(A组:低剂量组;B组:中剂量组;C组:高剂量组)
[0046](4)在高尿酸小鼠的基础上建立三聚氰胺诱导结石模型:将小鼠分为5组，一组空白对照组，一组氧嗪酸钾对照组，三组三聚氰胺实验组(低剂量组:l〇〇mg/Kg三聚氰胺+ 200mg/Kg氧嗪酸钾；中剂量组:150mg/Kg三聚氰胺+300mg/Kg氧嗪酸钾;高剂量组:200mg/Kg 三聚氰胺+400mg/Kg氧嗪酸钾)[〇〇47](5)消石:将产生结石的小鼠分三组，分别灌胃高(1500mg/Kg)、中(1000mg/Kg)、低(500mg/Kg)剂量的柠檬酸，酒石酸钠实验操作同上。(5)通过用不同的抑制剂灌胃，找到合适的抑制剂和使用控制方法。
【主权项】
1.一种三聚氰胺/尿酸结石的形成与消除方法研究，其特征在于，包括以下步骤:(1)水体系下探究三聚氰胺对尿酸结石的形成的诱导作用研究:设置对照实验，将各组溶液超声，静置，形成结石，洗涤，烘干样品，通过对照实验发现 水体系下三聚氰胺对尿酸结石的形成诱导规律；(2)根据(1)中最佳比例，从动力学角度，进一步在人工尿液体系中模拟三聚氰胺-尿酸 结石的形成过程，并探究结石抑制剂柠檬酸、酒石酸钠分别对结石形成速率的影响；(3)根据动力学数据指导体内动物实验；(4)在高尿酸小鼠的基础上建立三聚氰胺诱导结石模型；(5)消石:用不同的抑制剂灌胃，找到合适的抑制剂和使用控制方法。2.如权利要求1所述的方法，特征在于，步骤(3)中，所述动物实验采用小鼠；由于小鼠体内尿酸含量较低，先建立小鼠高尿酸结石模型:将小白鼠平均分为4组，一组空白组、三组高尿酸组(A组:低剂量组;B组:中剂量组；C 组:高剂量组)。3.如权利要求2所述的方法，特征在于，步骤(4)中，将小鼠分为5组，一组空白对照组， 一组氧嗪酸钾对照组，三组三聚氰胺实验组(低剂量组:l〇〇mg/Kg三聚氰胺+200mg/Kg氧嗪 酸钾；中剂量组:150mg/Kg三聚氰胺+300mg/Kg氧嗪酸钾；高剂量组:200mg/Kg三聚氰胺+ 400mg/Kg氧嗪酸钾)。4.如权利要求2所述的方法，特征在于，步骤(5)中，将产生结石的小鼠分三组，分别灌 胃高(1500mg/Kg)、中(1000mg/Kg)、低(500mg/Kg)剂量的梓檬酸，酒石酸钠实验操作同上。
【文档编号】A61K31/53GK105997968SQ201610319164
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】吴庆生, 张玉珍
【申请人】同济大学