药物组合物及其应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及药物组合物及其应用。该药物组合物由常压高浓度氧(NBO)与N?乙酰半胱氨酸(NAC)组成。急性脑缺血期给予NBO和再灌注给予NAC联合作用可显著降低急性脑缺血再灌后的梗死和水肿，效果显著强于单一治疗。NBO和NAC联合作用可显著降低缺血2小时，再灌注7天后动物的脑萎缩，脑组织损伤及神经功能损伤。联合治疗效果显著好于单一治疗效果。NBO和NAC联合作用可显著降低氧自由基的产生、PARP?1裂解和PAR的积累。联合治疗效果显著好于单一治疗效果。NBO和NAC联合作用可显著降低缺血再灌注对血脑屏障(BBB)的破坏和紧密连接蛋白的降解。
【专利说明】
药物组合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及药物组合物及其应用。
【背景技术】
[0002] 急性缺血性脑卒中的首要目标是挽救半暗带，如果不能得到再灌注，半暗带将发 展成为不可逆的损伤。运种损伤首先是由于缺血过程中的缺氧W及生物能量衰竭导致的， 随后是由于再灌注诱导的损伤W。半暗带的运一概念启发我们药物的发展方向为阻断细胞 死亡通路。
[0003] 如果组织得不到再灌或者血管的完整性受损，单纯的神经保护可能不足W治疗急 性中风。然而，再灌注的同时，也会由于一些机制造成额外的损伤，如炎症、氧化应激和兴奋 性损伤。N-乙酷半脫氨酸(NAC )，谷脫甘肤的前体，在临床中作为抗氧化剂，也是一种氧自由 基清除剂。在暂时性和永久性MCA0动物模型中已有证明NAC预处理(缺血前）能够通过其抗 炎作用减轻再灌注损伤和梗死面积。然而，缺血后给予NAC在治疗局灶性脑缺血中的作用还 鲜为人知。
[0004] 让人一直失望的是神经保护药物在临床试验中并没有表现出抗氧化剂的积极作 用。缺血性脑损伤的多阶段进程促使我们寻求联合的治疗方法用于治疗缺血性脑卒中。
【发明内容】
[0005] 现有的治疗都是针对急性脑缺血后缺血或者再灌注阶段的单一祀向治疗。有鉴于 此，本发明提供一种药物组合物及其应用。本发明的目的是采用针对缺血阶段和再灌注阶 段给予不同的药物，观察该治疗策略对急性脑缺血后的神经和血管保护作用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种药物组合物，由NB0与NAC组成。
[000引在本发明的一些具体实施方案中，NB0的有效剂量范围是95%化~100%化。
[0009] 在本发明的一些具体实施方案中，NAC的有效剂量是60mg/kg~150mg/kg。
[0010] 本发明还提供了所述药物组合物在制备降低急性脑缺血再灌后的梗死几率的药 物中的应用。
[0011] 本发明还提供了所述药物组合物在制备降低急性脑缺血再灌后的水肿几率的药 物中的应用。
[0012] 本发明还提供了所述药物组合物在制备降低缺血2小时和/或再灌注7天后动物的 脑萎缩和/或脑组织损伤的药物中的应用。
[0013] 本发明还提供了所述药物组合物在制备降低氧自由基的产生和/或PARP-1裂解 和/或PAR的积累的影响的药物中的应用。
[0014] 本发明还提供了所述药物组合物在制备降低缺血再灌注对BBB的破坏和紧密连接 蛋白的降解的药物中的应用。
[0015] 本发明还提供了所述药物组合物在制备治疗急性脑缺血后的神经保护药物中的 应用。
[0016] 本发明还提供了所述药物组合物在制备治疗急性脑缺血后的血管保护药物中的 应用。
[0017] 本发明的实验结果表明：
[0018] (l)NBO和NAC联合治疗可显著降低急性脑缺血再灌后的梗死和水肿，效果显著强 于单一治疗。
[0019] (2)NB0和NAC联合治疗可显著降低缺血2小时，再灌注7天后动物的脑萎缩，脑组织 损伤及神经功能损伤。联合治疗效果显著好于单一治疗效果。
[0020] (3)NB0和NAC联合治疗可显著降低氧自由基的产生、PARP-1裂解和PAR的积累。联 合治疗效果显著好于单一治疗效果。
[0021] (4)NB0和NAC联合治疗可显著降低缺血再灌注对BBB的破坏和紧密连接蛋白的降 解。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0023] 图1示NB0和NAC联合治疗可显著降低急性脑缺血再灌后的梗死；（A)示脑梗死代表 图，（B)示统计图，（C)示水肿，效果显著强于单一治疗；
[0024] 图2示NB0和NAC联合治疗可显著降低缺血2小时，再灌注7天后动物的脑萎缩(A和 B)，脑组织损伤及神经功能恢复情况(C);
[0025] 图3示NB0和NAC联合治疗可显著降低氧自由基的产生(AKPARP-1裂解(B)和PAR的 积累(C)的影响:A)具有代表性的肥t巧光图像显示每组在皮质和皮质下超氧阴离子的产生 情况;联合治疗效果显著好于单一治疗效果；
[0026] 图4示NB0和NAC联合治疗可显著降低缺血再灌注对BBB的破坏和紧密连接蛋白的 降解的作用；A)对EB泄露进行定量，联合治疗显著降低缺血再灌注诱导的EB泄露（巧< 0.05，11 = 6);8)缺血再灌注后紧密连接蛋白(31日11山11-5降解而联合治疗可抑制其降解;比例 尺= 50ym;C)缺血再灌注可显著降低紧密连接蛋白claudin-5(C)及occludin(D)的降解，联 合治疗可显著降低紧密连接蛋白的降解。
【具体实施方式】
[0027] 本发明公开了一种药物组合物及其应用，本领域技术人员可W借鉴本文内容，适 当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说 是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进 行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用 进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0028] 本发明提供的药物组合物及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0029] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0030] 实施例1
[0031] 1.常压高浓度氧(NB0)与N-乙酷半脫氨酸(NAC)联合治疗对缺血再灌注后急性期 的神经及血管保护作用:雄性Sprague-Dawley大鼠（270-290g)大脑中动脉栓线阻塞化的过 程中将其暴露于NB0(95%02)或常氧（21%02)，之后进行48小时的再灌注。大鼠再灌注前 5min腹腔注射NAC(60mg/kg)或相应溶剂。实验分为四组：（l)Air+Veh组；（2)Air+NAC组；（3) NBO+NAC组；（4)NBO+Veh组。再灌4她后检测脑梗死体积、BBB损伤、行为学评分、检测自由基 产生量、HIF-la、PARP、VEGF。
[0032] NB0与NAC联合治疗对缺血再灌注后慢性期的神经保护作用：雄性Sprague-Dawley 大鼠（270-290g)大脑中动脉栓线阻塞2小时的过程中将其暴露于NB0(95%化)或常氧(21% 化），之后进行7天的再灌注。大鼠再灌注前5分钟腹腔注射NAC(60mg/kg)或相应溶剂。实验 分为四组：（l)Air+Veh组；（2)Air+NAC组；（3)NB0+NAC组；（4)NB0+Veh组。再灌7天后进行神 经功能评分、foot-化1111:、〇96]1-門16(1检测神经功能恢复、取组织检测脑萎缩^及细胞调亡 情况。
[0033] 2.方法
[0034] 2.1实验设计
[00巧]雄性Sprague-Dawl巧大鼠（270-290g)大脑中动脉栓线阻塞2小时的过程中
[0036] 将其暴露于NB0(95%化)或常氧（21%化），之后进行48小时的再灌注。大鼠再灌注 前5分钟腹腔注射NAC(60mg/kg)或生理盐水。再灌4她后检测脑梗死、脑水肿、BBB损伤、氧自 由基、hif-la、VEGF、PARP、PAR。
[0037] 2.2实验动物分组
[003引实验分为四组：（l)Air+Veh组；（2)Air+NAC组；（3)NB0+NAC组；（4)NB0+Veh组。
[0039] 2.3建立大鼠短暂性急性脑缺血模型
[0040] 2.3.1 步骤
[0041] (1)大鼠用异氣烧气体麻醉后，用剌毛器将颈部剌毛，仰邸后用胶带固定四肢。
[0042] (2)用酒精对颈部皮肤进行消毒，并准备好手术器械及结扎线。
[0043] (3)沿着颈部中线剪口，口长约4厘米，剪开结缔组织，分离肌肉和筋膜。
[0044] (4)用显微綴分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉化CA)和颈内动脉(ICA)。
[0045] (5)放一根短线结扎CCA，打个活结，尽量靠近分叉。
[0046] (6)放一根长线，剪为两段，分别在颈外动脉的远端打死结，下面的结尽量向上打， 然后綴子拉住下面的结，另一手将上面的结再往上打。确认结拉紧W后，用眼科剪在两个结 中间剪断。
[0047] (7)分离颈内动脉，并放置动脉夹。注意:不能碰到迷走神经，并确保夹子完全闭塞 了血液的流动。
[004引（8)放一根长线，剪为两端，分别在颈总动脉相连的颈外动脉上打一个活结和一个 单结。活结靠近交叉口的远端，单结靠近交叉口的近端，两个结都不要拉紧。
[0049] (9)在靠近颈外动脉的死结处用眼科剪剪一个小口，插线栓。当线栓到达动脉夹处 时，拉紧活结并取掉动脉夹，继续前进至线栓的白色标记处时停止前进并拉紧活结。
[0050] (10)拉钩去掉，缝皮(4号手术缝线），待大鼠苏醒后放于干净的鼠笼中饲养。
[0051] (11)再灌注的时候，麻醉大鼠，剪开缝线，放拉钩，把拴线抽出，将单结打为死结， 确认不出血的话，将CCA的活结去掉，缝皮。
[0化2] 2.3.2手术后神经功能学评分
[0053] 按照Rogers八分神经功能评分标准:0无神经功能障碍；1左前爪不能完全伸展；2 拉尾时左前爪抓握能力减弱;3向各个方向自发运动，拉尾时向左侧转圈；4向左侧转圈或行 走;5仅当受激时行走;6无意识，受激时无反应;7死亡。
[0054] 2.4脑梗死、脑水肿的测定
[0化5] 2.4.1 TTC染色的原理
[0056]氯化-2，3，5-Ξ苯基四氮挫（2，3，S-Tri地enyltehazolium 化loride，TTC)包括 两种形态，即还原型(红色)和氧化型(无色）。正常脑组织内含有脱氨酶，在尼克酷胺腺巧二 核巧酸(NADP)存在的条件下，能将无色的氧化型基团（氧化Ξ苯基四氮挫）还原成还原型 TTC(即TTC-red)。脑缺血后，缺血区域内的神经细胞缺血坏死，组织内还原型尼克酷胺腺巧 二核巧酸（NADPH)丧失，而正常脑组织内则存在。当TTC与脑组织结合后，正常区域内的 NADP聞尋氧化型还原为还原型，该区域呈现红色，而梗死区域内因缺乏NADPH，故不能将其还 原，仍为氧化型，该区域组织颜色则为灰白色。本法是脑缺血早期直观简便、快速易行、准确 而实用的显示方法。
[0化7] 2.4.2脑梗死体积的测定
[0058]大鼠缺血2小时，再灌48小时后，深度麻醉，固定于自制的手术木板上，置于解剖盘 中，开胸暴露并游离出屯、脏，经左屯、室插入灌流针并固定，切开右屯、耳，灌注冰冻1XPBS(4 °C)，直到肝脏和肺颜色转白及右屯、房流出液澄清，断头取脑，放入脑模具中并调整脑组织 的摆放位置，前3毫米弃掉，剩余的每2毫米切一片，共六片，注意保持脑片的完整性。将脑片 浸没于TTC染色液中，37°C水浴避光染色5分钟，翻转脑片再次染色五分钟。染色完毕后拍 照，并用Image J软件进行脑梗死体积统计分析。脑梗死体积百分比=脑梗死体积/总体积 X100%。
[0化9] 2.4.2脑水肿体积的测定
[0060]将上述TTC染色后拍得的图片用Image J分别统计缺血侧与非缺血侧的体积 [0061 ]再进行统计分析。脑水肿体积百分比=缺血侧体积/非缺血侧体积X100%。
[0062] 2.5伊文思蓝渗透率的测定
[0063] 2.5.1伊文思蓝检测血脑屏障的原理
[0064] 伊文思蓝，又称偶氮蓝，是一种常用的偶氮染料制剂，其分子量大小与血浆白蛋白 相近。在神经所研究中伊文思蓝常被用于失踪观察血脑屏障(BBB)的完整性。在血液中伊文 思蓝与血浆白蛋白有很高的亲和力，正常生理条件下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所W 与血浆白蛋白结合的伊文思蓝也不能透过血脑屏障，无法使其着色。如果血脑屏障遭到破 坏，血浆白蛋白透过血脑屏障进入神经系统，与其结合的伊文思蓝进入神经系统并使其着 色。
[00化]2.5.2操作步骤
[0066] (1)大鼠缺血再灌注后47小时，股静脉注射2%伊文思蓝(3ml/kg);
[0067] (2)1小时后，用水合氯醒麻醉。使大鼠仰邸固定，用剪刀剪开大鼠胸膛，使屯、脏充 分暴露；
[0068] (3)将灌流针尖插入左屯、室后固定，剪开右屯、耳，血液流出。通过灌流累将预冷的 憐酸盐缓冲液匀速灌入到屯、脏经过体内循环移除体内血液直至右屯、耳流出的液体至无色；
[0069] (4)将大鼠断头，取出大脑。去掉嗅球，脑干及小脑，将大脑分为左右半球，称重。将 大脑半球放入1.5毫升EP管中后，加入1毫升预冷的Ξ氯乙酸，用匀浆器充分匀浆。然后4°C 离屯、14000gX15分钟；
[0070] (5)吸取上清，用酶标仪检测620nm波长下的吸光值，根据标准曲线计算得出脑中 伊文思蓝的含量(单位为yg/g)。
[0071] 2.6氧自由基检测
[0072] 2.6.1二氨乙锭检测氧自由基的原理
[0073] 二氨乙锭是一种最常用的超氧化物阴离子巧光检测探针。可W直接用于活细胞的 标记。二氨乙锭被活细胞摄入后，可W在细胞内的超氧化物阴离子作用下脱氨，产生 ethidium。化Mdium(例如漠化乙锭)可W和RNA或DNA结合产生红色巧光。当细胞内的超氧 化物阴离子水平较高时，产生的ethidium较多，红色巧光就较强，反之则较弱。运样就可W 用二氨乙锭进行超氧化物阴离子水平的检测。
[0074] 2.6.2操作步骤
[0075] (1)缺血前5分钟静脉注射0.5mg肥t(浓度为Img/ml);
[0076] (2)缺血2小时，48小时；
[0077] (3)1XPBS灌流取脑，浸泡4%PFA中后固定至少24小时；
[0078] (4)振动切片，厚度为40微米；
[0079] (5)脑切片用含0.2%棚氨化钢的PBS处理20min然后用PBS漂洗；
[0080] (6)封片；
[0081] (7)置于巧光显微镜下观察(激发波长510~550,发射波长>580)。
[0082] 2.7 Western blot检测
[0083] 2.7.1组织取材
[0084] 再灌注48小时后，将大鼠用PBS灌流后取脑，分为非缺血侧(NI)与缺血侧（I)，置于 1.5ml离屯、管中，-80°C保存备用。
[00化]2.7.2总蛋白提取
[0086] (1)组织块与裂解液按l:7(v/v)加入EP管，裂解液中含1%的蛋白酶抑制剂(PI);
[0087] (2)用匀浆器进行匀浆；
[0088] (3)冰上静置裂解30分钟；
[0089] (4) 14000巧m离屯、15分钟，取上清，-80°C保存备用。
[0090] 2.7.3样品准备
[0091 ] (1)用BCA蛋白定量试剂盒测定所提取样品的蛋白浓度；
[0092] (2)调整上样量，使各组蛋白总量一致，在样品中加入5X上样缓冲液，吹打均匀，短 暂离屯、，100°C煮沸5分钟。
[009引 2.7.4 SDS-PAGE电泳
[0094] (1)仔细清洗玻璃板，无水乙醇去脂(可用洗洁精洗并冲洗干净，惊干），干燥后安 装。
[00M] (2)灌胶与上样
[0096] ①对齐玻璃板后用夹子夹紧并固定在架子上，准备灌胶；
[0097] ②按W下配方配制凝胶(按目的蛋白的分子量确定胶的浓度，见后面附表）
[0098] 试剂10%分离胶5%浓缩胶
[0099] Ξ蒸水 4ml 2.7ml
[0100] 30%Acr-Bis 3.3ml 0.67ml
[0101] 1.5M Tris-HCl(pH 8.8) 2.5ml -
[0102] l.OM Tris-HCl(pH 6.8) - 0.5ml
[0103] 10%SDS 0.1ml 0.04ml
[0104] 10%APS 0.1ml 0.04ml
[0105] ΤΕΜΗΜμΙ 化1
[0106] 加入TEM邸后立即摇匀即可灌胶。小屯、将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为积 层胶留有足够空间(梳齿长加1厘米）。顶层注入Ξ蒸水做覆盖液，W阻止空气中氧气对凝胶 的抑制作用，室溫放置30分钟；
[0107] ③凝胶聚合完成后，倒掉覆盖物，滤纸吸干残留液体；
[0108] ④按上述配方制备好浓缩胶，迅速注入分离胶上端，立刻插入干净的梳子。待浓缩 胶聚合完毕后，将玻璃板安装至电泳槽中，加入1 X电泳缓冲液，并浸没胶及梳孔，检查是否 泄露；小屯、移去梳子，按次序上样，每孔不超过20μ1，加扣1 marker。然后开始电泳。起始电 压为80V，待漠酪蓝进入分离胶后，将电压增加到120V，继续电泳直至漠酪蓝达分离胶底部， 即可终止电泳。
[0109] 7.2.5 转膜
[0110] (1)电泳结束后，用蛋白转移装置将蛋白转到PVDF膜上，按转移蛋白的常规方法进 行:裁出与凝胶同样大小的膜，用甲醇浸泡15s，然后，Ξ蒸水浸泡2分钟，将膜浸入IX转膜 缓冲液中，平衡5分钟X3次；
[0111] (2)将电泳完毕的凝胶取出，切去积层胶，剥离至盛有转膜缓冲液的器皿中，平衡5 分钟，洗去胶上的SDS等离子。膜和胶都切去右上角做标记；
[0112] (3)棉垫和滤纸也要先在转膜缓冲液中浸润，从负极开始依次将棉垫、滤纸、凝胶、 PVDF膜、滤纸、棉垫放好，各层之间应避免气泡，整个操作在转移缓冲液中进行，夹好此Ξ明 治结构，移入已置有冰盒的转移槽缓冲液中，胶侧置负极，膜侧置正极。通电转移，350mA 2 小时或100V 1.5小时。
[0113] (4)断开电源，取出膜，用丽春红染液染1分钟，用Ξ蒸水洗2分钟（看有无清晰条 带，若无条带，不必浪费抗体和时间）。
[0114] 7.2.6免疫印迹
[011引（1)转膜结束后，用TBST洗膜，室溫下摇床上5分钟X 3次；
[0116] (2)将PVDF膜放入封闭液(5%脱脂牛奶，用1XTBST配制）中，室溫下置于摇床上封 闭2小时；
[0117] (3)TBST洗膜，摇床上5分钟X3次
[0118] (4)配好一抗(用1 TBST按说明书比例稀释一抗），混匀，滴加于塑封膜(Ξ边封好） 里，将PVD刊莫平放于塑封膜，赶尽气泡，将口封好，4 °C解育过夜；
[0119] (5) TBST洗膜，摇床上5分钟X 3次；
[0120] (6)配制二抗（用1XTBST按说明书比例稀释二抗），滴加到封口膜(将封口膜贴于 一平的板上)上，将PVD刊莫倒扣于封口膜上，倒解二抗，室溫2小时；
[0121] (7)TBST洗膜，摇床上5分钟X3次；
[0122] 7.2.7 显影
[0123 ] (1)将E化底物显色A、B液W1:1的比例混合；
[0124] (2)用滤纸将膜表面吸干，膜正面朝上，滴上ECL底物显色液，室溫反应1分钟；
[0125] (3)用滤纸将膜表面残余的显色液吸干，膜正面朝上包于保鲜膜中，放进暗盒中， 胶片压片15秒(运个时间要看发光的强度而定）；
[0126] (4)将胶片放于显影机中显影，然后用扫描仪扫描，图像分析系统（ImageJ等)进行 光密度分析。
[0127] 2.8免疫组织化学标记检测 [012引 2.8.1组织固定及取材
[0129] 再灌注48小时后的SD大鼠，用水合氯醒麻醉后，使大鼠仰邸固定，用剪刀剪开大鼠 胸膛，使屯、脏充分暴露。将灌流针尖插入左屯、室后固定，剪开右屯、耳，血液流出。通过灌流累 将预冷的憐酸盐缓冲液匀速灌入到屯、脏，经过全身循环移除体内血液直至右屯、耳流出的液 体至无色。然后把憐酸盐缓冲液换成4%的多聚甲醒，灌注约15分钟后，将大鼠的全脑取出， 放入有4%多聚甲醒的大离屯、管中后固定2小时，然后按10%、20%、30%的薦糖梯度脱水， 每次脱水都要等到组织块沉入试管底部后再更换高浓度薦糖溶液。
[0130] 2.5.2免疫组织化学标记检测步骤
[0131] (1)将脑组织标本用0CT进行包埋，然后用冰冻切片机进行冠状连续切片，厚度为 20微米，然后将切片贴到明胶包被过的载玻片上。室溫惊干后放置于-20°C冰箱备用。
[0132] (2)玻片从-20摄氏度冰箱取出后，复溫30分钟，清理干净脑片周围的包埋剂后，用 阻水笔在脑片周围画一圈阻水圈。
[0133] (3)阻水圈凝好之后，将玻片在1XPBS中洗3次
[0134] (4) 0.3 % Tr i t i on (1 X PBST抗体稀释剂配制)稀释的10 %羊血清封闭1.5小时。
[0135] (5)倾去血清，不必洗，加适当比例稀释的一抗（用1XPBST抗体稀释剂释，按1%比 例加入羊血清W降低背景），放入湿盒，4°C冰箱过夜(若双标，则两种一抗都要按比例加入 稀释液中）。
[0136] (6)第二天取出湿盒，室溫复溫30分钟，倾去一抗后，用1XPBST洗脱液清洗，10分 钟X3次。
[0137] (7)此后的步骤需要避光!加入按比例稀释的巧光二抗（1XPBST的抗体稀释剂配 制，1 %的血清)室溫避光解育1小时。
[013引（8)倾去二抗，用1 X PBST洗脱液清洗，10分钟X 3次。
[0139] (9)若双标，加入第二种按比例稀释的二抗，室溫避光解育1小时，再清洗3次。
[0140] (10)DAPI染核（1:100)，室溫避光15分钟，1 X PBST洗脱液清洗，5分钟X 3次次。
[0141] (11)巧光防泽灭的封片剂封片，共聚焦巧光显微镜观察。
[0142] 2.9统计学处理
[0143] 采用Image J软件对梗死照片和Western blot图像进行采集，Graph化d Prism统 计软件作图分析，实验数据W均值±标准差表示，用SPSS13.0进行统计学分析，当P<0.05 时表示有统计学意义。
[0144] 结果：
[0145] 表1急性期各组大鼠脑梗死情况
[0146]
[0147] Post Hoc Tests
[0148] Multiple Comparisons
[0149] VAR00002
[0150] LSD
[0151]
[0152] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0153] 备注；
[0154] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[01巧](本发明的化st化c Tests表格中均相同）；
[0156] 缺血2小时再灌注48小时后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.957)或NB0(p = 0.155)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.014)有显著差异。
[0157] 表2急性期各组缺血大鼠脑水肿情况 [015 引
[0159] Post Hoc Tests
[0160] Multiple Comparisons
[0161] VAR00002
[0162] LSD
[0163]
[0164] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[01化]备注；
[0166] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0167] 缺血2小时再灌注48小时后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.789)或NB0(p = 0.588)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.031)有显著差异。
[0168] 表3慢性期各组大鼠脑萎缩情况
[0169]
[0170] Post Hoc Tests
[0171] Multiple Comparisons
[0172] VAR00002
[0173] LSD
[0174]
[0175] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0176] 备注；
[0177] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[017引缺血2小时再灌注7天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.056)或NB0(p = 0.050) 治疗无显著差异，联合治疗(P = 0.012)有显著差异。
[0179]表4慢性期各组大鼠 7组连续切片中脑损伤情况
[0181]
[0182] 表5慢性期各组大鼠第1切片处脑损伤情况统计分析
[0183] Multiple Comparisons
[0184] VAR00002
[0185] LSD
[0186]
[01871
[0188] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0189] 备注；
[0190] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0191] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因 +4.7讓处，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.055)治疗无显著差异，单独NB0(p = 0.009)及联合治疗(P = 0.012)有显著差异。
[0192] 表6慢性期各组大鼠第2切片处脑损伤情况统计分析
[0193] Multiple Comparisons
[0194] VAR00002
[0195] LSD
[0196]
[0197] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[019引备注；
[0199] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0200] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因 +2.7讓处，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.013)治疗有显著差异，单独NB0(p = 0.001)及联合治疗(p = 0.003)有极显著差异。
[0201 ]表7慢性期各组大鼠第3切片处脑损伤情况统计分析
[0202]
[0203] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0204] 备注；
[0205] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0206] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因+0.7mm处，与非治疗组相比，单独NAC (p = 0.383)或单独NB0(p = 0.103)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.014)有显著差异。
[0207] 表8慢性期各组大鼠第4切片处脑损伤情况统计分析
[0208] Multiple Comparisons
[0209] VAR00002 脚0] LSD Γ02111
[0212]
[0213] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0214] 备注；
[0^5] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0216] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因 -1.3讓处，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.477)或单独NB0(p = 0.255)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.013)有显著差异。
[0217]表9慢性期各组大鼠第5切片处脑损伤情况统计分析 [0別引 Multiple Comparisons
[0219] VAR00002
[0220] LSD
[0221]
[0222] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0223] 备注；
[0224] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02巧]缺血2小时再灌注7天后，在距前因 -3.3讓处，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.593)或单独NB0(p = 0.253)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.044)有显著差异。
[0226] 表10慢性期各组大鼠第6切片处脑损伤情况统计分析
[0227] Multiple Comparisons
[0228] VAR00002
[0229] LSD
[0230]
[0231] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0232] 备注；
[0233] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0234] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因-5.3讓处，与非治疗组相比，单独NAC (p = 0.048)或单独NB0(p = 0.030)治疗有显著差异，联合治疗(p = 0.002)有极显著差异。
[0235] 表11慢性期各组大鼠第7切片处脑损伤情况统计分析
[0236] Multiple Comparisons
[0237] VAR00002
[023引 LSD
[0239]
[0240]
[0241] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0242] 备注；
[0243] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0244] 缺血2小时再灌注7天后，在距前因-7.3讓处，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.301)或单独NB0(p = 0.112)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.022)有显著差异。
[0245] 表12急性期及慢性期各组大鼠神经行为学评分结果
[0246]
[0247] 表13急性期各组大鼠行为学评分结果统计分析
[0248] Multiple Comparisons
[0249] VAR00002 [0巧0] LSD [0251]
[ο 巧 2]
[0253] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0巧4] 备注；
[0 巧5] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0巧6] 缺血2小时再灌注48小时后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.668)或单独NB0(p = 0.370)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.034)有显著差异。
[0257] 表14慢性期各组大鼠行为学评分结果统计分析
[0258] Multiple Comparisons
[0259] VAR00002
[0260] LSD
[0261]
[0262] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0%3] 备注；
[0264] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02化]缺血2小时再灌注7天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.804)或单独NB0(p = 0.351)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.028)有显著差异。
[0266]表15急性期及慢性期各组大鼠左前肢脚步错误放置结果 「0%71
[0268] 表16急性期各组大鼠左前肢脚步错误放置结果统计分析
[0269] Multiple Comparisons
[0270] VAR00002
[0271] LSD
[0272]
[0273] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0274] 备注；
[0275] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0276] 缺血2小时再灌注48小时后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.338)或单独NB0(p = 0.129)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.009)有显著差异。
[0277] 表17慢性期各组大鼠左前肢脚步错误放置结果统计分析
[027引 Multiple Comparisons
[02 巧]VAR00002
[0280] LSD
[0281]
[0283] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0284] 备注；
[0285] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[02化]缺血2小时再灌注7天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.216)或单独NB0(p = 0.168)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.018)有显著差异。
[0287]表18急性期各组大鼠邸泄露情况 [028引
[0289]表19急性期各组大鼠邸泄露统计分析 [0巧0] Multiple Comparisons
[0291] VAR00002
[0292] LSD
[0293]
[0294] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0巧5] 备注；
[0 巧 6] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0297] 缺血2小时再灌注48小时天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.165)或单独NB0(p = 0.123)治疗无显著差异，联合治疗(p = 0.040)有显著差异 [029引表20急性期各组大鼠 PARP-1蛋白表达情况
[0299]
[0300] 表21急性期各组大鼠 PARP-1蛋白表达统计分析
[0301] Multiple Comparisons
[0302] VAR00002
[0303] LSD
[0304]
[0305]
[0306] 水，The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0307] 备注；
[030 引 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0309] 缺血2小时再灌注48小时天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.071)或单独NB0(p =0.208)治疗无显著差异，联合治疗(P = 0.006)有显著差异。
[0310] 表22急性期各组大鼠 Claudin-5蛋白表达情况
[0311]
[0312] 表23急性期各组大鼠 Claudin-5蛋白表达统计分析
[0313] Multiple Comparisons
[0314] VAR00002 [031 引 LSD
[0316]
[0317]
[0318] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0319] 备注；
[0320] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0321] 缺血2小时再灌注48小时天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.259)或单独NB0(p =0.105)治疗无显著差异，联合治疗(P = 0.001)有极显著差异。
[0322] 表24急性期各组大鼠 Occludin蛋白表达情况
[0323] Occiudii AiH-Veh 0.561 巧34 0.32殺 036 0.4358492 0.760474 0.71的沿 化说70328 Air+NAC 0.7031023 0.6635486 0.3230015 0.8948319 0.9822573 0.9507163 NBO+NAC 1.089149 0.751709 1.097186 1.055609 1.162774 1.朋 7Π3 NBO+Veh 0.7149。 0.6976265 0.7957004 0.8137658 0.8780744 0.6969199
[0324] 表25急性期各组大鼠 Occludin蛋白表达统计分析
[0325] Multiple Comparisons
[03%] VAR00002
[0327] LSD [032引
[0329]
[0330] The mean difference is significant at the 0.05 level.
[0331] 备注；
[0332] 1是Air+veh;2是Air+NAC;3是NBO+NAC;4是NBO+Veh;
[0333] 缺血2小时再灌注48小时天后，与非治疗组相比，单独NAC(p = 0.096)或单独NB0(p =0.075)治疗无显著差异，联合治疗(P = 0.000)有极显著差异。
[0334] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种药物组合物，其特征在于，由NBO与NAC组成。2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，N B 0的有效剂量范围是9 5 % 0 2~ 100%02〇3. 根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，NAC的有效剂量是60mg/kg~ 150mg/kg〇4. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备降低急性脑缺血再灌后的梗死 几率的药物中的应用。5. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备降低急性脑缺血再灌后的水肿 几率的药物中的应用。6. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备降低缺血2小时和/或再灌注7天 后动物的脑萎缩和/或脑组织损伤的药物中的应用。7. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备降低氧自由基的产生和/或 PARP-1裂解和/或PAR的积累的影响的药物中的应用。8. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备降低缺血再灌注对BBB的破坏和 紧密连接蛋白的降解的药物中的应用。9. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备治疗急性脑缺血后的神经保护 药物中的应用。10. 根据权利要求1至3任一项所述的药物组合物在制备治疗急性脑缺血后的血管保护 药物中的应用。
【文档编号】A61P39/06GK105998053SQ201610301881
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】金新春, 刘春风, 刘文兰, 刘玉珊, 孙艳芸
【申请人】苏州大学