一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法
【专利摘要】一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法。本发明公开一种抗羟自由基的检测试纸及制备方法和应用，通过条件优化得到改良后的检测试纸，与现有技术相比，该试纸可快速检测抗羟自由基，不但显色迅速，而且试纸条底色和反应后的显色层次较大，增加了检测的灵敏度，同时解决了反应物颜色结果的保存问题，具有制作简单、保质期长、现象明显、灵敏度高、检测下限较低、携带方便等优点，适于工业化生产，对于食品、水质、医疗卫生、化妆品等领域具有广泛的实用性。
【专利说明】
-种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法
技术领域
[0001] 本发明主要设及一种植物液的提取方法，具体地说，本发明设及一种新疆葡萄树 伤流液中抗氧化活性组分的提取方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄(Vitis vinifera L.)为葡萄科葡萄属(VitisL.)木质藤本植物，葡萄的果实 是一种人们喜爱并长期食用的水果，新疆得天独厚的气候生态条件造就了优良的葡萄品种 及产品。
[0003] 抗氧化是指抗氧化自由基的简称，英文Anti-Oxidant。人体因为与外界的持续接 触，包括呼吸(氧化反应）、外界污染、放射线照射等因素不断的在人体体内产生自由基。科 学研究表明，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联。研究抗氧化可W有效 克服其所带来的危害，然而，化学合成的抗氧化剂对人体具有一定的毒副作用，所W抗氧化 活性产品尤其是含有天然的抗氧化活性物质的产品是市场最重要的功能性诉求之一。
[0004] 巧断植物的嫩茎，断面流出汁液，运种现象称为伤流，流出的液体即伤流液，是伤 口的输导组织(木质部）的汁液，受根压作用使其在导管中向地上部移动而流出，此外不可 避免的还有细胞液，组织液和初皮部流出的有机物。研究表明，葡萄树伤流液中含有一定量 的抗氧化活性物质。目前，未见报道有效提取富含抗氧化活性成分葡萄树伤流液的方法，因 此，亟需一种合适的方法提取富含抗氧化活性成分的葡萄树伤流液。
【发明内容】
[0005] 针对目前国内外未见有关针对性有效性突出的提取富含抗氧化活性成分葡萄树 伤流液的方法的报道，本发明旨在于提供一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的 提取方法，本发明公开的一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法，具有 很好的可操作性，提取方法简单可靠，可快速有效地提取富含抗氧化活性成分葡萄树伤流 液，对于葡萄中有益天然活性物质的提取具有参考价值，具有广泛的实用性。
[0006] 本发明通过W下技术方案实现的：
[0007] 通过采用新疆葡萄树伤流液经HPD400大孔树脂对其纯化处理，选择抗氧化活性最 强的组分60%乙醇洗脱部分，再通过葡聚糖凝胶柱LH-20对其分离纯化，最后用70%甲醇洗 脱选择抗氧化性强的部分。运种提取方法具有很好的可操作性，提取方法简单可靠，可快速 有效地提取富含抗氧化活性成分葡萄树伤流液，对于葡萄中有益天然活性物质的提取具有 参考价值，具有广泛的实用性。
[000引本发明公开一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法，具体提取 步骤如下：
[0009] (1)大孔树脂HPD400的预处理：用无水乙醇将大孔树脂HPD400充分浸泡2地后用蒸 馈水洗至无醇味;然后用酸碱处理树脂，用5%HC1溶液浸泡6-化，再用蒸馈水洗至抑值为中 性，再用5 % NaO田容液浸泡6-化，用蒸馈水洗至抑值为中性。
[0010] (2)大孔树脂HPD400装柱:将大孔树脂柱底部的活塞关闭，在柱中加入蒸馈水，把 吸附树脂浆液均匀的转移到柱中，把所有树脂转移到柱中之后，打开底部活塞，向柱中持续 加蒸馈水冲洗，持续冲洗30min。
[0011] (3)选取采集后立即-20°C保存的新疆葡萄树伤流液，解冻后浓缩至原体积的1/ 20，然后取lOOmL浓度为20%的葡萄树伤流液液，W2mL · min-i的速度上样，吸附12h，先用 6BV的蒸馈水W2mL · mirTi洗脱，跟踪检测多糖和蛋白质等杂质除尽后，再用体积分数为 60 %的乙醇溶液5BV洗脱，收集洗脱液。
[0012] (4)将步骤(3)得到的洗脱液在50°C下旋转蒸发浓缩，经0.22WI1的滤膜过滤后上葡 聚糖凝胶LH-20层析柱，规定洗脱流速为Id · s^i，上样量为2%的柱体积，洗脱溶剂用量为 5BV，洗脱剂浓度70%洗脱，检测筛选后液体清除DPPH ·自由基的能力，先出柱的分子量大、 极性大的液体即富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液组分。
[0013] (5)葡聚糖凝胶LH-20的预处理和再生:在室溫下，将葡聚糖凝胶LH-20干粉浸泡于 60-70%甲醇中过夜并充分揽拌，洗去可能存在的残留物，用布氏漏斗抽干后再用洗脱液浸 泡;凝胶再生通常用2-3个柱体积的纯溶剂进行清洗，再将凝胶柱用选用洗脱溶剂重新平 衡。
[0014] (6)葡聚糖凝胶LH-20的装柱:凝胶溶胀后，使溶胀胶体体积占总体积的75%，上层 溶剂占总体积的25%，此时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可W移动;溶胀好的 凝胶脱气，用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中，至少 半小时打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中；采用 湿法上样，将样品完全溶于少量甲醇-水中，过0.45μπι有机滤膜，调节柱层析活塞，使洗脱溶 剂慢慢流出，当溶剂液面与柱面相切时，用一次性滴管沿管壁加入样品溶液，调节柱层析活 塞，使洗脱溶剂慢慢流出，待上样液面与柱面相切时，样品被凝胶吸附，沿管壁小屯、加入洗 脱溶剂，保持柱面平整，然后将洗脱液加至装满整个柱体。
[0015] 通过实施本发明的技术方案，可W达到W下有益效果：
[0016] 本发明公开的一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法具有很 好的可操作性，提取方法简单可靠，可快速有效地提取富含抗氧化活性成分葡萄树伤流液， 对于葡萄中有益天然活性物质的提取具有参考价值，具有广泛的实用性。
【附图说明】
[0017] 图1显示为8种不同大孔树脂静态吸附实验的静态吸附率图，图中，8种不同大孔树 脂为 ΑΒ-8、ΝΚΑ-9、LSA-21、D101、HPD826、HPD100、HPD500 和 HPD400。
[0018] 图2显示为8种不同大孔树脂静态吸附实验的ABTS+ ·自由基的清除率图，图中，8 种不同大孔树脂为D101、ΝΚΑ-9、LSA-21、HPD400、HPD826、HPD100、HPD500和 ΑΒ-8。
[0019] 图3显示为大孔树脂HPD400用不同浓度洗脱液对ABTS+ ·自由基的清除率图，图 中，不同浓度洗脱液分别采用20%、40%、60%、80%、100%浓度。
【具体实施方式】
[0020] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
[0021] 本发明中材料有:均为分析纯的无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司）、乙醇、 甲醇、无水甲酸、化0H，HC1，ABTS+·溶液，成都艾科达化学试剂有限公司，大孔树脂:AB-8、 D101、HPD400、HPD500、HPD826、LSA-21、HPD100、NKA-9，Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（北京索 莱宝科技有限公司），1，1-二苯基-2-苦阱基(DPPH，美国Sigma公司），分析型甲醇(天津市大 茂化学试剂厂），实验用水为蒸馈水;采用的水浴恒溫振荡器(S监-88,金坛市医疗仪器厂）， KQ-50B超声波清洗器(天津天光光学仪器有限公司），梅特勒电子天平-AG135(上海，梅特 勒-托利多仪器有限公司），4X50cm玻璃层析柱，RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器 厂），循环水式多用真空累(ZXZ-1型北京中兴伟业仪器有限公司），SB-1000型水浴锅(上海 爱朗仪器有限公司），微孔滤膜(20081006,上海半岛实业有限公司净化器材厂），，HWS26型 电热恒溫水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），密度计（上海麦伦仪表有限公司），2.5 X 80cm玻璃层析柱都为本领域常见的试剂及材料。
[0022] 本发明中选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实 施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明W下实施方式的实施。
[0023] 实施例一:一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法
[0024] 本发明公开一种新疆葡萄树伤流液中抗氧化活性成分的分离纯化方法，具体提取 步骤如下：
[0025] (1)大孔树脂HPD400的预处理：用无水乙醇将大孔树脂HPD400充分浸泡2地后用乙 醇洗至无醇味；然后用酸碱处理树脂，用5%HC1溶液浸泡6-化。再用蒸馈水洗至pH值为中 性，再用5 % NaO田容液浸泡6-化，用蒸馈水洗至抑值为中性。
[0026] (2)大孔树脂HPD400装柱:将大孔树脂柱底部的活塞关闭，在柱中加入蒸馈水，把 吸附树脂浆液均匀的转移到柱中，把所有树脂转移到柱中之后，打开底部活塞，向柱中持续 加蒸馈水冲洗，持续冲洗30min。
[0027] (3)选取采集后立即-20°C保存的新疆葡萄树伤流液，解冻后浓缩至原体积的1/ 20，然后取lOOmL浓度为20%的葡萄树伤流液液，W2mL · min-i的速度上样，吸附12h。先用 6BV的蒸馈水W2mL · mirTi洗脱，跟踪检测多糖和蛋白质等杂质除尽后，再用体积分数为 60 %的乙醇溶液5BV洗脱，收集洗脱液。
[00%] (4)将步骤(3)得到的溶液在50°C下旋转蒸发浓缩，经0.22皿的滤膜过滤后上葡聚 糖凝胶LH-20层析柱，规定洗脱流速为Id · ，上样量为2%的柱体积，洗脱溶剂用量为5BV， 洗脱剂浓度70%洗脱，检测筛选后液体清除DPPH ·自由基的能力，先出柱的分子量大、极性 大的液体即富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液组分。
[0029] (5)葡聚糖凝胶LH-20的预处理和再生:在室溫下，将葡聚糖凝胶LH-20干粉浸泡于 60-70%甲醇中过夜并充分揽拌，洗去可能存在的残留物，用布氏漏斗抽干后再用洗脱液浸 泡;凝胶再生通常用2-3个柱体积的纯溶剂进行清洗，再将凝胶柱用选用洗脱溶剂重新平 衡。
[0030] (6)葡聚糖凝胶LH-20的装柱:凝胶溶胀后，使溶胀胶体体积占总体积的75%，上层 溶剂占总体积的25%，此时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可W移动;溶胀好的 凝胶脱气，用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中，至少 半小时打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中；采用 湿法上样，将样品完全溶于少量甲醇-水中，过0.45μπι有机滤膜，调节柱层析活塞，使洗脱溶 剂慢慢流出，当溶剂液面与柱面相切时，用一次性滴管沿管壁加入样品溶液，调节柱层析活 塞，使洗脱溶剂慢慢流出，待上样液面与柱面相切时，样品被凝胶吸附，沿管壁小屯、加入洗 脱溶剂，保持柱面平整，然后将洗脱液加至装满整个柱体。
[0031 ]实施例二:富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法工艺优化
[0032] 1.大孔树脂的选择
[0033] 不同树脂的物理参数参见下表1:
[0034] 表1不同树脂的物理参数
[0035] _
[0036] 不同型号大孔树脂极性、粒径、比表面积等因素均会影响大孔树脂的吸附性能。一 般被吸附分子与大孔树脂的极性相同或是相近时，吸附效果好，大孔树脂的比表面积越大， 吸附量越大。
[0037] 分别准确称取已预处理过并用抽滤抽干的8种大孔树脂：AB-8、D101、册D400、 HPD500、HPD826、LSA-21、HPD100和NKA-9，各2. Og置于8个烧杯中，分别加入15血浓度为20% 葡萄树伤流液，封口，置于振荡器中室溫振荡，频率为12化-mirTi，振荡时间为12h，充分吸 附后过滤，并用ABTS+ ·溶液测定吸附前后清除率的大小，吸附后剩余滤液中抑制率越小， 说明抗氧化性物质吸附的越多。
[0038] 吸附效果W吸附率表示。
[0039] 吸附率（％ ) = [ (10-1 )/10] X 100%
[0040] 其中1〇和I分别为吸附前、后的ABTS+ ·自由基的清除率。
[0041] 8种大孔树脂的吸附率如附图1所示;8种大孔树脂的静态吸附试验中ABTS+ ·自由 基的清除率如附图2所示。
[0042] 参见附图1可知HPD400型号的大孔树脂的吸附率最高为62.58%，由附图2可知 HPD400型号的大孔树脂的ABTS+ ·自由基清除率最高为67%，所W选定HPD400型号的大孔 树脂来纯化葡萄树伤流液中抗氧化活性成分。
[0043] 2.大孔树脂HPD400洗脱液溶剂浓度的选择
[0044] 选择HPD400型大孔吸附树脂进行动态吸附试验，将处理好的树脂20g湿法装柱，然 后取100血浓度为20%的葡萄树伤流液液，W2mL · min-i的速度上样，吸附12h。先用她V的蒸 馈水W22mL -mirTi洗脱，跟踪检测多糖和蛋白质等杂质除尽后，再用体积分数为20%、 40% '60% '80%、100%的乙醇溶液各5BV洗脱，分别收集洗脱液，测定洗脱液中ABTS+ ·自 由基的清除率，清除率越大说明抗氧化活性物质的解析效果越好。由附图3可知，在乙醇浓 度60%时，ABTS+ ·自由基清除率达到最大值。因此选择洗脱液的浓度为60%的乙醇。
[0045] 3.葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400用60 %乙醇洗脱溶液上样量的选择
[0046] 将经过HPD400大孔吸附树脂富集得到的60%乙醇洗脱部分浓缩至小体积后上葡 聚糖凝胶LH-20层析柱，葡聚糖凝胶LH-20填料50g，规定洗脱流速为Id/s，50 %甲醇为洗脱 液浓度，洗脱溶剂用量为5BV(1BV = 40mL)，分别W 2 %，3 %，4 %，5 %的柱体积（即0.8mL， 1.2mL，l.6血，2.OmL)上样。将不同柱体积上样纯化后收集到的洗脱液浓缩至同等体积并测 定其DPPH ·清除率，由下表2可知，当葡聚糖凝胶LH-20的上样量为2% (0.8ml)柱体积时，新 疆葡萄树伤流液清除DPPH ·的能力最强，因此单因素试验考察选用上样量为2%(0.8ml)柱 体积。
[0047] 表2:葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400分离用60 %乙醇洗脱后溶液上样量与 DPPH ·清除能力测定结果
[004引
[0049] 4.葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400分离用60%乙醇洗脱后溶液洗脱剂浓度的选 择
[0050] 将经过HPD400大孔吸附树脂富集得到的60%乙醇洗脱部分浓缩后上葡聚糖凝胶 LH-20层析柱，规定洗脱流速为Id · ，上样量为2 %的柱体积，洗脱溶剂用量为5BV，洗脱剂 浓度分别30% ,50% ,70% ,90%的甲醇洗脱。将不同洗脱溶剂浓度纯化后收集到的洗脱液 浓缩并测定其DPPH ·清除率，由下表3可W知道，当葡聚糖凝胶LH-20的洗脱液浓度为70% 甲醇溶液时，新疆和田红葡萄树伤流液清除DPPH ·的能力最强，因此单因素试验考察选用 洗脱液浓度为70%甲醇溶液。
[0051] 表3:葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400分离用60%乙醇洗脱后溶液洗脱剂浓度与 DPPH ·清除能力测定结果
[0化2]
[0053] 5.葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400分离用60%乙醇洗脱后溶液洗脱剂用量的选 择
[0054] 将经过HPD400大孔吸附树脂富集得到的60%乙醇洗脱部分浓缩至小体积后上葡 聚糖凝胶LH-20层析柱，规定洗脱流速为Id . S-1，上样量为2%的柱体积，洗脱溶剂浓度为 70%甲醇，洗脱剂用量分别2个柱体积、3个柱体积、4个柱体积、5个柱体积。将不同洗脱溶剂 用量纯化后收集到的洗脱液浓缩并测定其DPPH .清除率，由下表4可W知道，当葡聚糖凝胶 LH-20的洗脱液用量为5倍柱体积时，新疆和田红葡萄树伤流液清除DPPH .的能力最强，因 此单因素试验考察选用洗脱液用量为5倍柱体积。
[0055]表4:葡萄树伤流液经大孔树脂HPD400分离用60%乙醇洗脱后溶液洗脱剂用量与 DPPH ·清除能力测定结果
[0化6]
[0057] 6.新疆葡萄树伤流液中抗氧化活性成分的分离纯化方法正交优化
[0058] 规定洗脱流速为Id · s^i，W上样量、洗脱溶剂浓度和洗脱剂用量为考察因素，采用 正交试验对葡聚糖凝胶柱LH-20分离经大孔树脂柱富集得到的60%乙醇洗脱部分的工艺进 行优化，W确定最佳的工艺参数。正交试验所选择的因素水平见下表5。
[0化9]表5:工艺优化正交试验因素水平表
[0060]
[0061]新疆葡萄树伤流液中抗氧化活性成分的分离纯化方法正交实验结果见下表6: [0062]表6正交实验结果与分析
[0063]
[0064]
[0065] 由表2-4可知，极差值(R)的大小顺序为C〉B〉A，因此洗脱溶剂的浓度是影响的关 键，其次是洗脱剂用量，上样量对DPPH ·清除率的影响最小。正交试验结果显示最佳纯化工 艺为A出3C3，即样品用70 %的甲醇溶液洗脱，洗脱剂用量为5BV，上样量为2 %柱体积。
[0066] 综上所述，本发明公开的一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方 法具有很好的可操作性，提取方法简单可靠，可快速有效地提取富含抗氧化活性成分葡萄 树伤流液，对于葡萄中有益天然活性物质的提取具有参考价值，具有广泛的实用性。
[0067] 如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方 式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普 通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围 内。
【主权项】
1. 一种富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液的提取方法，具体提取步骤如下： (1) 大孔树脂HPD400的预处理：用无水乙醇将大孔树脂HPD400充分浸泡24h后用蒸馏水 洗至无醇味;然后用酸碱处理树脂，用5%HC1溶液浸泡6-8h，再用蒸馏水洗至pH值为中性，再 用5%NaOH溶液浸泡6-8h，用蒸馏水洗至pH值为中性； (2) 大孔树脂HPD400装柱:将大孔树脂柱底部的活塞关闭，在柱中加入蒸馏水，把吸附 树脂浆液均匀的转移到柱中，把所有树脂转移到柱中之后，打开底部活塞，向柱中持续加蒸 馏水冲洗，持续冲洗30min; (3) 选取采集后立即-20°C保存的新疆葡萄树伤流液，解冻后浓缩至原体积的1/20,然 后取100mL浓度为20%的葡萄树伤流液液，以2mL · mirT1的速度上样，吸附12h;先用6BV的蒸 馏水以2mL · mirT1洗脱，跟踪检测多糖和蛋白质等杂质除尽后，再用体积分数为60%的乙醇 溶液5BV洗脱，收集洗脱液； (4) 将步骤(3)得到的溶液在50°C下旋转蒸发浓缩，经0.22μπι的滤膜过滤后上葡聚糖凝 胶LH-20层析柱，规定洗脱流速为Id· ?Γ1，上样量为2%的柱体积，洗脱溶剂用量为5BV，洗 脱剂浓度70%洗脱，检测筛选后液体清除DPPH ·自由基的能力，先出柱的分子量大、极性大 的液体即富含抗氧化活性成分的新疆葡萄树伤流液组分； (5) 葡聚糖凝胶LH-20的预处理和再生:在室温下，将葡聚糖凝胶LH-20干粉浸泡于60-70%甲醇中过夜并充分搅拌，洗去可能存在的残留物，用布氏漏斗抽干后再用洗脱液浸泡； 凝胶再生通常用2-3个柱体积的纯溶剂进行清洗，再将凝胶柱用选用洗脱溶剂重新平衡； (6) 葡聚糖凝胶LH-20的装柱:凝胶溶胀后，使溶胀胶体体积占总体积的75%，上层溶剂 占总体积的25%，此时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可以移动，溶胀好的凝胶 脱气，用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中，至少半小 时打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂;采用湿法上样，将样品完全溶于少量甲醇-水中，过 0.45μπι有机滤膜，调节柱层析活塞，使洗脱溶剂慢慢流出，当溶剂液面与柱面相切时，用一 次性滴管沿管壁加入样品溶液，调节柱层析活塞，使洗脱溶剂慢慢流出，待上样液面与柱面 相切时，样品被凝胶吸附，沿管壁小心加入洗脱溶剂，保持柱面平整，然后将洗脱液加至装 满整个柱体。
【文档编号】A61P39/06GK105998415SQ201610503944
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】艾尔肯·依布拉音, 古海妮萨·麦合木提
【申请人】新疆医科大学