禽类活病毒用冻干保护剂、制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种禽类活病毒用冻干保护剂、制备方法及应用，属于兽药技术领域。每1000mL冻干保护剂由以下组分组成：蔗糖40～100g，精氨酸0.5～2g，甘露醇0.5～1g，余量为0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液。本发明中禽类活病毒用冻干保护剂不含有明胶、人血白蛋白、右旋糖酐等大分子过敏原性成分，配方简单，安全性高，效果好。与禽类活病毒培养物混合均匀后冻干，于2～8℃下保存24个月后外观、真空度、水分含量、病毒滴度均无明显变化，能极大地提高兽用生物制品企业毒种的质量。并且，该冻干保护剂的制备工艺简单、操作简便，适于规模化工业生产及应用，生产成本较低。
【专利说明】
禽类活病毒用冻干保护剂、制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种禽类活病毒用冻干保护剂，同时还设及该冻干保护剂的制备方法 及应用，属于兽药技术领域。
【背景技术】
[0002] 禽类活病毒培养物(毒种)是兽用生物制品生产企业制造兽用生物制品的基础，毒 种质量的优劣直接关系到制品的质量，合格的毒种是生产高质量制品的前提和重要保证。 兽用生物制品生产企业通过建立完善的毒种种子批管理制度，实现毒种种子组成的均一 性、同一性和稳定性，W此来满足相当长时间内的生产需要。
[0003] 基础种子由原始种子经适当方式传代扩增而来，增殖到一定数量后，将相同代次 的所有培养物均匀混合成一批，定量分装，保存于超低溫冰箱中或经冷冻干燥后置适宜条 件下保存。通常情况下，应对基础种子批进行病毒含量测定及安全或毒力测试，同时进行免 疫抑制、毒力返强及免疫原性试验等。种子批应达到足够的规模，并含有足量的活病毒，因 此毒种必须保存于超低溫冰箱中或经冷冻干燥后置适宜条件下保存。但是超低溫冰箱的能 耗较高，且保存毒种的稳定性差，保存期短。
[0004] 冷冻干燥是目前用于微生物、蛋白质等生物制品保存的最常用、最有效的方法。冻 干保护剂和冷冻干燥技术是保证活病毒培养物质量的关键。冻干保护剂包括有机高分子物 质、抗氧化剂等组分，其中有机高分子物质能够保证病毒活力及抗原稳定性，遇热不会焦糖 化且耐干燥，能够与冷冻的低分子物质形成冻干活病毒耐热性结构，而抗氧化剂具有高度 抗氧化作用，能最大限度地消耗介质中的氧，减少病毒与氧的接触，降低病毒的代谢活力及 能量消耗，防止其在冷冻干燥及胆存过程中死亡。在冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免 地会造成部分微生物细胞的损伤及死亡，或者引起蛋白质变性。公布号CN102657870A的发 明专利公开了一种疫苗用冻干保护剂，包含W下组分(g/L):右旋糖酢(40)10~60,薦糖10 ~60,乳糖10~50,甘露醇5~30,甘氨酸5~20,精氨酸1~10,谷氨酸钢1~10,尿素1~10， 199综合培养基1~50,该冻干保护剂不含有明胶及人血蛋白成分，疫苗内毒素含量低，对人 体的刺激性和危害性小，但配方复杂，且不适于禽类活病毒的冻干保存。
[0005] 因此，为提高冷冻干燥后毒种的存活率、生物活性W及长时间保存的稳定性，研制 一种配方简单、安全性高、效果好的禽类活病毒培养物用冻干保护剂势在必行。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种配方简单、安全性高、效果好的禽类活病毒用冻干保护 剂。
[0007] 同时，本发明还提供一种上述冻干保护剂的制备方法及应用。
[000引为了实现W上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009]禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由W下组分组成：薦糖40~lOOg，精氨酸0.5 ~2g，甘露醇0.5~Ig，余量为O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液。
[0010] 优选的，禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由w下组分组成：薦糖lOOg，精氨酸 0.5g，甘露醇Ig，余量为0.0 lmol/L憐酸盐缓冲溶液。
[0011] 所述O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液的组成为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2册〇4 1.44邑， K出P040.24g，pH7.2~7.6。也可采用市售商品。
[0012] 禽类活病毒用冻干保护剂的制备方法，包括W下步骤:按照用量准确取薦糖、精氨 酸和甘露醇，与0.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液混匀后定容，灭菌，即可。混合时可适当加热，W 促进组分溶解。
[0013] 禽类活病毒用冻干保护剂的应用，具体为:将禽类活病毒培养物、冻干保护剂混匀 后冻干，即可。
[0014] 所述禽类活病毒培养物与冻干保护剂的体积比为1:1。
[0015] 所述冻干的操作为:预冻后于-50~-70°C、真空条件下冻干，即可。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明中禽类活病毒用冻干保护剂由薦糖、甘露醇、精氨酸和0.Olmol/L憐酸盐缓 冲溶液组成，配方简单，安全性高，效果好。其中，0.0 lmol/L憐酸盐缓冲溶液更接近于活体 生物的体液，可通过此ρ〇4\ηρ〇42?'司的转变实现r转移，从而发挥缓冲作用，并维持渗透压 平衡，尽量保证与禽类活病毒培养物原始生境的相似性，而蒸馈水不具有盐平衡作用，会破 坏生物蛋白结构并影响其活性，同时生理盐水不具有P的周节作用，不能保证活性物质在最 适条件下参与生物反应;薦糖对阻止蛋白质二级结构改变，W及冻干、胆存过程中蛋白质多 肤链的延伸和聚集发挥重要作用；而甘露醇属于多径基化合物，其径基能够替代蛋白质表 面水分子的径基，与病毒蛋白质表面的氨键形成一层假定的水化膜，保护氨键的连接位点 不直接暴露在周围环境中，从而稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻干、胆存而变性； 在冻干过程中，0.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液结晶会引起pH值变化而使蛋白质变性，精氨酸能 够抑制憐酸盐缓冲溶液结晶所致pH值改变，从而阻止蛋白质变性。
[0018] 本发明中禽类活病毒用冻干保护剂不含有明胶、人血白蛋白、右旋糖酢等大分子 过敏原性成分，制备工艺简单、操作简便，适于规模化工业生产及应用，生产成本较低。与禽 类活病毒培养物混合均匀后冻干，于2~8°C下保存24个月后外观、真空度、水分含量、病毒 滴度均无明显变化，安全、稳定、有效，能极大地提高兽用生物制品企业毒种的质量。
【具体实施方式】
[0019] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0020] 实施例1
[0021] 禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由W下组分组成:薦糖40g，精氨酸2g，甘露醇 〇.5g，余量为0.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液。0.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液的组成为:NaCl 8邑， KC1 0.2g，Na抽P〇4 1.44g，K出P〇4 0.24g，pH 7.4。
[0022] 上述冻干保护剂的制备步骤为：按照用量准确称取薦糖40g、精氨酸2g和甘露醇 0.5g，将薦糖、精氨酸、甘露醇依次加入800mL 0.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液中，加热揽拌溶解 后定容至lOOOmL，于121°C高压灭菌30min，存于4°C备用。
[0023] 上述冻干保护剂的应用，具体为:无菌条件下，将禽流感-HP株活病毒培养物（10日 龄鸡胚制备）与等量（体积比1:1)冻干保护剂混合均匀，定量分装于lOmL无菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半压塞后无菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使样品快速冻结，再在无菌条件下快 速置于已于-60°C预冷30mi η的真空冷冻干燥机中，-60°C下冷冻干燥1她;冷冻干燥完毕，压 塞加盖，贴签保存于4°C冰箱中备用。
[0024] 实施例2
[0025] 禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由W下组分组成:薦糖60g，精氨酸1.5g，甘露 醇〇.6g，余量为O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液。O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液的组成同实施例1。
[0026] 上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
[0027] 实施例3
[00%]禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由W下组分组成:薦糖80g，精氨酸Ig，甘露醇 〇.8g，余量为O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液。O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液的组成同实施例1。
[0029] 上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
[0030] 实施例4
[0031] 禽类活病毒用冻干保护剂，每lOOOmL由W下组分组成：薦糖lOOg，精氨酸0.5g，甘 露醇Ig，余量为O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液。O.Olmol/L憐酸盐缓冲溶液的组成同实施例1。
[0032] 上述冻干保护剂的制备及应用同实施例1。
[0033] 实施例5
[0034] 禽类活病毒用冻干保护剂的组成及制备同实施例4。
[0035] 上述冻干保护剂的应用，具体为:无菌条件下，将鸭肝炎病毒-SD株活病毒培养物 (4日龄维鸭制备)与等量(体积比1:1)冻干保护剂混合均匀，定量分装于lOmL无菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半压塞后无菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使样品快速冻结，再在无菌条件下快 速置于已于-60°C预冷30mi η的真空冷冻干燥机中，-60°C下冷冻干燥1她;冷冻干燥完毕，压 塞加盖，贴签保存于4°C冰箱中备用。
[0036] 实施例6
[0037] 禽类活病毒用冻干保护剂的组成及制备同实施例4。
[0038] 上述冻干保护剂的应用，具体为:无菌条件下，将小碟攝-WF株活病毒培养物（10日 龄碟胚制备）与等量（体积比1:1)冻干保护剂混合均匀，定量分装于lOmL无菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半压塞后无菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使样品快速冻结，再在无菌条件下快 速置于已于-60°C预冷30mi η的真空冷冻干燥机中，-60°C下冷冻干燥1她;冷冻干燥完毕，压 塞加盖，贴签保存于4°C冰箱中备用。
[0039] 对比例1
[0040] 冻干保护剂，每升由W下用量的组分组成：右旋糖酢(40)50g，薦糖50g，乳糖20g， 甘露醇5g，甘氨酸5g，精氨酸1.85g，谷氨酸钢9.2g，尿素4.6g，199综合培养基2g，余量为注 射用水。
[0041] 上述冻干保护剂的制备步骤为:按照用量准确取各组分，混匀后定容；用1N盐酸调 节pH值为7.4，除菌过滤后存于4°C备用。
[0042] 上述冻干保护剂的应用，操作同实施例1。
[00创对比例2
[0044] 冻干保护剂及其制备同对比例1，应用同实施例5。
[0045] 对比例3
[0046] 冻干保护剂，每升由W下用量的组分组成：人血清白蛋白lOg，薦糖40g，海藻糖 15g，右旋糖酢(70) 50g，谷氨酸钢6g，尿素3g，精氨酸Ig，甘露醇lOg，余量为PBS缓冲液。
[0047] 上述冻干保护剂的制备步骤为：按照用量准确取各组分，混匀后定容，除菌过滤， 存于4°C备用。
[004引上述冻干保护剂的应用，操作同实施例1。
[0049] 对比例4
[0050] 冻干保护剂及其制备同对比例3,应用同实施例5。
[0化1 ] 试验例
[0052]分别将实施例1~6及对比例1~4中冻干粉置于4°C条件下保存，并于保存的第6、 12、18、24个月对其外观、真空度、剩余水分、病毒滴度进行观察和检测，方法参见《中国兽药 典》(2010版)第Ξ部附录部分。测试结果见下表1。
[OOM]表1实施例1~6及对比例1~帥冻干粉在4°C下保存的稳定性试验结果
[0化4]
[ο化5]
[0056]由表1可知，实施例1~4中冻干保护剂的组分用量虽发生变化，但冻干粉在4 °C下 保存24个月后其外观、真空度、水分含量、病毒滴度均无明显变化，滴度下降均小于0.5。尤 其是实施例4中冻干粉在4°C下保存30个月后外观、真空度、水分含量、病毒滴度仍无明显变 化。
[0057]与对比例1~4中冻干粉相比，实施例中冻干粉的保存效果与之相当，或稍好于对 比例。但由于实施例中冻干保护剂的组分较少，配方简单，因此生产成本较低。
【主权项】
1. 禽类活病毒用冻干保护剂，其特征在于:每lOOOrnL由以下组分组成：蔗糖40~100g， 精氨酸〇. 5~2g，甘露醇0.5~lg，余量为0.0 lmol/L磷酸盐缓冲溶液。2. 根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于：每lOOOrnL由以下组分组成：蔗糖 l〇〇g，精氨酸〇. 5g，甘露醇lg，余量为0.0 lmol/L磷酸盐缓冲溶液。3. 根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其特征在于:所述0.Olmol/L磷酸盐缓冲溶液 的组成为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 1.44g，KH2P〇4 0.24g，pH 7.2~7.6。4. 如权利要求1~3中任一项所述冻干保护剂的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： 按照用量准确取蔗糖、精氨酸和甘露醇，与0.0 lmol/L磷酸盐缓冲溶液混匀后定容，灭菌，即 得。5. 如权利要求1~3中任一项所述冻干保护剂的应用，其特征在于:将禽类活病毒培养 物、冻干保护剂混匀后冻干，即可。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述禽类活病毒培养物与冻干保护剂的体 积比为1: 1。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于:所述冻干的操作为:预冻后于-50~-70 °C、真空条件下冻干，即可。
【文档编号】A61K9/19GK105999281SQ201610594399
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】孙永珍, 吴红云, 徐进, 李厚伟
【申请人】河南后羿生物工程股份有限公司