一种miRNA-21a抑制剂及在制备延缓心肌梗死的药物中的用图
【专利摘要】本发明属于生物医学领域,提供了一种miRNA?21a抑制剂，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了上述的miRNA?21a抑制剂在制备抑制心肌梗死早期炎症或延缓心肌梗死早期炎症病程发展的药物中的应用。本发明的miRNA?21a在心肌梗死早期表达显著增加，miRNA?21a抑制剂在体内、体外应用均能够抑制心肌梗死及相关因素造成的炎症增加，发挥心肌梗死早期抗炎作用。本发明可用于制备抑制心肌梗死早期炎症以及延缓心肌梗死病程发展的药物。
【专利说明】
-种m i RNA-21 a抑制剂及在制备延缓心肌梗死的药物中的 用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，设及一种RNA小分子的抑制剂，具体来说是一种 miRNA-2 la抑制剂及在制备延缓屯、肌梗死的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 屯、肌梗死等缺血性屯、脏病发病率高，致残率和死亡率高，是危害人类健康的主要 疾病之一。据统计，我国每年屯、肌梗死的新发生患者达50万，现患者为250万，其中1/2已经 丧失劳动能力【中国屯、血管病报告，陈伟伟等著，中国大百科全书出版社，2014年】。屯、肌缺 血后最有效的治疗方法是尽快恢复缺血区域的血流，然而事实上缺血屯、肌恢复再灌注后损 伤反而较缺血期加重，其超微结构、功能、代谢及电生理等方面发生进一步的损伤，称为屯、 肌缺血再灌注损伤，是导致缺血性屯、脏病发作患者伤残甚至死亡的重要因。研究表明，在急 性屯、肌梗死后的最终梗死面积中，大约50%是由缺血再灌注损伤造成的【Yellon，DM.等， Myocardial reperfusion in化；ry.N E；ngl J Med.2007.357(11): 1121-35.】。此外，屯、肌缺 血再灌注损伤还发生于屯、脏移植和冠脉搭桥术后。缺血预处理（ischemic preconditioning, IPC)是目前已知的最有力的屯、肌保护干预措施，但由于其需要在屯、肌缺 血发生前实施干预，所W临床应用受到了极大地限制【Cokkinos ,DV .等，Myocardial protection in man from research concept to clinical practice.Heart Fail Rev. 2007.12(3-4): 345-62.】；缺血后处理（ischemia postconditioning，IPOC)解决了预 处理存在的干预时机问题，但因需要对屯、肌和冠状动脉实施有创操作，适用范围有限 【Sadat,U.等，Cardioprotection by ischemic postconditioning during surgical prodedures.E 邱 e;rt Rev Cardiovasc Ther.2008.6(7) :999-1006.】；其他外源性保护方 法，如增加屯、肌氧和能量供应，减轻屯、脏负担，减少能量消耗等，均有不足和副作用。因此深 入研究屯、肌梗死等缺血性屯、脏病的发病机制，探索其更有效的防治方法，仍是医学科学研 究的重要任务。
[0003] 机体免疫系统对屯、血管病的发生发展起着双刃剑的作用。一方面，免疫系统可通 过防御、监视和自稳功能保护屯、血管系统，抵抗疾病；另一方面，局部免疫反应可引起屯、血 管微环境的改变，促进疾病的发生或（和）发展【〔日11196611，^.等，1^7111911〇。八63 3]1(11:110 adventitial immune response in atherosclerosis .Circ Res.2012.110(6):889- 900.】。屯、血管疾病的免疫学发病机制已引发广大科研和临床工作者的关注，屯、血管病免疫 学已迅速发展成为一口新兴的分支学科。固有免疫应答是屯、肌梗死等缺血性屯、脏病发生发 展的重要机制，主要表现为炎性细胞因子的表达显著升高，包括肿瘤坏死因子(TNF)-a，白 细胞介素（IU-化，IL-6,化-8,干扰素（IFN)-丫和细胞粘附分子-1等运些炎性细胞因子直 接参与屯、肌梗死等缺血性屯、脏病的发生发展。屯、肌梗死后屯、肌组织缺血缺氧释放内源性危 险因子如DAMPS,释放的DAMPS可W结合细胞表面相应受体，活化下游炎症信号通路，NF-KB 蛋白家族是一种多效性的转录因子，可W与多种基因启动子部位的KB位点发生特异性的结 合从而促进其转录表达，在炎症反应中发挥着重要的调控作用。TLRs是机体免疫系统识别 外界病原，激活固有免疫应答的关键受体。TLRs信号通路的发现为许多相关疾病的治疗提 供了新的祀点，TLRs通路的激活可W改变屯、血管局部的微环境，从而促进屯、血管疾病的发 生发展。如在屯、肌缺血再灌注损伤中，致病因子活性氧正是通过化R4信号通路激活核因子 (Nuclear factor,NF)-KB【Aderem,A.等，Toll-like receptors in the induction of the innate immune response . Nature .2000.406:782-87;Ha ,T.等，Tol1-1 ike receptors : new players in myocardial ischemia/reperfusion injury .Antioxid Redox Signal.2011.15(7):1875-93;Arslan,F.等.Bridging innate immunity and myocardial ischemia/reperfusion injury: the search for therapeutic 1:a;rgets .Qirr.Pharm.Des. 14,1205-1216(2008).】。
[0004] MiRNAs是一类由21~23个核巧酸构成的功能性非编码小分子，可通过结合祀基因 信使RNA来调苄基因的表达，从而发挥生物学调节功能，包括调节固有免疫应答、屯、血管疾 病的发生发展等。通过miRNAs调节疾病相关基因的表达，从而达到防治疾病的目的，是目前 研究工作的重点和热点。NF-kB信号通路介导固有免疫应答和炎症反应设及上百个基因的 表达。运一过程必须严格调控，使病原体和(或)危险分子被清除，同时避免炎症反应过度。 越来越多的证据表明：miRNAs在调控固有免疫应答和炎症反应中发挥关键作用【Sheedy， FJ.等，Adding fuel to fire:microRNAs as a new class of mediators of inf lammation. Ann liheum Dis. 2008.67suppl :ii巧〇-ii巧5.】。最近发现一些miRNAs，如 miR-1，11111?-133，11111?歴-21日日，11111?-320和11111?-199日参与屯、血管疾病的发生发展过程 【Belevych,AE.等，MicroRNA-land-133increase arrhythmogenesis in heart failure by dissociating phosphatase activity from RyR2complex.PLoS One.2011.6(12): e28324;Han,M.等，MicroRNAs in the cardiovascular system.Curr Opin Cardiol.2011.26(3):181-9;Bauersachs,J.等,miRNA-21aa:a central regulator of fibrosis not only in the broken heart. Cardiovase Res .2012.96(2):227-9; discussion 230-3.】。尤其是miRNA-21aa被报道可W参与屯、肌梗死后屯、肌细胞调亡、屯、肌 纤维化和屯、脏重构等病理变化过程。但目前为止，尚未见报道miRNA-21aa对屯、梗后早期炎 症的调控作用。
[0005] 正是基于W上研究背景，本发明研究了 miRNA-21a抑制剂在小鼠屯、梗后早期炎症 反应中的调控作用，发现miRNA-21a抑制剂能够抑制屯、梗后早期的炎症反应，从而在屯、梗早 期发挥抗炎作用，延缓屯、梗病程发展。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种miRNA-21a抑制剂及在制备 延缓屯、肌梗死的药物中的用途，所述的运种miRNA-21a抑制剂及在制备延缓屯、肌梗死的药 物中的用途要解决现有技术中的药物对于屯、梗后早期炎症的治疗和预防效果不佳的技术 问题。
[0007] 本发明提供了一种miRNA-21a抑制剂，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[000引本发明还提供了上述的一种miRNA-21a抑制剂在制备抑制屯、肌梗死早期炎症或延 缓屯、肌梗死病程发展的药物中的应用。
[0009] 本发明还提供了一种药物组合物，含有上述miRNA-21a抑制剂。
[0010] 进一步的，上述的药物组合物，还含有药学上可接受的载体或辅料。
[0011] 本发明还提供了上述的一种药物组合物在制备抑制屯、肌梗死早期炎症或延缓屯、 肌梗死病程发展的药物中的应用。
[0012] 本发明的miRNA-21a在屯、肌梗死早期屯、梗边缘区屯、肌组织中表达显著增加;此外， 本发明的miRNA-21a抑制剂能抑制屯、肌梗死早期的炎症反应，从而发挥抗炎的作用。本发明 的miRNA-21a抑制剂可用于制备抑制屯、肌梗死早期炎症W及病程发展的药物。
【附图说明】
[0013] 图1:小鼠屯、肌梗死后屯、梗边缘区屯、肌组织中miRNA-21a的表达情况(结果显示为 平均值 ±标准差，n = 3;***，P<0.001)。
[0014] 图2: miRNA-2 la抑制剂抑制屯、梗边缘区屯、肌组织中炎性细胞因子的产生（结果显 示为平均值 ±标准差，n = 3;*，P<0.05;**，P<0.01)。
[001引图3:miRNA-21a的抑制物抑制小鼠细胞中DAMPS诱导的炎性细胞因子的产生。其中 图3A为过表达miRNA-21a的抑制物抑制小鼠细胞中rmHMGBl诱导的炎性细胞因子的产生；图 3B过表达mi RNA-21 a的抑制物抑制小鼠细胞中rmHSP60诱导的炎性细胞因子的产生(结果显 示为平均值 ±标准差，n = 3;*，P<0.05;**，P<0.01)。
[0016] 实施方式
[0017] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（化W York:Cold Spring化rbor LaboratoiT Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0018] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述 的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0019]实施例1
[0020] miRNA-21a的序列为5 ' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 '，而miRNA-21a抑制物设计为 单链RM寡核巧酸，其序列设计遵循与miRM-2 la的序列反向互补原则，即为5'- UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 '。抑制物对照序列设计为5 ' -UUGUACUACACAAAAGUACUG-3 '，经 Blast检索与小鼠及人的序列没有同源或互补。miRNA-21a抑制物及对照委托广州锐博生物 科技有限公司化学合成，并进行全链2'-甲氧(2'-0-Me)修饰W提高其稳定性。
[0021] 实施例2:小鼠屯、肌梗死后屯、梗边缘区屯、肌组织中miRNA-21a的表达上调
[0022] 小鼠（C57品系，雄性，8-10周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买），按照 文献报道方法建立屯、肌梗死模型【Ta;rnavski,0.等，Mouse cardiac surgery: comprehensive techniques for the generation of mouse models of human diseases and their application for genomic studies.Physiol Genomics.2004;16;349-360】， 假手术组小鼠在建立屯、肌梗死模型时只穿线不结扎前降支。分别在屯、肌梗死后3天、5天、7 天取小鼠屯、梗边缘区屯、肌组织。
[0023] 采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法对屯、梗边缘区屯、肌组织中miRNA-21a的表 达进行了分析。组织总RNA使用TRIZO1 (Invitrogen公司）抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试 剂盒(Takara公司）并在Li曲tCycle;r(Roche公司）实时定量PCR仪上完成。
[0024] miRNA-21a RT引物为：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT CAA CT-3'。
[0025] miRNA-21a定量PCR引物为5'-CGG CTA GCT TAT CAG ACT GA-3'（上游）和5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'（下游）。
[00%] 内参照U6小核RNA的反转录反应引物为5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'（即 为定量PCR的下游引物）。
[0027] U6定量PCR引物为5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'（上游）和5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'（下游）。
[002引 miRNA的相对定量使用2-AAct法计算（U6为内参）【Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ct method.Methods.2001；25:402-408]〇
[0029] 小鼠屯、肌梗死后屯、梗边缘区屯、肌组织中miRNA-21a的表达情况如图1所示。结果显 示：小鼠屯、肌梗死后屯、梗边缘区屯、肌组织中miRNA-21a的表达显著升高，在屯、肌梗死后3天 到达最高值。
[0030] 该结果表明：在小鼠屯、肌梗死边缘区屯、肌组织中miRNA-21a是屯、肌梗死后炎症的 应答基因。
[0031] 实施例3:miRNA-21a抑制剂抑制小鼠屯、梗边缘区屯、肌组织中的炎性细胞因子的产 生
[0032] 小鼠（C57品系，雄性，8-10周龄，上海南方模式生物研究中屯、购买），如实施例1所 述制备小鼠屯、肌梗死模型，屯、梗组织局部注射携带miRNA-21a抑制剂的腺病毒载体和对照 抑制腺病毒载体(上海和元生物技术有限公司合成），分别在屯、肌梗死后3天、5天、7天取小 鼠屯、梗正常区屯、肌组织和屯、梗边缘区屯、肌组织。
[0033] 采用实时定量反转录PCR(qRT-PCR)方法对屯、梗屯、肌组织中炎性细胞因子的表达 进行了分析。组织总RNA使用TRIZO1 (Invitrogen公司）抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂 盒(Takara公司）并在Li曲tCycle;r(Roche公司）实时定量PCR仪上完成。
[0034] 化-10定量？〔3引物为5'-66了6了6了64〔61'1'(：(^41'了464(：-3'（上游）和5'- CATGGAGAATATCACTTGTTGGTTGA-3 '（下游）。
[0035] IL-6定量PCR 引物为5 ' -TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3 '（上游）和5 ' - TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3 '（下游）。
[0036] TNF-a 定量PCR 引物为 5 ' -AAGCCTGTAGCCCACGTCGTA-3 '（上游）和5 ' - GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3 '（下游）。
[0037] 内参GAPDH定量PCR 引物为5 ' -AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3 '（上游）和5 ' - TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3 '（下游）。
[003引 mRNA的相对定量使用法计算（GAPDH为内参）【Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ct method.Methods.2001；25:402-408]〇
[0039] miRNA-21a抑制剂对小鼠屯、梗屯、肌组织中的炎性细胞因子的产生情况如图2所示。 结果显示:miRNA-21a抑制剂能抑制小鼠屯、梗边缘区屯、肌组织中IL-lf3、IL-6、TNF-a的产生。
[0040] 该结果表明：miRNA-21a抑制剂可抑制小鼠屯、梗边缘区屯、肌组织中炎性细胞因子 的产生。
[0041] 实施例4:miRNA-21a的抑制剂抑制巨隧细胞中DAMPS诱导的炎性细胞因子的产生
[0042] 小鼠（C57品系，雌性，4-6周龄，上海西普尔-必凯实验动物有限公司购买)腹腔注 射肉汤(购自Sigma公司）2ml/只，两天后W无血清RPMI 1640培养基冲洗腹腔，按照文献报 道方法获得原代腹腔巨隧细胞【Hou，J.等，MicroRNA-146a feedback inhibits RIG-I- dependent Type I IFN production in macrophages by targeting TRAF6, IRAKI,and IRAK2.J Immunol.2009;183:2150-2158】。巨隧细胞（5X10日个细胞/1ml RPMI 1640培养 基)使用INTERF邸in转染试剂(Polyplus公司）转染miRNA-21a的抑制物及小RNA对照（终浓 度为lOOnM)至巨隧细胞中。转染后48小时，细胞用O.lmg/ml rmHMGBl或者rmHSP60(购自 CUSABI0公司），刺激0、4、8小时后，收集细胞培养上清利用化ISA(所用试剂盒购自R&D公司） 检测炎性细胞因子蛋白水平。
[0043] ELISA分析的结果如图3所示。结果显示:过表达miRNA-21a的抑制物可减少小鼠巨 隧细胞中rmHMGB 1和rmHSP60诱导的IL-1 β、IL-6、TNF-a的产生。
[0044] 该结果表明:miRNA-21a抑制剂可抑制巨隧细胞中DAMPS诱导的炎性细胞因子的产 生。
[0045] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种miRNA-21a抑制剂，其核苷酸序列如SEQIDN0:l所示。2. 权利要求1所述的一种miRNA-21a抑制剂在制备抑制心肌梗死早期炎症或延缓心肌 梗死病程发展的药物中的应用。3. -种药物组合物，其特征在于:含有权利要求1所述miRNA-21a抑制剂。4. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体或辅 料。5. 权利要求3所述的一种药物组合物在制备抑制心肌梗死早期炎症或延缓心肌梗死病 程发展的药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK105999302SQ201610420350
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】占贞贞, 杨琳珊, 刘中民
【申请人】上海市东方医院