一种复合医用生物蛋白胶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种复合医用生物蛋白胶的制备方法，属于生物胶制备技术领域。本发明取猪胎衣处理，干燥后与甘草混合碾磨，加入胰蛋白酶等酶解后，浓缩得浓缩液，与胰蛋白胨等混合杀菌消毒得培养基，接种枯草芽孢杆菌培养，再发酵后过滤得滤液，与山梨糖醇混合，经紫外线照射，加入氯化钙等微波反应，与无水乙醇混合过滤得滤渣，冷冻干燥制得复合医用生物蛋白胶。本发明的有益效果是：本发明制备步骤简单，所得产品降解性好，在组织内2～3个月完全吸收降解；所制得的凝胶液粘度高，与组织粘附性好，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，可有效防止细菌感染。
【专利说明】
一种复合医用生物蛋白胶的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种复合医用生物蛋白胶的制备方法，属于生物胶制备技术领域。
【背景技术】
[0002]医用粘合剂在外科上的应用日益广泛，目前在临床上应用的粘合剂都存在着一定的局限性。医用化学粘合剂具有良好的粘合性能，但由于在体内不可降解，生物相容性差，部分患者存在着不适应，应用收到限制;医用生物粘合剂具有良好的生物相容性，在体内可降解，与患者的适应性也比较好，是今后医用粘合剂开发的方向。目前在临床上应用的生物粘合剂-纤维蛋白胶已经取得了较好的效果。
[0003]纤维蛋白胶在外科中的应用日益广泛，包括组织粘附、止血、以及封堵气漏和体液泄漏等，但其在临床应用中存在着不足，它的组成成分纤维蛋白原和凝血酶都是从人类血液中提取的，用做外科粘附剂，存在着传染疾病的危险，并且粘附特性较差，应用也收到了限制。因此研究一种可用于人类的粘附能力强的生物胶是很有必要的。C-聚谷氨酸是一种由微生物大量生物合成的、具有优良生物相容性、生物降解性及无毒无污染性的氨基酸聚合物，已广泛用做药用载体材料。聚谷氨酸-明胶生物胶的粘连强度优于纤维蛋白胶。但是使用的交联剂的浓度较高，胶凝时间还比纤维蛋白胶胶凝时间稍长，对组织的粘附特性也不是十分优越。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题:针对医用生物蛋白胶降解性差，粘度低，凝胶时间长，导致其粘附性差，组织变动时易脱落的弊端，提供了一种取猪胎衣处理，干燥后与甘草混合碾磨，加入胰蛋白酶等酶解后，浓缩得浓缩液，与胰蛋白胨等混合杀菌消毒得培养基，接种枯草芽孢杆菌培养，再发酵后过滤得滤液，与山梨糖醇混合，经紫外线照射，加入氯化钙等微波反应，与无水乙醇混合过滤得滤渣，冷冻干燥制得复合医用生物蛋白胶的方法。本发明制备步骤简单，所得产品降解性好，制备的凝胶液粘度高，使用后其粘附性好，组织变动时无脱落现象发生。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是:
(1)使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在30?35KHz下振荡30?40min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥5?6h;
(2)按质量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.0?1.2 %胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量2?4倍的质量分数为5%碳酸氢铵溶液，设定温度为35?380C，酶解4?6h;
(3)在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的55?65 %，得浓缩液，按重量份数计，取45?55份浓缩液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氢钾及1.2?1.8份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基；
(4)按接种量10?15%，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为36?38°C，培养14?16h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37 °C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液；
(5)将上述所得的过滤液与其质量16?23%山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射2?3h，再分别向其中加入过滤液质量0.9?1.2%乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量30?40 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率200?300W下反应4?6h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
[0006]本发明的应用方法:将本发明制得的复合医用生物蛋白胶与无菌水按固液比1:2?3，混合形成凝胶液，用于小肠手术切口粘合，16?21天后，检测吻合口愈合良好，无渗漏，吻合部位水肿均已消退，肠壁光滑。该复合医用生物蛋白胶可在组织表面8?1s聚合固化成膜，粘接强度高，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，无细胞毒性，可有效防止细菌感染，在2?3个月完全吸收降解。
[0007]本发明与其他方法相比，有益技术效果是:
(1)本发明制备步骤简单，所得产品降解性好，在组织内2?3个月完全吸收降解；
(2)所制得的凝胶液粘度高，与组织粘附性好，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，可有效防止细菌感染。
【具体实施方式】
[0008]首先使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在30?35KHz下振荡30?40min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥5?6h;再按质量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.0?1.2%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量2?4倍的质量分数为5 %碳酸氢铵溶液，设定温度为35?38°C，酶解4?6h;接着在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的55?65 %，得浓缩液，按重量份数计，取45?55份浓缩液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氢钾及1.2?1.8份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基;再按接种量10?15%，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为36?380C，培养14?16h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37°C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液;最后将上述所得的过滤液与其质量16?23 %山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射2?3h，再分别向其中加入过滤液质量0.9?1.2%乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量30?40 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率200?300W下反应4?6h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
[0009]实例I 首先使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在30KHz下振荡30min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥5h;再按质量比1:1，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.0%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量2倍的质量分数为5%碳酸氢铵溶液，设定温度为35°C，酶解4h;接着在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的55%,得浓缩液，按重量份数计，取45份浓缩液、28份胰蛋白胨、34份酵母浸膏、10份血粉、2份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I份磷酸二氢钾及1.2份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基;再按接种量10 %，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为36°C，培养14h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37 °C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液;最后将上述所得的过滤液与其质量16 %山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射2h，再分别向其中加入过滤液质量0.9 %乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量30 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率200W下反应4h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
[0010]将本发明制得的复合医用生物蛋白胶与无菌水按固液比1:2，混合形成凝胶液，用于小肠手术切口粘合，16天后，检测吻合口愈合良好，无渗漏，吻合部位水肿均已消退，肠壁光滑。该复合医用生物蛋白胶可在组织表面8s聚合固化成膜，粘接强度高，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，无细胞毒性，可有效防止细菌感染，在2个月完全吸收降解。
[0011]实例2
首先使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在32KHz下振荡35min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥5h;再按质量比1:1，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.1%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量3倍的质量分数为5 %碳酸氢铵溶液，设定温度为37 °C，酶解5h;接着在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的60 %，得浓缩液，按重量份数计，取50份浓缩液、30份胰蛋白胨、35份酵母浸膏、12份血粉、3份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I份磷酸二氢钾及1.5份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基;再按接种量12 %，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为37°C，培养15h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37 °C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液;最后将上述所得的过滤液与其质量20 %山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射3h，再分别向其中加入过滤液质量1.0 %乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量30 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率250W下反应5h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
[0012]将本发明制得的复合医用生物蛋白胶与无菌水按固液比1:3，混合形成凝胶液，用于小肠手术切口粘合，19天后，检测吻合口愈合良好，无渗漏，吻合部位水肿均已消退，肠壁光滑。该复合医用生物蛋白胶可在组织表面9s聚合固化成膜，粘接强度高，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，无细胞毒性，可有效防止细菌感染，在3个月完全吸收降解。
[0013]实例3
首先使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在35KHz下振荡40min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥6h;再按质量比1:2，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.2%胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量4倍的质量分数为5%碳酸氢铵溶液，设定温度为38°C，酶解6h;接着在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的65%,得浓缩液，按重量份数计，取55份浓缩液、32份胰蛋白胨、36份酵母浸膏、15份血粉、4份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、2份磷酸二氢钾及1.8份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基;再按接种量15 %，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为38°C，培养16h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37 °C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液;最后将上述所得的过滤液与其质量23 %山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射3h，再分别向其中加入过滤液质量1.2 %乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量40 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率300W下反应6h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
[0014]将本发明制得的复合医用生物蛋白胶与无菌水按固液比1:2.5，混合形成凝胶液，用于小肠手术切口粘合，21天后，检测吻合口愈合良好，无渗漏，吻合部位水肿均已消退，肠壁光滑。该复合医用生物蛋白胶可在组织表面1s聚合固化成膜，粘接强度高，具有与组织相近似的韧性，组织变动时不易脱落，无细胞毒性，可有效防止细菌感染，在3个月完全吸收降解。
【主权项】
1.一种复合医用生物蛋白胶的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)使用水将猪胎衣表面血渍洗净，按固液比1:3，浸泡于pH为6.5磷酸盐缓冲液中，并置于超声振荡器中，在30?35KHz下振荡30?40min，再进行过滤，使用蒸馏水冲洗过滤后的猪胎衣，直至冲洗液呈中性，随后置于70°C烘箱中干燥5?6h; (2)按质量比1:1?2，取甘草及上述干燥后的猪胎衣放入碾磨机中进行碾磨，过200目筛，将过筛颗粒与其质量1.0?1.2 %胰蛋白酶放入酶解罐中，再加入过筛颗粒质量2?4倍的质量分数为5%碳酸氢铵溶液，设定温度为35?380C，酶解4?6h; (3)在上述酶解结束后将酶解罐中的酶解混合物移入真空浓缩罐中，浓缩至原体积的55?65 %，得浓缩液，按重量份数计，取45?55份浓缩液、28?32份胰蛋白胨、34?36份酵母浸膏、10?15份血粉、2?4份异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、I?2份磷酸二氢钾及1.2?1.8份磷酸氢二钾，搅拌均匀，并杀菌消毒，得培养基； (4)按接种量10?15%，将枯草芽孢杆菌接种至上述培养基中，并置于恒温箱中，设定温度为36?38°C，培养14?16h，待培养结束后将上述制备的培养基倒入玻璃发酵罐中，设定温度为37 °C，以120r/min搅拌发酵，待发酵罐中发酵物颜色不变时，对发酵罐内的发酵混合物进行减压过滤，收集过滤液； (5)将上述所得的过滤液与其质量16?23%山梨糖醇混合均匀，并放入紫外线下进行照射2?3h，再分别向其中加入过滤液质量0.9?1.2%乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸及过滤液质量30?40 %氯化钙，搅拌均匀，并放入微波反应器中，在功率200?300W下反应4?6h，随后再加入无水乙醇直至无沉淀产生，过滤收集滤渣，并使用无菌水冲洗直至冲洗液呈中性，将滤渣冷冻干燥，即可得复合医用生物蛋白胶。
【文档编号】A61L24/00GK105999381SQ201610508842
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月2日
【发明人】陈毅忠, 盛海丰, 宋奇
【申请人】陈毅忠