具有黏膜黏附性能的蜡菊属的提取物的组分的制作方法

文档序号:10662351阅读:306来源:国知局
具有黏膜黏附性能的蜡菊属的提取物的组分的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有黏膜黏附性能和屏障效应性能的蜡菊属的提取物的组分、包括所述组分的组合物、它们的用途以及用于制备所述组分和所述组合物的方法。
【专利说明】
具有黏膜黏附性能的蜡菊属的提取物的组分
技术领域
[0001] 本发明设及贫含活性成分具有黏膜黏附性能并具有屏障效应的蜡菊属的提取物 的组分、包括所述组分的组合物、它们的用途W及用于制备所述组分和所述组合物的方法。
【背景技术】
[0002] 蜡菊属(syn.Helyc虹isum italicum)为多年生植物,属于紫苑属,具有灌木习性, 高30-40cm,灰白色交替,线性叶,叶长20-40mm且叶宽1mm,覆盖细白绒毛,柔软卷曲。
[0003] 花序为位于茎顶端、具有金黄色管状花、由许多花顶组成的伞状花序。
[0004] 从化学角度讲,蜡菊属的活性成分主要由黄酬类代表,且用于获得特别富含活性 成分的蜡菊属提取物的方法已在文献中(诸如在同一
【申请人】的专利EP 1883415中)有所描 述。
[0005] 众所周知,蜡菊属被用于其润肤性能,如上所述,运主要是由于尤其是存在于从植 物的花顶提取出来的亲脂性部分中的黄酬类。

【发明内容】

[0006] 本发明的作者还试图开发蜡菊属的提取物的非亲脂性部分并通过分析蜡菊属的 水醇提取物的性能来发现所述提取物似乎不具有实质性的黏膜黏附性能,然而其具有一定 程度的屏障效应。运意味着,通常蜡菊属顶部的提取物不具有明确可检验的机械(黏膜黏附 和屏障)活性。
[0007] 然后本发明的作者试图了解是否可W分离具有更好的机械活性和更低药理活性 的蜡菊属的提取物的组分,W便能够利用该植物通常被丢弃的可能会具有感兴趣的活性 (主要是机械活性)的成分。
[000引因此,本发明的作者分离了蜡菊属的提取物的各种组分并挑选那些相对于起始提 取物贫含药理活性成分(黄铜类)的组分,该组分表现出强化的黏膜黏附和屏障效应的机械 性能。
[0009] 通过分析蜡菊属的水醇提取物的各个组分,惊奇地发现,一些组分呈现出强烈的 黏膜黏附效应(起始提取物中不存在的效应)。而且,发现在运些挑选出的组分中,有些呈现 出甚至比初始提取物的屏障效应高的屏障效应。
[0010] 实际上,作者所获得的并在W下详述部分报道的对比数据显示出,蜡菊属的水醇 提取物的一些组分(仅报道了与起始提取物相比挑选出的组分)的黏膜黏附率远远优于起 始提取物的黏膜黏附率(其中黏膜黏附在所采用的两个不同试验中等于零),且运些组分中 的一些组分的屏障效应大于或等于起始提取物中所测得的屏障效应。
[0011] 因此,本发明设及W黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏附活性(其表现出通 过所采用的两种不同测量方法是不可测量的)且屏障效应大于或堪比所述提取物的屏障效 应为特征的蜡菊属的提取物的组分、包括所述组分的组合物、该组分的用途和该组合物的 用途W及用于制备该组分的方法。
[0012] 因此,本发明的目的为W黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏附活性且屏障效 应大于或类似于/等于所述提取物的屏障效应为特征的蜡菊属的提取物的组分、包括所述 组分的组合物、该组分的用途和该组合物的用途W及用于制备该组分的方法。
[0013] 本发明的另一个目的为包括如本文中所描述W及权利要求中所限定的蜡菊属的 提取物的一种W上组分且不包括未提取出的蜡菊属的提取物和/或与本文中所描述的那些 组分不同的组分的组合物。
[0014] 本发明的目的还在于用于药物组合物或中药组合物的载体,该药物组合物或中药 组合物包括如本文中所描述W及权利要求中所限定的蜡菊属的提取物的一种W上组分,其 特征在于在对细胞进行的黏膜黏附试验中具有大于60%的黏膜黏附百分比。
[0015] 在运种情况下,同样地,载体不包括未提取出的蜡菊属的提取物和/或与本文中所 描述的运些组分不同的组分。
[0016] 最后,本发明的目的为用于制备具有黏膜黏附特性和屏障效应的蜡菊属的提取物 的组分的方法,其特征在于W下步骤:
[0017] a.制备蜡菊属的水醇提取物并将所述提取物进行离屯、或倾析,从而获得沉淀组分 和澄清的醇组分;
[0018] b.从在a中制备的澄清的醇组分获得浓缩的水溶性组分B,
[0019] 其中所述组分BW黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏附活性且屏障效应大于 或等于所述提取物的屏障效应为特征。
[0020] 术语
[0021] 至本发明的结尾,"蜡菊属的提取物"是指蜡菊属顶部的水醇提取物。
[0022] NMWC0 =标称截留分子量
[0023] 渗透液:通过半透性超滤或纳滤技术的提取物
[0024] 渗余物:没有通过超滤膜或纳滤膜的提取物或者被吸附在树脂上的材料。
[0025] 洗脱物:在树脂上的吸附通路之后没有吸附在树脂上的材料。
[0026] 超滤:有关W尺寸为10000道尔顿(0.01皿)至500道尔顿(约0.005皿)的孔为特征 的半透膜的过滤技术。
[0027] 纳滤:有关W尺寸为500至150道尔顿的孔为特征的半透膜的过滤技术。
[0028] 顶部或花顶:"顶部"或"花顶"是指草药和植物学论文中常用的术语,因此是指含 有叶、茎(指植物的分枝而不指植物的主茎)和花的植物的空中端。
[0029] "黏膜黏附活性"在本发明中是指化合物或物质黏附到黏膜表面的能力。
[0030] "屏障效应"(BE)是指化合物或物质在细胞表面(诸如黏膜或皮肤)产生保护膜的 能力。
[0031] "对细胞进行的黏膜黏附试验"在本说明书中是指如在详述部分和在实施例部分 描述的用于测量黏膜黏附活性的试验。
【附图说明】
[0032] 图1为描绘用于制备本发明的组分的方法的框图。
【具体实施方式】
[0033] 如W上在
【发明内容】
中所描述的,本说明书设及相对于未提取出的起始提取物具有 改善的机械特征(如黏膜黏附能力和屏障效应)的蜡菊属的提取物的组分。
[0034] 本发明的作者事实上已经检验了蜡菊属的整体(未提取出的)提取物(如,诸如蜡 菊属花顶的水醇提取物)的黏膜黏附能力和屏障效应能力,且发现在黏膜黏附测量的标准 实验(如对斜面进行的黏膜黏附试验或对细胞进行的黏膜黏附试验)中该提取物不具有可 检测的黏膜黏附能力,然而其具有诸如通过本说明书的实验部分所报道的简单试验呈现出 的和可测量的净屏障效应。
[0035] 通过用各种技术提取出蜡菊属的提取物并分析所获得的组分,本发明的作者惊奇 地分离了一些组分,运些组分呈现出比起始提取物大的黏膜黏附能力和比起始提取物的屏 障效应大或与起始提取物的屏障效应相等的屏障效应。
[0036] 在第一个实施方式中,本发明设及W黏膜黏附能力或活性优于起始提取物(即优 于从中分离出所述组分的那些提取物)的黏膜黏附能力或活性并W屏障效应大于或等于起 始提取物的屏障效应为特征的蜡菊属的提取物的组分。
[0037] 在本发明中,可W根据本领域技术人员所已知的任何方法测量黏膜黏附活性。特 别地,通过对本发明的组分进行的简单细胞黏附试验(在本文中也定义为对细胞进行的黏 膜黏附试验)可W将其测量为黏膜黏附百分比,运旨在评估检验中的产物的黏膜黏附性W 确立该产物是否具有黏附至黏膜并从而发挥保护作用的能力。
[0038] 通过评估由用本申请中所描述和要求保护的组分中的一种或两种组分对待分析 细胞进行预处理而诱导的抑制凝集素-糖蛋白结合的百分比可W诸如测量对黏膜细胞的黏 膜黏附活性。
[0039] 总之,采用W检验中的样品预处理的口腔黏膜细胞、胃黏膜细胞、肠黏膜细胞或阴 道黏膜细胞,通过评估由待分析样品诱导的抑制凝集素-糖蛋白结合的百分比测定黏膜黏 附性。首先用检验中的样品对细胞预处理可变的时间(诸如15-30分钟),随后用生物素化的 凝集素(Con-A)进行处理,随后向其中加入过氧化物酶,使其可W形成蛋白质-葡萄糖-凝集 素-生物素-链霉亲和素过氧化物酶络合物。此时,对细胞进行洗涂,且由于过氧化物酶的存 在,通过邻苯二胺的氧化反应对蛋白质-葡萄糖-凝集素-生物素-链霉亲和素过氧化物酶络 合物进行定量。
[0040] 蛋白质/葡萄糖/凝集素/生物素/链霉亲和素过氧化物酶络合物催化聚合反应:
[0041]
[0042] 溶液的黄色/澄色着色强度(用分光光度法W450nm测量)与凝集素-糖蛋白结合的 数量成正比且因此与用于黏膜黏附的可用位点(糖蛋白)的数量成正比。由此确定的吸光度 值构成"对腮'。
[0043] 在W下报道的对细胞进行的黏膜黏附试验中,在用凝集素进行处理之前,用检验 中的产品在30°C下对黏膜细胞处理约15分钟。在黏膜黏附产物的存在下,相比于如上所述 的对照,所述产物会抑制凝集素结合,W降低样品中与它们的黏膜黏附能力成正比的信号 强度。
[0044] 将产物的黏膜黏附百分比(%MA)测定为
[0045] %MA=(1-样品吸光度/对照吸光度)X 100
[0046] 在一个特定的实施方式中,如W上描述和在实施例中详细描述的那些,在对细胞 进行的黏膜黏附试验中本发明的组分的黏膜黏附百分比大于60%,或大于65%或大于 70%。
[0047] 令人感兴趣地注意到,起始提取物具有用相同的试验计算出的等于零的黏膜黏附 率。
[0048] 本文中所描述的蜡菊属的提取物的组分还呈现出大于或等于起始提取物的屏障 效应的屏障效应。
[0049] 本发明的作者事实上已经发现,基于所需的黏膜黏附能力所挑选出的运些组分中 一些组分也呈现出大于或等于起始提取物的屏障效应的屏障效应。
[0050] 可对本领域技术人员来说可用的任何方式测量化合物对黏膜或皮肤的屏障 效应。比如,如W下在实验部分详细描述的通过响应于炎性试剂或刺激性试剂的细胞标记 物释放抑制试验可W测量屏障效应。
[0051] 然而,总之,可W将用于评估蜡菊属的提取物的组分对细胞培养的屏障效应的体 外方法概括为如下步骤:
[0052] a)制备细胞培养;
[0053] b)将感兴趣的样品(诸如蜡菊属提取物的组分)放置在将其与所述培养分开的半 透膜上,随后或同时向所述样品添加当与所述培养接触时能够诱导从所述培养基释放标记 物(组胺或-葡萄糖醒酸酶或细胞因子,如IL-8、化-6、化-1、了^、了^)的物质(诸如炎性试 剂,如细菌脂多糖WS或干扰素;刺激性试剂或致敏剂,如卵白蛋白,二硝基氯苯、恶挫酬、下 香酪、青霉素 G、硫酸儀);
[0054] C)在一个W上连续时刻探测在a)和b)中制备的实验中的所述标记物的浓度并将 所获得的测量值与一个W上的参考值进行比较,其中步骤C)中的标记物不随时间增加(或 者即使可测量的标记物在较长的时间内增加)表明样品相对于对照的屏障效应,其中未将 检验中的样品放置于半透膜上。
[0055] 特别地,步骤C)可W包括:
[0056] 在一个W上连续时刻探测在a)和b)制备的实验中W及在平行对照实验中的所述 标记物的浓度,其中在步骤b)中未将蜡菊属提取物组分添加至渗透膜上,并在相同时刻对 从两组实验中获得的测量值进行比较。
[0化7] 步骤C)还可W包括:
[0058] 在一个W上连续时刻探测在a)和b)中制备的实验中的所述标记物的相对于在相 同实验中步骤b)之前所测量的所述标记物的量的浓度。
[0059] 在一个实施方式中,该方法还可W包括另外的步骤,即制备内部对照,其中用适合 于诱导标记物释放的物质对经过培养的细胞进行预处理并将蜡菊属的提取物的组分放置 在没有所述物质的半透膜上,稍后可W将所述物质添加至检验中的组分W防所述物质在所 述组分之前沉降。
[0060] 根据一个实施方式,通过响应于如LI^的试剂的IL-6抑制试验测量屏障效应(BE)。 [0061 ] BE= %细胞因子化-6的释放的减少= 100-[(pg/yL样品释放的细胞因子/pg/jiL C +释放的细胞因子)x 100]
[0062] 在一个感兴趣的实施方式中,在响应于炎性试剂或刺激性试剂(如,诸如响应于 LPS的抑制细胞因子(如IL-6和/或IL-8)释放)的细胞标记物释放抑制试验中,本发明的蜡 菊属提取物组分具有大于或等于30%,或甚至大于或等于32%等的屏障效应百分比,如,诸 如约34 %或约49 %的屏障效应百分比。
[0063] 在一个具体的实施方式中,根据本发明的蜡菊属的提取物的组分W黏膜黏附活性 优于所述起始提取物的黏膜黏附活性W及约49%的响应于炎性试剂或刺激性试剂(如,诸 如响应于LPS的细胞因子(诸如IL-6和/或IL-8)抑制释放)的细胞标记物释放抑制试验中的 屏障效应百分比为特征。
[0064] 当通过对细胞进行的黏膜黏附试验测量黏膜黏附时,上述组分的黏膜黏附百分比 包括在65和70%之间,即黏膜黏附率大于65%,诸如约68%。
[0065] 在另一个实施方式中,根据本发明的蜡菊属的提取物的组分W黏膜黏附活性优于 所述起始提取物的黏膜黏附活性且在响应于炎性试剂或刺激性试剂(如,诸如响应于LPS的 细胞因子(诸如IL-6和/或IL-8)抑制释放)的细胞标记物释放抑制试验中,屏障效应百分比 大于30% (诸如约34%)为特征。
[0066] 当通过对细胞进行的黏膜黏附试验测量黏膜黏附时,上述组分具有大于70%的黏 膜黏附百分比,诸如约74%的黏膜黏附百分比。
[0067] 在本发明的一个优选的实施方式中,从中分离出本发明的组分的蜡菊属的起始提 取物为如上所定义的蜡菊属花顶的水醇提取物,其任选地为干燥的或冻干的。
[0068] 然后任选地可W对组分进行干燥或冻干。
[0069] 本发明的目的还在于包括本发明的提取物的组分或其混合物的组合物。根据本发 明的组合物不包括蜡菊属的未提取出的提取物,如,诸如蜡菊属的未提取出的水醇提取物 和/或与本文中所描述的那些不同的蜡菊属的提取物的组分。因此来自组合物中的蜡菊属 的仅有的化合物为存在于如本文中所描述和所要求保护的组分中的那些。
[0070] 可W将如上所描述的本发明的组分、它们的混合物,或者包括该组分或混合物的 组合物用作用于药物组合物或中药组合物的黏膜黏附载体。
[0071] 因此,本发明的组分提供了对保护和/或修复黏膜和皮肤有用的,和/或还作为能 够将所需物质较长时间地保留在黏膜上的赋形剂/载体的植物源材料的新来源,其中可归 因于称为活性成分的组分的药理作用被显著降低或甚至消除。
[0072] 当将天然或植物源材料用于主要为机械型的作用(即不是用于对受体 (receptorial)、免疫路径或代谢过程的活化具有比如直接影响的药理作用)时,所述条件 是特别可取的。使用具有主要为机械作用的物质(如,诸如具有屏障或黏附效应的物质)是 可取的W比如配合药物治疗。通过使如本发明中的植物或天然源材料中存在的具有药理活 性的物质(即黄铜类)最小化,获得了具有主要为可W与药物联合使用的机械作用的材料, 从而使与药物可能的不期望的相互作用最小化,并同时对植物源物质的典型特征加 W利 用,除了常用的药理活性组分(在运种情况下其基本上被消除),植物源性物质具有大量的 具有机械作用、能够对皮肤和黏膜发挥保护作用的组分。
[0073] "保护黏膜"是指由本发明的组分或其混合物的黏膜黏附能力或屏障能力赋予的 机械保护,其可W联合与不同于蜡菊属的那些活性成分(混合有本发明的组分)有关的药理 保护。正如細带物理地保护伤口并防止其进一步恶化,从而促进其愈合,本发明的组分的屏 障效应保护皮肤和黏膜免受可导致病理和刺激w及可能减缓受损的皮肤或黏膜愈合的成 分的侵袭。在本说明书中,所述黏膜可W为口腔黏膜、胃黏膜、肠黏膜、鼻黏膜、阴道黏膜、子 宫黏膜、直肠黏膜。
[0074] 本发明的组分可W单独使用或与彼此混合并可W任选地进一步与作为其它植物 的活性成分或其它天然产物的活性成分的其它植物的提取物和/或其它来源的天然活性成 分(即不是提取自蜡菊属)进行(单独或组合)混合W增强所形成的混合物的如上所述的机 械活性。
[0075] 后续将更详细地描述含有根据本发明的提取物的组分的可能制剂。
[0076] 现提供使本领域技术人员能够分离满足上述要求的蜡菊属的提取物的组分的方 法。
[0077] 显然,从运些说明中,本领域技术人员可W开发能够获得满足上述标准的组分的 其它方法而无需额外的创造性活动。事实上,一旦知道呈现独特的黏膜黏附性能和屏障效 应性能的蜡菊属的提取物的组分确实存在,W及一旦知道能够分离它们的方法,本领域技 术人员就可W对运些方法进行修改并获得类似的组分而无需特别采用创造性活动。
[0078] 因此,应当将本文中所描述的方法理解为绝不会限制本发明的教导,而是有助于 本领域技术人员的实施示例。
[0079] 因此,本发明还设及用于制备蜡菊属的提取物的组分的方法,其特征在于W下步 骤:
[0080] a.制备蜡菊属的水醇提取物并将所述提取物进行离屯、或倾析,从而获得沉淀组分 和澄清的醇组分;
[0081 ] b.从在a中制备的澄清的醇组分获得浓缩的水溶性组分(称为组分B,)
[0082] 其中所述组分BW黏膜黏附百分比优于所述提取物的黏膜黏附百分比且屏障效应 大于或等于所述提取物的屏障效应为特征。
[0083] 特别地,所述组分BW对细胞进行的黏膜黏附试验测量的大于60% (大于65%或约 68%)的黏膜黏附百分比和响应于炎性试剂或刺激性试剂(如,诸如响应于LPS的细胞因子 (诸如IL-6和/或IL-8)抑制释放)的细胞标记物释放抑制试验中的大于45% (约49%)的屏 障效应为特征。
[0084] 根据另一个实施方式,本发明的方法还可W包括W下步骤:
[0085] C.对所述组分B进行倾析和/或离屯、和过滤,从而收集水溶性组分;
[0086] d.对在C中获得的水溶性组分进行膜超滤或纳滤并收集组分D,该组分D对应于从 所述超滤或纳滤获得的渗透液,其中所述组分D的特征在于黏膜黏附活性优于所述提取物 的黏膜黏附活性且屏障效应堪比所述提取物的屏障效应。
[0087] 特别地,所述组分DW在对细胞进行的试验中的黏膜黏附百分比大于70%且屏障 效应大于或等于30%,或大于或等于32%为特征。
[0088] 在本发明的一个实施方式中,在a中制备的水醇提取物为蜡菊属花顶的醇提取物。
[0089] 下表1中总结了通过上述方法获得的组分的性能
[0090]
[0091] 我们提醒,在本文中将物质或化合物的肥表示为由暴露于LPS的细胞所释放出的 IL-6细胞因子的减少%,其中相对于阳性对照(C+或CI)对样品进行试验(TB),其中仅将细 胞暴露于LPS。
[0092] 蜡菊属的提取物的初始组分中按异搬皮巧滴定的总黄酬的百分比等于约0.82%, 而提取物的组分B中按异搬皮巧滴定的总黄酬的百分比等于约0.3%且组分D中按异搬皮巧 滴定的总黄酬的百分比等于约0.2%。
[0093] 本文中所描述的方法可W从蜡菊属顶部(无论新鲜的还是干燥的)开始进行,或可 选地直接从液体(如,诸如水醇提取物)或干燥的蜡菊属提取物开始进行。
[0094] 诸如通过采用1:5或1:7或1:8或1:10的固体/溶剂比,可W利用水醇溶液使干燥的 提取物重新悬浮/重新溶解,从而在揽拌下将物质放置4至8小时范围内的时间。
[0095] 方法的步骤a.:
[0096] a.制备或利用蜡菊属顶部的水醇提取物并将所述提取物进行离屯、和/或倾析,获 得澄清的醇提取物;
[0097] 根据本发明,可W在步骤a.中在逐渐降低浓度的乙醇中进行至少两次、至少Ξ次 或至少四次来实施W上描述的方法,其中浓度逐渐降低的乙醇为约96%的乙醇至约0%的 乙醇。
[0098] 比如,可W通过在约96 %的乙醇中进行一次,并在约5 %的乙醇中进行一次来实施 方法的步骤a.。
[0099] 或者,可W通过在约96%的乙醇中进行一次、在约50%的乙醇中进行一次并在约 20 %的乙醇中进行一次来实施方法的步骤a.。
[0100] 或者,可W通过在约96%的乙醇中进行一次、在约50%的乙醇中进行一次和/或在 约20%的乙醇中进行一次并在约5%的乙醇中进行一次来实施方法的步骤a.。
[0101] 将按如上所描述而获得的提取物聚集W形成水醇提取物。可诸如彼此相等的 比例聚集运些提取物,如在乙醇中进行两次的情况下为50:50,或者在乙醇中进行Ξ次的情 况下为33.3: 33.3:33.3,或者在乙醇中进行四次的情况下为25: 25:25:25。显然,根据本领 域技术人员的一般知识可W将通过上述在乙醇中进行的各次步骤而获得提取物W不同的 比例聚集。
[0102] 如上所述,将在步骤a.中获得的澄清的醇提取物用于接下来的步骤b.中W制备浓 缩的水溶性组分(组分B)。
[0103] 通过乙醇蒸发对在步骤a.获得的水醇组分进行浓缩,然后对其进行倾析和/或离 屯、和/或过滤并收集产生的浓缩水溶性组分可W制备该浓缩的水溶性组分,或组分B。比如, 在倾析和/或离屯、的情况下,收集水溶性上层清液,而在过滤的情况下,收集滤液。可选地, 可W在离屯、和/或倾析和/或过滤步骤之后进行乙醇蒸发。
[0104] 可W进行诸如1至72小时的倾析,且随后可W进行转速达约3000-4000(诸如约 3500)rpm时间的一次W上的离屯、,每次离屯、在1和10分钟之间(诸如5分钟)的时间,或可W 用转速达约3000-4000(诸如约3500)rpm时间在1和10分钟之间(诸如5分钟)的一次W上离 屯、代替上述1至72小时的倾析。对于过滤,可W使用本领域技术人员已知的适当的过滤器, 如,诸如阔值为约25微米的板式过滤器。在某些情况下,可W在具有逐渐降低阔值(从200微 米减小至0.1微米)的过滤器上对提取物进行进一步的连续过滤。
[0105] 然后收集在一次或多次该步骤之后获得的上清液或滤液,并在之前没有进行的情 况下根据本领域技术人员常用的标准方案通过标准技术(如,诸如通过使用薄膜蒸发系统, 或间歇式浓缩系统)进行乙醇蒸发。
[0106] 该蒸发的结果为本文中称为组分B的浓缩的水溶性组分。
[0107] 由此获得的组分B的黏膜黏附能力优于(大于)起始提取物的黏膜黏附能力且屏障 效应大于起始提取物的屏障效应。特别地,通过对细胞进行的黏膜黏附试验测量的组分B的 黏膜黏附百分比大于60%或甚至大于65%,比如等于约68%,且通过响应于炎性试剂或刺 激性试剂的细胞标记物释放抑制试验测量的屏障效应大于45%,比如等于约49%。
[0108] 通过超滤或纳滤还可W对组分B进一步进行物质消除的其它方法。
[0109] 还可W对组分B进行时间在1和72小时之间的倾析,然后收集上清液,从而获得澄 清溶液或透明溶液。
[0110] 倾析后可W进行转速达约3000-4000(诸如约3500)rpm时间在1和10分钟之间(诸 如5分钟)的一次W上离屯、,或者倾析可W由转速达约3000-4000(诸如约3500)rpm时间在1 和10分钟之间(诸如5分钟)的一次W上离屯、代替。
[0111] 可选地,对组分B进行过滤,从而获得澄清溶液。在某些情况下,可W在具有逐渐降 低阔值(起始于200微米直至0.1微米)的过滤器上对提取物进行进一步的连续过滤。可W在 比如具有约25微米阔值的板式过滤器上进行过滤。
[0112] 在另一个实施方式中,可W按W上所描述的对组分B进行倾析,然后按W上所描述 对获得的上清液进行过滤。
[0113] 回收按W上所描述而获得的上清液或滤液并通过超滤(纳滤)或通过吸附树脂而 使药理活性芳香族物质贫集的其它步骤。
[0114] 因此,本发明的方法可W包括W下描述为d的其它步骤,即在收集所需的提取物之 前,使不需要的物质从W上所描述的步骤C.中获得的上清液或滤液中贫集,其中对所述上 清液或滤液进行一次W上的其它步骤W使活性成分贫集。
[0115] 可W通过对在C.中获得的上清液或滤液进行超滤或纳滤来实施该步骤(步骤d.)。
[0116] 对在C.中获得的上清液或滤液进行一次W上的超滤或纳滤并回收滤液作为W黏 膜黏附活性优于起始提取物的黏膜黏附活性且屏障效应优于起始提取物(即步骤a.的提取 物)的屏障效应为特征的组分D(参见W上对组分D的描述)。
[0117] 在该其它步骤中,在截留分子量(NMCW0)为500至15000道尔顿,诸如10000道尔顿、 5000道尔顿、2500道尔顿、1000道尔顿的膜上对组分B进行一次W上的超滤,或者在截留分 子量小于500道尔顿的膜上对组分B进行一次W上的纳滤。可W将由此获得的滤液(组分D) 用作对具有内服和/或外用治疗性用途的制剂有用的冻干提取物,或者可W对由此获得的 滤液(组分D)进行冻干工艺W提供对具有内服和/或外用治疗性用途的制剂有用的冻干提 取物。
[0118] 因此,根据本发明,可W在截留分子量为约500-15000道尔顿,诸如约10000道尔 顿、5000道尔顿、2500道尔顿、1000道尔顿的膜上进行所述一次W上的超滤步骤,而可W在 截留分子量小于500道尔顿的膜上进行纳滤。
[0119] 因此,本发明设及用于制备具有高黏膜黏附力的蜡菊属的提取物的组分的方法, 该方法包括W下步骤:
[0120] a.制备蜡菊属花顶的水醇提取物并将所述提取物进行离屯、和/或倾析,从而获得 沉淀组分和澄清的醇组分;
[0121] b.从在a中制备的澄清的醇组分获得浓缩的水溶性组分(称为组分B),
[0122] C.对所述组分B进行倾析和/或离屯、和过滤,从而收集水溶性组分;
[0123] d.对在C中获得的水溶性组分进行膜超滤或纳滤并收集组分D,该组分D对应于从 所述超滤或纳滤获得的渗透液,其中所述组分DW黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏 附活性且屏障效应堪比所述提取物的屏障效应为特征。
[0124] 特别地,在步骤d.中获得的组分DW当通过对细胞进行的黏膜黏附试验测量时黏 膜黏附百分比大于70%,且当通过响应于炎性试剂或刺激性试剂的细胞标记物释放抑制试 验测量时屏障效应大于或等于30%,或者大于或等于32%,诸如等于约34%为特征。
[0125] 如W上所指出的,如在本文中所描述的蜡菊属的初始提取物的黏膜黏附能力通过 对细胞进行的黏膜黏附试验是不可检测的;运意味着当将蜡菊属提取物用作在W下描述的 试验中待测试的样品时,用该样品获得的结果等于用"空白"对照或阴性对照获得的结果, 其中在凝集素处理前没有物质与细胞接触。
[0126] 因此,根据本发明的方法能够获得如W上所描述的贫含活性成分且惊人地富含具 有保护作用的物质的蜡菊属的提取物的组分。
[0127] 本发明还设及包括在保护皮肤或黏膜中有用的蜡菊属的提取物的一种W上组分 的组合物,其中所述组分基本上贫含活性成分并呈现出在起始提取物中起初很低或没有的 黏膜黏附性能和任选地屏障效应。
[0128] 该保护,当然是与组分本身或彼此混合的组分有关的保护W及与组合物有关的保 护,可W为预防性保护或者对如上所述的部分受损的皮肤或黏膜的保护。本发明的组合物 仅包括本发明的有关蜡菊属的组分。
[0129] 组合物或提取物的组分凭借它们的屏障效应和黏膜黏附效应可W促进修复需要 恢复健康和弹性皮肤或黏膜的受损的黏膜组织或皮肤组织。
[0130] 在没有与本发明的组分相关的愈合和/或抗菌活性成分的情况下,根据本发明的 皮肤病变可W为还可能设及皮肤W下的组织且不存在开放性伤口的病变。
[0131] 根据本说明书,不暗含存在开放性伤口的皮肤病变是指尽管没有受伤但皮肤浅层 和W下的层特别脆弱、发炎W及受损的的那些病变。
[0132] 运种类型的病变的非限制性示例由一级烧伤、一级稱疮病变、压力病变、新结癒的 皮疹、伤口或烧伤、过敏、红斑代表。
[0133] 与适合用于治疗具有开放性伤口的皮肤病变的活性成分相关,本发明的组分由于 它们的黏膜黏附效应和屏障效应可W作为该治疗的佐剂。
[0134] 在治疗具有开放性伤口的皮肤病变和黏膜病变中,与不同于蜡菊属的植物的合适 的活性成分联合,则本发明的组合物或组分(或其混合物)可W用于治疗或预防不暗含存在 开放性伤口的皮肤病变,或者用于预防或减缓不暗含存在开放性伤口的皮肤病变恶化。
[0135] 除了不同于蜡菊属的植物的天然来源的活性成本外,根据本发明的组合物还可W 有利地包括诸如植物源的具有润肤性能、消化性能、促胃动力性能、利胆性能、驱风性能、益 生性能、缓解性能、赋形性能、防腐性能、润湿性能的其它组分。
[0136] 当将根据本发明的组合物或一种W上组分用于保护皮肤时,其应用是局部的。用 于局部使用的组合物的实施方式在本说明书的下文中有所报道。
[0137] 可W将根据本发明的组合物制成诸如水包油乳剂、油包水乳剂、凝胶包油或油包 凝胶乳剂、多重乳剂、喷雾剂和无水制剂(发蜡、凝胶、糊剂、乳膏、软膏)且根据本发明的组 合物包括适合用于制备所需的最终形式的一种W上赋形剂。
[0138] 该赋形剂可W为诸如乳化剂(嫁蜡硬脂醇,嫁蜡硬脂基葡糖巧、氨化藍麻油)、流变 添加剂、抗氧化剂(如,诸如本领域已知的维他命、生育酪和其它抗氧化剂)。
[0139] 乳化剂可W为通过降低表面张力来降低体系的自由能的表面活性剂;可选地,也 可W采用非表面活性剂物质,如阿拉伯树胶、明胶、亲水胶体或精细粉末(诸如滑石)。在一 个实施方式中,赋形剂可包括W重量计在3和8%之间的整体浓度存在,该浓度当然是 象征性的,考虑到不管怎样,本领域技术人员知道如何使他/她打算制备的根据实施方式必 要的赋形剂的浓度适合,而无需额外的创造性活动。
[0140] 而且,组合物可W包括赋予其清香的香料(如,一种W上精油,诸如薰衣草精油、茶 树精油、巧樣、薄荷、橘子)和/或诸如使容易识别组合物的应用区域的着色剂,着色剂为暂 时性的W使其不影响组合物的其它后续应用。
[0141 ]在一个实施方式中,包括W重量计的整体浓度为0.001至3 %的所述着色剂和/或 香料。
[0142] 重量计的整体浓度"是指各种赋形剂的总和的组合物中W重量计的浓度,或者 组合物中存在各种香料和/或着色剂的总和的组合物中的W重量计的浓度。
[0143] 关于组合物在保护皮肤中的用途,本发明还设及医疗装置,诸如药用胶布、药用纱 布、药物細带、药用毛巾、药垫、药用尿布,即W最适当的方式包括本发明的所述组合物或至 少部分地被本发明的所述组合物覆盖或至少部分地浸透有本发明的所述组合物的胶布、纱 布、細带、毛巾、衬垫或尿布。
[0144] 采用W诸如软膏、糊剂或乳膏形式制备的组合物,可W将纱布制成含脂纱布,細带 和胶布同样如此。毛巾可W浸透有具有水或凝胶的油乳剂形式的组合物,并且通过将组合 物插入本领域中已知的用于插入保护性组合物或抗刺激性组合物的相关层中可W制备尿 布或吸收垫。
[0145] 该产品(如,诸如婴儿尿布、女性使用的吸收垫(通常称为"卫生护垫")和成人失禁 垫)通常用于诸如婴儿-、女性-和老年病学-相关领域,且无需特殊教导而仅基于本领域常 规技术,本领域技术人员就知道将本文中所描述的组合物插入什么地方W及哪个实施方式 是最适合的。
[0146] 该装置可用于待处理和/或待保护的部分W起到预防目的。
[0147] 如上所述,本发明的组合物可W为用于局部应用的组合物,根据本领域通常所用 的技术,该局部应用可水包油乳剂、油包水乳剂、多重乳剂、喷雾剂和无水制剂(发蜡、 软膏、凝胶、糊剂、乳膏、喷雾剂)的形式来实现。在本文中表示为"喷雾剂"的制剂可W为无 水制剂或甚至为乳液制剂、具有还能够在难W到达的区域(如,诸如后背)自己应用的、在采 用制剂诸如W减轻各种太阳皮疹、红斑或皮肤过敏的所有那些情况中有用的喷雾器形式。
[0148] 根据另一个实施方式,由于它们的黏膜黏附效应和屏障效应,可W使用本发明的 一种W上组分或本发明的组合物W用于保护黏膜。
[0149] 在运种情况下,同样地,诸如在面临给药具有攻击黏膜的副作用的药物的所有那 些情况下,或者在表现出该粘膜的复发性过敏的病变的那些患者中,所述保护可W为预防 性保护。在其它情况下,该保护反而可W为用于治疗目的或者为了避免发炎的或局部受损 的黏膜恶化的保护。
[0150] 在运些情况下,针对局部给药是可能的所有运些黏膜(诸如,口服(口腔)黏膜、直 肠黏膜、阴道黏膜、鼻腔粘膜),给药组合物的一种W上的组分B或C可W为局部给药,或者在 所述黏膜为诸如肠黏膜或胃黏膜的情况下,给药组合物的一种W上组分B或C可W为口服给 药。
[0151] 因此,可胶囊、片剂、锭剂、颗粒剂、粉剂、糖浆、馳剂、硬明胶、软明胶、混悬剂、 乳剂、溶液、栓剂、乳膏、凝胶剂、喷雾剂、软膏、发蜡、糊剂、水包油乳剂、油包水乳剂、凝胶包 油乳剂或油包凝胶乳剂形式制备用于保护黏膜的组合物。
[0152] 在用于局部使用的制剂的情况下,可W按照有关用于保护皮肤的组合物的W上说 明,或者可W制备糖浆、漱口液、喷雾剂例如用于保护口、喉魄、鼻子的黏膜。
[0153] 对于用于直肠黏膜,可W采用具有本领域技术人员已知的用于制备该组合物的赋 形剂的栓剂或灌肠剂或微灌肠剂。
[0154] 如上所述,本发明的组合物可W为胶囊、片剂、锭剂、硬明胶、软明胶、颗粒剂、粉 剂、糖浆、馳剂、混悬剂、乳剂形式。对于口服给药,可每日单位剂量的形式或者部分每 日单位剂量的形式(诸如按照主治医生的意见,在一天内可W服用2、3、4、5、6或更多胶囊、 片剂、锭剂、单次剂量的颗粒剂或粉剂、或明胶)制备组合物,且组合物可W含有常规的赋形 剂,赋形剂包含诸如粘合剂(如阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄著胶,和/或聚乙締化咯烧酬); 填充剂(如乳糖、糖、玉米淀粉、大米淀粉、憐酸巧、山梨醇和/或甘氨酸);制片润滑剂(如硬 脂酸儀、滑石、聚乙二醇和/或二氧化娃);崩解剂(如马铃馨淀粉);和润湿剂(如十二烷基硫 酸钢)。可W按照标准医药实践中公知的方法对片剂进行包衣。
[0155] 还可W将组合物制备成液体或半液体形式,如用于口服给药的悬浮液、乳液、溶 液,且组合物可W任选地含有赋予其怡人味道的天然芳香剂。
[0156] 通过原样摄取或重悬在合适的液体(如水、茶等)中,可W在合适的容器中对粉末 或颗粒剂形式的组合物进行预先计量并备用。在运种情况下,同样地,组合物可W含有赋予 其怡人味道的天然芳香剂。
[0157] 显然,所有上述赋形剂可药学上可接受的级别来使用。
[0158] 在一个实施方式中,如本文中任一上述实施方式中所描述的组合物可W为药物组 合物的形式,即包括药用级原料,或者可w将其或将其引入专用食品(医疗食品)或引入医 疗设备。
[0159] 可W将根据本说明书的组合物制成药物组合物的形式或根据指南93/42/EEC中关 于医疗设备所描述的任一分类中的医疗设备的形式(还包括物质而不仅是机械意义的术语 中的"设备"),或医疗食品、食物补充剂的形式,或根据生产该组合物的国家的监管规定的 任何形式。
[0160] 医疗设备或医疗食品还可W含有作为原料的其它组分,该其它组分包括诸如旨在 补充饮食的维他命、矿物质盐和其它物质的组合。
[0161] 在保护皮肤或黏膜是必要的或可取的所有运些情况下,运些情况可W是有必要给 药攻击黏膜或皮肤的药物,从而为了防止或限制该药物的破坏作用的情况;或在保护部分 受损的皮肤或黏膜是更好的或可取的W能够更好更快对其进行治疗,防止其受到进一步侵 袭的运些情况下;或在个体具有皮肤或黏膜持续过敏或改变的慢性疾病,因而屏障效应可 W防止或限制对皮肤或黏膜的损害的运些情况下,本发明的一种W上组分或本发明的组合 物由于它们的屏障效应性能和它们的黏膜黏附性能(如果存在)因而是有用的。
[0162] 本发明还设及用于治疗或用于预防不设及存在开放性伤口的皮肤病变的发作或 恶化的方法,或用于治疗开放性伤口的方法,其中该方法包括每天一次W上对有关部分一 次W上应用本发明的组合物或包括本发明的组合物的医疗设备。
[0163] 无论何时需要(诸如在预防失禁相关的皮疹的情况下,在每次换垫时),比如可W 重复应用组合物,或者通常每天一次、两次、Ξ次、四次或更多次应用组合物。
[0164] 本发明还设及根据任一上述实施方式的用于制备组合物的方法,其中将贫含活性 成分并富含给予如本文中所描述的黏膜黏附性能和屏障效应性能的成分(组分B、组分D)或 其混合物的蜡菊属的提取物的组分与赋形剂和/或具有如上所述的润肤性能、消化性能、促 胃动力性能、利胆性能、驱风性能、益生性能、缓解性能、赋形性能、防腐性能、润湿性能的天 然物质和/或不同于蜡菊属的植物的植物源物质中的至少一种进行混合。
[0165] 在运些当中,诸如可W使用W下一种或多种:龙胆根提取物、波耳多叶提取物、水 飞劑果实提取物、洋劑叶提取物、蒲公英根提取物、大茵香果提取物、迷迭香叶提取物、薄荷 叶提取物、马郁兰叶提取物、小茵香果提取物、完姜果提取物、姜根提取物、茵香果提取物、 香菜果提取物、甘菊花提取物、蜀葵根提取物、亚麻巧提取物、大麦粒提取物、木炭、菊粉。
[0166] 本发明的目的还为用于防护性(预防性或治疗性)治疗皮肤或黏膜的方法,条件是 向需要其的患者给药一种W上本发明的组分或本发明的组合物。该给药还可W同时伴随给 药其它药物。
[0167] 本发明的组分中或组合物中的药理活性成分的减少和黏膜黏附性能W及屏障性 能的增加使该产物特别适合于与其它药物同时给药,因为本发明的提取物或组合物与共同 给药或同时给药的药物之间的相互作用的副作用是明显不可能的。
[0168] 治疗和/或预防皮肤或黏膜的方法的非限制性示例可W包括根据主治医生的意 见,在一周和六周之间的一段时间内,诸如在Ξ周和六周之间的一段时间内,甚至在大于六 周的一段时间内,给药细分成单次剂量或多次剂量的日剂量的根据本说明书的混合物或组 合物。
[0169] 该给药可W先于给药药物之前很长时间进行,W优化待治疗的皮肤或黏膜的健康 状况。
[0170] 主治医生同时在患者的健康状况、体重、性别和年龄的基础上将知晓如何建立最 适合的剂量和给药时间。
[0171] 皮肤的结构和黏膜的结构之间的本质区别之一由黏膜中缺少选择性屏障(如角质 层)代表。口服粘膜与环境中存在的有毒物质或刺激性物质(污染物、病原微生物等)接触, 因此可W引起所述物质在黏膜内部和在相关的气道(支气管、肺等)中的高渗透,从而造成 炎性病症和/或过敏性病症。
[0172] 通过黏膜黏附试验和屏障效应试验评估本发明的提取物的组分的保护作用。
[0173] 前者旨在评估检验中的产物的黏膜黏附性W确立该产物是否具有黏附至黏膜的 能力并因此发挥保护作用。
[0174] 用本发明的组分进行的细胞黏附试验旨在评估检验中的产物的黏膜黏附性W确 立该产物是否具有黏附至黏膜的能力并因此发挥保护作用。
[0175] 通过评估抑制凝集素/糖蛋白结合的百分比来评价本发明的提取物对黏膜细胞的 黏膜黏附能力
[0176] 通过评估抑制凝集素/糖蛋白结合的百分比确定黏膜黏附性。在运种模型中,可W 使用比如口腔细胞、胃细胞、肠细胞或阴道细胞。首先用对膜糖蛋白类中存在的葡萄糖和甘 露糖巧残基具有高亲和力的生物素化的凝集素(Con-A)对细胞进行处理。因此黏膜的糖蛋 白类的位点会被生物素化的凝集素占据。凝集素中存在的生物素(维他命H)对下一阶段来 说是不可缺少的。用链霉亲和素过氧化物酶填充已经用生物素化的凝集素处理过的细胞, 从而由于生物素和链霉亲和素之间的高亲和力使得形成蛋白质-葡萄糖-凝集素-生物素- 链霉亲和素过氧化物酶络合物成为可能。此时,对细胞进行洗涂,且由于存在过氧化物酶, 通过邻苯二胺的氧化反应对蛋白质-葡萄糖-凝集素-生物素-链霉亲和素过氧化物酶络合 物进行量化。
[0177] 蛋白质/葡萄糖/凝集素/生物素/链霉亲和素过氧化物酶络合物催化聚合反应:
[017 引
[0179] 溶液的黄色/澄色着色强度(用分光光度法W450皿测量)与凝集素/糖蛋白结合的 数量成正比且因此与用于黏膜黏附的可用位点(糖蛋白)的数量成正比。由此确定的吸光度 值构成"对腮'。
[0180] 在W下报道的黏膜黏附试验中,在用凝集素进行处理之前,用检验中的产物在30 °(:下对胃肠道细胞处理约15分钟。在黏膜黏附产物的存在下,相比于如上所述的对照,所述 产物会抑制凝集素结合,W与它们的黏膜黏附能力成正比地降低样品的信号强度。
[0181] 将产物的黏膜黏附百分比(%MA)测定为
[0182] %MA=(1-样品吸光度/对照吸光度)X100 [018引屏障效应试验
[0184] 屏障效应试验为用于评估成品和/或原料通过形成薄的"隔离"层保护黏膜和皮肤 免于与环境污染物(灰尘、花粉、微生物等)接触的能力的生物型体外试验。
[0185] 开发该试验W体外模拟施用在皮肤和/或黏膜上旨在创建抵抗外侵物的保护膜的 产物所发挥的作用。
[0186] 该模型利用了与炎性试剂接触的细胞在细胞外环境中产生并分泌与所引起的炎 症程度相关的量的促炎性因调节因子(细胞因子)的运一原理,在一定范围内,暴露于炎性 试剂的浓度和时间与所释放的细胞因子的量之间存在正比。
[0187] 所采用的实验模型提供了由半透膜(0.4皿的孔)物理性分隔开的两个腔室。将细 胞接种于下腔室中,而上腔室容纳炎性试剂;在分隔出两个腔室的半透膜上,分析中的样品 的薄膜是分层的W突出对炎性试剂自由通过的屏障效应(如果存在)。
[0188] 半透膜允许炎性试剂通过到下腔室中并构成支撑,在该支撑上待试验的样品是分 层的。根据样品的"隔离"能力,会获得LPS从上腔室迁移到下腔室的下降(因此细胞对细胞 因子产生的较小刺激)。
[0189] 实施例
[0190] 实施例1
[0191] 制备组分B和组分D
[0192] 在浓度逐渐降低的乙醇中,从蜡菊属顶部进行两次提取,在96%的乙醇中进行一 次,并在5 %的乙醇中进行一次。
[0193] W50:50的比例将上述获得的醇提取物聚集并在等于3500rpm的转速下对上述获 得的醇提取物离屯、1-5分钟的时间;获得沉淀物和构成澄清的醇组分的上清液。根据标准方 案采用薄膜蒸发系统通过乙醇蒸发对澄清的醇组分进行浓缩,条件是W约5001A的速率进 料待浓缩的提取物,操作是通过设置剩余真空为0.6-0.8己并将加热蒸发壁的液体设置在 140°C,从而在去除乙醇后获得浓缩的水溶性组分(组分B)和沉淀物。组分B具有当通过对细 胞进行的黏膜黏附试验测量时值等于68%的高黏膜黏附力和通过本文中所描绘的试验测 量的等于约49%的屏障效应。
[0194] 在阔值为25微米的板式过滤器上对组分B进行过滤。
[01M]在截留分子量为2500道尔顿的膜上对由此获得的滤液进行超滤/纳滤的步骤,和/
[0196] 由此获得的超滤/纳滤的滤液(组分D)具有当通过对细胞进行的黏膜黏附试验测 量时值等于74%的高黏膜黏附力和通过本文中所描绘的试验测量的等于起始提取物的屏 障效应的屏障效应。
[0197] 实施例2
[0刪测量组分中总黄铜
[0199] 测定表示为异搬皮巧的总黄酬。
[0200] 样品提取:
[0201] 在100ml的烧瓶中精确称量0.30g样品。加入1ml六亚甲基四胺(5g/l)、50ml丙酬和 2ml经稀释的HCL( 100ml水中70g),将它们在回流下加热30分钟。对第一次提取的残余物重 复进行另外两次相同的提取,并将Ξ次提取物聚集在100ml容量瓶中。
[0202] 在分液漏斗中获得20ml由此获得的溶液,添加20ml超纯水,随后进行萃取,第一次 用15ml的乙酸乙醋,另外Ξ次用10ml的乙酸乙醋。在每一次萃取后,对相进行分离并将有机 相回收在100ml的锥形烧瓶中。将经聚集的有机提取物引入第二分液漏斗中。用(各50ml)超 纯水作为连续部分进行另外两次萃取。
[0203] 在每次萃取后对相进行分离,并用棉花和用无水硫酸钢进行过滤,将萃取物倒入 50ml烧瓶中,然后用乙酸乙醋使其达到体积。
[0204] 试验溶液:将10ml如上所述获得的溶液放入25ml容量瓶中。然后加入1ml氯化侣的 甲醇中的乙酸溶液(在5 %体积/体积的甲醇中2 %A1C13的乙酸溶液),并用5 % (体积/体积) 甲醇中的乙酸溶液达到体积。
[0205] 参比溶液:将10ml的该溶液放入第二25ml容量瓶中,并用没有添加 A1C13的5 %体 积/体积甲醇中的乙酸溶液使整体达到体积。
[0206] 分光光度读数:
[0207] 在与A1C13反应30分钟后,利用参比溶液作为空白,在425nm处测量试验溶液的吸 光度。
[020引 计算;
[0209]根据异搬皮巧的摩尔消光系数用下式计算总黄酬的百分含量: 脚 0] % = (A*1.25)/p
[0211] 其中A =在425nm处在试验溶液中测量的吸光度
[0212] P =用克表达的样品重量。
[0213] 实施例3
[0214] 通过评估抑制凝集素/糖蛋白结合的百分比来评价本发明的组分B和组分D对黏膜 细胞的黏膜黏附能力
[0215] 通过评估肠黏膜细胞上的凝集素/糖蛋白结合的抑制百分比来确定黏膜黏附性。
[0216] 制备2ml含有一百万个肠黏膜细胞化Τ-29ΑΤ0:?[ΤΒ-38?)的细胞悬浮液,然后用 5ml如本文中所述的组分Β和组分D对其进行预处理,将具有未经预处理的细胞的类似样品 用作对照。在30°C下在缓慢揽拌下在恒溫浴中对细胞培养15分钟。然后,在2000rpm下对它 们离屯、5分钟,丢掉上清夜,并用了85(;径甲基氨基甲烧缓冲盐水)缓冲液对它们洗涂S次。
[0217] 然后在30°C下在缓慢揽拌下用5ml生物素化的凝集素(Con-A)10mg/1对细胞(样品 和对照)处理30分钟。然后在2000巧m下对它们离屯、5分钟,丢掉上清夜,并用TBS(^径甲基 氨基甲烧缓冲盐水)缓冲液对它们洗涂Ξ次。在30°C下在缓慢揽拌下用链霉亲和素过氧化 物酶(5ml链霉亲和素过氧化物酶,5mg/L)填充已经用生物素化的凝集素处理过的细胞。然 后在2000巧m下对它们离屯、5分钟,丢掉上清夜,并用TBS(S径甲基氨基甲烧缓冲盐水)缓冲 液对它们洗涂Ξ次。
[0218] 向每个样品(每个样品250000个细胞)中加入2.5ml的0.05M憐酸料蒙酸盐和出〇2中 的邻苯二胺(o-pd),至最终的浓度等于0.04%。2分钟后,用1N此S化停止反应。随后由于存 在过氧化物酶,通过邻苯二胺的氧化反应通过分光光度读数(λ = 450ηπι)对蛋白质-葡萄糖- 凝集素-生物素-链霉亲和素过氧化物酶络合物进行定量。
[0219] 蛋白质/葡萄糖/凝集素/生物素/链霉亲和素过氧化物酶络合物催化聚合反应:
[0220]
[0221]溶液的黄色/澄色着色强度与凝集素/糖蛋白结合的数量成正比且因此与用于黏 膜黏附的可用位点(糖蛋白)的数量成正比。由此确定的吸光度值构成"对照"。如上所述,在 黏膜黏附产物的存在下,存在抑制凝集素结合至黏膜细胞,相比于如上所述的对照,其导致 与所分析的样品的黏膜黏附能力成正比地样品信号强度的降低。将黏膜黏附能力表示为抑 制凝集素/糖蛋白结合的百分比,或者更好地表示为根据下式的产物的黏膜黏附百分比: 惦剖 %MA=(1-样品吸光度/对照吸光度)X 100 [0223]实施例4 帷4] 对组分B和组分D中的每个^及对照提取物进行屏障效应试验
[0225] 对于屏障效应试验,采用由半透膜(0.4皿的孔)物理地分隔开的两个腔室。将人类 成纤维细胞接种于下腔室中,而将炎性试剂LPS(纯化的大肠杆菌脂多糖)引入上腔室;在分 隔出两个腔室的半透膜上,如本发明中所描述的提取物的组分的薄膜是分层的。
[0226] 通过对释放到下腔室的培养基中的白细胞介素6(IL6)细胞因子进行半定量剂量 化来评估诱导的炎症反应:通过与两个腔室由相同类型的半透膜分隔开然而没有任何屏障 的阳性对照进行比较获得屏障效应评估。
[0227] 物质的分层膜所发挥的屏障效应越大,则在其下的腔室中所存在的细胞中观察到 的炎性作用反应越少,因为其上的腔室中的炎性试剂会更难W闯穿过半透膜。
[0228] 至于阔值(高于该阔值,可W说物质引起本文中所报道的试验中的屏障效应),基 于对已知具有屏障效应的物质进行的试验,在试验的设立期间,本发明人确定了相比于对 照等于15%的抑制值。
[0229] 然后评估如本文中所描述的提取物的组分的屏障效应。
[0230] W下所报道的数据显示了相比于对照提取物,根据本说明书的提取物的组分具有 怎样显著的屏障效应。
[0231] 如下通过所开发的用于体外模拟物质或制剂(当体内应用于皮肤或黏膜时,该物 质或制剂形成抵抗环境因素的"隔离"膜)的保护作用的方法来进行评估试验。
[0232] 该模型利用了与炎性试剂接触的细胞在细胞外环境中产生和分泌与所引起的炎 症程度相关的量的促炎性调节因子(细胞因子)运一原理到达细胞的炎性试剂的量越大,贝U 释放出的细胞因子的量越大。
[0233] 该模型设想布置由允许尺寸足够小的溶质通过的半透膜物理地分隔开的两个腔 室。
[0234] HuDe细胞(编号为BS PRC 41,购自意大利Istituto Zooprofilattico di Brescia)生长于由含有用于细胞培养的板的孔组成的下腔室中,而由用于复杂细胞培养的 插入物(侵袭小室)组成的上腔室容纳炎性试剂。
[0235] 在将炎性试剂引入上腔室之前,在分隔出两个腔室的插入物的半透膜的表面上, 被检测的样品的薄膜是分层的W对自由通过的炎性试剂评估任何BE。
[0236] 作为样品的隔离能力的函数,具有炎性试剂从上腔室迁移的减少,并且由此细胞 的较少刺激产生细胞因子。通过对下腔室的培养基中所释放的细胞因子(特别是白细胞介 素6,IL-6)进行半定量剂量化来评估炎症反应的程度。
[0237] 作为对照,采用没有样品在膜上分层的相似实验,由此使得在除了半透膜外无需 任何屏障的情况下测量炎性试剂的效应成为可能。
[0238] 此外,采用内部对照,在内部对照总用适合诱导标记物释放的物质对经过培养的 细胞进行预处理并将样品放置在不存在所述物质的半透膜上,适时对所述内部对照的培养 基中的标记物的量进行一次W上测量。因此,在该内部对照中,首先用诱导物质刺激细胞, 然后有必要评估可w通过膜并通过上述培养基推动进入细胞的样品对与屏障效应不相关 的标记物释放的减少是否有任何影响。比如,当将炎性试剂用作诱导物质时,内部对照使理 解培养基中的细胞因子的浓度的降低是否是由于屏障效应或者由上述培养基推动可W进 入细胞的样品是否具有任何独立于屏障效应的降低炎症应答的效应成为可能。
[0239] 将屏障效应(BE)表示为IL-6的释放的减少的百分比并通过与阳性对照(其中两个 腔室被相同类型的半透膜分隔开而没有样品创建的屏障)进行比较来计算屏障效应(BE)。
[0240] 4.1制备细胞培养:
[0241] 对于各个试验的样品,W40000个细胞/1毫升补充有10%牛血清(FBS)的MEM培养 基的浓度将化De细胞株接种于细胞培养板的孔中,一个用于屏障试验(BA)且另一个用于内 部对照;每孔1ml的细胞悬浮液。
[0242] 用样品(CAM)、用阳性对照(C+K不含样品的炎性试剂)、W及用阴性对照(C-)(仅 有培养基)对细胞进行处理且每个试验进行Ξ次。
[0243] 在37 °C下对板进行过夜培养(22-24小时)。
[0244] 4.2制备用于复杂细胞培养的插入物
[0245] 将用于复杂细胞培养的细胞培养插入物放置在其它板上,并在它们中的每个板上 提供固定量的0.1 mg/ml胶原。在37°C下对板进行过夜培养(22-24小时)。 隣]4.3确认细胞融合度的状态和水平
[0247]为了进行实验,要求细胞融合度不低于95%。
[024引 4.4胶原层干燥
[0249]从具有插入物的两个板(BA和1C)中除去胶原,并将插入物留在通风楓的气流下所 需的时间W使它们完全干燥(10 ^ 15分钟)。
[0巧0] 4.5屏障试验(BA)
[0251 ]在用于BA的培养板中进行下述步骤。
[0况]设立在BA中样品层
[0253] 将10化1基于本发明中所描述的提取物的各个组分(2%)(对各个组分进行试验) 的组合物接种在样品的半透膜上并使其分层20分钟,而在C+和C-中不添加任何物质。20分 钟过后,去除过量的样品并根据方案所规定的程序用PBS对膜进行洗涂。
[0254] 添加 LPS(致炎因子)至BA插入物
[02W]当样品层干燥时,将30化1的LPS(膜脂多糖)溶液Wlμg/ml的浓度接种在前Ξ个 CAM插入物和Ξ个C+插入物中,而在剩余的Ξ个C-中添加 30化1具有5 % FBS的MEM培养基。将 插入物插入它们各自的具有细胞的孔中,在37°C下对板培养1小时并在富含5%C02的气氛 中过夜培养(22-24小时)。
[0256]当完成1小时的培养时,将插入物移除并丢弃并对板再次进行过夜培养(22-24小 时)。
[0巧7] 4.6内部对照(1C)试验:
[0258]内部对照试验与BA同时进行。
[0巧9] 将1C细胞暴露于LPS:
[0260] 一旦干燥,将30化1的LPS溶液接种在1C的前6个插入物(Ξ个用于待分析的样品, CAM,S个用于C+)中,而在剩余的Ξ个C-中添加30化1培养基。
[0261 ]然后将具有LPS和MEM的插入物插入具有IC细胞的孔中并全部培养1小时。
[026。LPS移除和1C膜干燥:
[0263] 当完成1小时的培养时,将插入物从具有细胞的孔中移除并转移至空板中,而将具 有细胞的板放置在培养箱中。
[0264] 将仍然存在的LPS溶液从插入物中移除,用超纯无菌水对插入物进行快速洗涂并 使其干燥。
[0265] 布置1C中的样品层:
[0266] 将10化1基于根据本发明的提取物的各个组分(2%)的组合物接种在用于样品的 Ξ个插入物的半透膜上并使其分层20分钟,而在C+和C-插入物中不添加任何物质,20分钟 过后,去除过量的样品并根据方案所规定的程序用PBS对膜进行洗涂。
[0267] 添加 LPS至1C插入物
[0268] 当准备好具有样品的插入物时,将30化1培养基添加至所有插入物(CAM、C+、C-) 中。将插入物插入它们具有细胞的各自的孔中并在37Γ下对板培养1小时。
[0269] 当完成1小时的培养时,将插入物移除并丢弃并对板再次进行过夜培养(22-24小 时)。 脚〇] 4.7上清液收集与酶免疫分析法
[0271] 22-24小时过后,从用于进行化ISA试验的BA板和1C板收集上清液,并对IL-6进行 半定量剂量化。 陶]屏障效应(BE)评估
[0273] 将物质或化合物的肥表示为由暴露于LPS的细胞释放的%IL-6细胞因子的减少, 其中相对于阳性对照(C+)对样品进行试验,在阳性对照中仅将细胞暴露于LPS。
[0274] BE=比-6细胞因子的释放的减少% = 100-[ (pg/yL样品释放的细胞因子/pg/jiL从 C+释放的细胞因子)X100]
[0275] W上报道的表1显示,所检测的蜡菊属的初始提取物不具有可检测的黏膜黏附效 应,而组分B和组分D的黏膜黏附效应远优于起始提取物的黏膜黏附效应(提取物的BE不可 测量,所述提取物的组分B和组分D的BE可测量),其中相对于起始提取物保持组分的屏障效 应性能或甚至具有增加的屏障效应性能。
[0276] 获得的数据显示本发明的组分适合用于所述和所要求保护的用途。
【主权项】
1. 一种蜡菊属的提取物的组分,其特征在于黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏附 活性且屏障效应大于或等于所述提取物的屏障效应。2. 根据权利要求1所述的蜡菊属的提取物的组分,其中在对细胞进行的黏膜黏附试验 中将所述黏膜黏附活性测量为黏膜黏附百分比。3. 根据权利要求3所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述黏膜黏附百分比大于60%, 或大于65%或大于70%。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述组分的特征还 在于屏障效应大于或等于所述提取物的屏障效应。5. 根据权利要求4所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述组分的特征在于通过响应 于炎性试剂或刺激性试剂的细胞标记物释放抑制试验测量的屏障效应百分比大于或等于 30%,或者大于或等于32%。6. 根据权利要求5所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述组分的特征在于通过对细 胞进行的黏膜黏附试验测量的黏膜黏附百分比大于65%且通过响应于炎性试剂或刺激性 试剂的细胞标记物释放抑制试验测量的屏障效应百分比大于45%。7. 根据权利要求5所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述组分的特征在于通过对细 胞进行的黏膜黏附试验测量的黏膜黏附百分比大于70%且通过响应于炎性试剂或刺激性 试剂的细胞标记物释放抑制试验测量的屏障效应百分比大于或等于30%,或者大于或等于 32%〇8. 根据权利要求1至7中任一项所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述提取物为蜡菊 属花顶的任选地以干燥或冻干形式的提取物。9. 根据权利要求8所述的蜡菊属的提取物的组分,其中所述提取物为水醇提取物。10. -种组合物,包括根据权利要求1至9中任一项所述的蜡菊属的提取物的一种以上 组分且不包括未提取出的蜡菊属的提取物。11. 一种用于药物组合物或中药组合物的载体,包括根据权利要求1至9中任一项所述 的蜡菊属的提取物的一种以上组分,其特征在于具有通过对细胞进行的黏膜黏附试验测量 的大于60%,大于65%或大于70%的黏膜黏附百分比和通过响应于炎性试剂或刺激性试剂 的细胞标记物释放抑制试验测量的大于或等于30%,或者大于或等于32%的屏障效应百分 比。12. -种用于制备蜡菊属的提取物的组分的方法,其特征在于以下步骤: a. 制备蜡菊属花顶的水醇提取物并对所述提取物进行离心或倾析,从而获得沉淀组分 和澄清的醇组分; b. 从在a中制备的所述澄清的醇组分获得浓缩的水溶性组分B, 其中所述组分B的特征在于黏膜黏附活性优于所述提取物的黏膜黏附活性且屏障效应 大于所述提取物的屏障效应。13. 根据权利要求12所述的方法,其中所述组分B的特征在于通过对细胞进行的黏膜黏 附试验测量的黏膜黏附百分比大于65%且通过响应于炎性试剂或刺激性试剂的细胞标记 物释放抑制试验测量的屏障百分比大于45%。14. 根据权利要求12或13所述的方法,还包括以下步骤: c. 对所述组分B进行倾析和/或离心和过滤,从而收集水溶性组分; d.对在C中获得的所述水溶性组分进行膜超滤或纳滤并收集组分D,所述组分D对应于 从所述超滤或纳滤获得的渗透液,其中所述组分D的特征在于黏膜黏附活性优于所述提取 物的黏膜黏附活性且在于屏障效应大于或等于所述提取物的屏障效应。15.根据权利要求14所述的方法,其中所述组分D的特征在于通过对细胞进行的黏膜黏 附试验测量的黏膜黏附百分比大于70%且通过响应于炎性试剂或刺激性试剂的细胞标记 物释放抑制试验测量的屏障效应百分比大于或等于30%,或者大于或等于32%。
【文档编号】A61L15/58GK106029113SQ201580008777
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月11日
【发明人】瓦伦蒂诺·梅尔卡蒂, 路易莎·马特托里
【申请人】阿波卡-阿格里科拉共同股份公司
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