一种活疫苗及其制备方法和应用

文档序号:10664527阅读:491来源:国知局
一种活疫苗及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT-HA,其中,该HVT重组有禽流感病毒的HA基因,该HA基因能表达HA蛋白。本发明的活疫苗能在体内快速产生HI抗体,较传统的灭活疫苗具有更有效地预防禽流感的效果,且能对马立克氏病毒的感染产生良好的保护作用。
【专利说明】
一种活疫苗及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域,具体地涉及一种治疗禽流感的活疫苗、制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)可引起鸡的呼吸道疾病和产 蛋下降,在混合感染或继发感染其它病原的情况下有较高的发病率和死亡率,给我国养禽 业造成严重的经济损失。其基因组由8段单链的反义RNA构成,编码10种蛋白质,其中8 种蛋白质是结构蛋白,包括HA和NA,其他两种蛋白是非结构蛋白。一般认为HA是其主要 的抗原基因,其可以在禽类中引发保护性抗体。然而,H9亚型AIV的变异速度较快,现有 疫苗株不能有效保护流行株,并且,现有的疫苗多是灭活疫苗,其可以刺激机体产生体液免 疫,但却不能产生粘膜免疫和细胞免疫,免疫期不长,此外,灭活疫苗的生产成本高,生产过 程中可能造成病毒对环境的污染。因此需要筛选流行株来制备新型疫苗以解决现有存在的 问题。
[0003] 马立克氏病(Marek' s disease, MD)是由马立克氏病毒(Marek' s disease virus,MDV)引起的鸡淋巴组织增生性肿瘤疾病。马立克氏病是可以通过疫苗控制的肿瘤性 疾病,该病在我国许多地区时有发生,即使免疫鸡群也会有发病的情况,MDV感染会诱发产 生免疫抑制现象,还会继发或混合感染,使MD的疫情更加严重,引起更高的发病率和死亡 率,给养禽业造成了巨大的经济损失。

【发明内容】

[0004] 本发明利用火鸡疱疹病毒(HVT),即马立克氏病病毒血清型-3作为活病毒载体表 达禽流感病毒HA基因,以克服现有禽流感灭活疫苗的上述缺陷,本发明通过构建重组火鸡 疱疹病毒可有效解决上述问题。
[0005] 本发明的第一方面在于提供一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗 rHVT-HA,其中,所述HVT重组有禽流感病毒的HA基因,所述HA基因能表达HA蛋白,所述禽 流感病毒的HA基因重组到HVT基因组中非必需区US2基因157-167位氨基酸之间。
[0006] 该禽流感病毒HA基因可以自禽流感病毒任何亚型或任何毒株获得。
[0007] 作为本发明的一种实施方式,本发明的活疫苗rHVT-HA中,所述HVT为FC126株、 PB-THV1 株、H-2 株、YT-7 株、WTHV-1 株和 HPRS-26 株。
[0008] 火鸡痕疼病毒是痕疼病毒科(Herpesviridae family)和α-痕疼病毒亚科 (Alphaherpesvirinae subfamily)中的双链线性DNA病毒。HVT在家养火鸡中是普遍存在 的且是非致癌的,并且它被分类为马立克氏病病毒血清型3。已经广泛地使用HVT对鸡进 行接种以在鸡中预防马立克氏病。只要它对鸡是非致病的,本发明中便可以使用任何HVT。 例如,下列HVT毒株,FC126、PB-THV1、H-2、YT-7、WTHV-1和HPRS-26适用于主链病毒。这 些之中,优选地,FC126毒株有利地适用于本发明。
[0009] HVT 病毒 FC126 株、PB-THV1 株、H-2 株、YT-7 株、WTHV-1 株和 HPRS-26 株均可从商 业途径购得。
[0010] 作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的活疫苗rHVT-HA中,所述HA基因包 括禽流感病毒H9亚型的HA基因。
[0011] 作为本发明的一种优选实施方式,本发明的所述的活疫苗rHVT-HA中,所述HA基 因包括H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株及A155-1-2014株的HA基因。
[0012] 作为本发明的一种最优选实施方式,本发明的所述的活疫苗rHVT-HA中,所述HA 基因序列包括编码SEO. No. 4氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013] 优选地,所述HA基因自H9亚型禽流感病毒获得。
[0014] 优选地,所述HA基因自H9亚型禽流感病毒HL株、SZ株及A155-1-2014株获得。
[0015] 优选地,所述A155-1-2014株的HA基因的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0016] 优选地,所述H9亚型禽流感病毒A155-1-2014株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示。
[0017] 在本发明中,将HA基因插入到HVT基因组中,优选地,将HA基因插入到HVT基因 组中病毒生长非必需的区域,其在这里称为非必需区。换言之,非必需区可定义为这样的区 域,其中外来基因的修饰或插入不会阻止病毒在体外或在体内成功复制。
[0018] 优选地,HVT基因组中非必需区为UL43、US2、UL44和UL46之间的区域。
[0019] 优选地,HVT基因组中非必需区为US2。
[0020] 优选地,HA基因插入到HVT基因组中非必需区US2的位点为US2基因157-167位 氨基酸之间。
[0021] HA基因是禽流感病毒的保护性抗原基因,而主链HVT是马立克氏病活体疫苗,所 以本发明中含有HA基因的重组HVT可以用作针对AI和马立克氏病的二价疫苗,或者用作 针对AI的单价疫苗。
[0022] 作为本发明的一种实施方式,本发明的所述的活疫苗rHVT-HA中还包括载体,佐 剂。
[0023] 该疫苗还可以包括禽细胞、培养基成分、缓冲液如盐酸盐缓冲液和HEPES缓冲液 和/或佐剂诸如细胞因子和CpG寡脱氧核苷酸。只要不是药理学上有害的,该疫苗还可包 含有任何成分诸如防腐剂。另外,本发明的疫苗可以与任何重组的或非重组的病毒(诸如 MDV血清型1或血清型2疫苗毒株)在混合物中使用。
[0024] 本发明的第二方面在于提供一种禽流感HA基因,其核苷酸序列如SEO. No. 3所示。
[0025] 本发明的第三方面在于提供一种禽流感HA蛋白,其氨基酸序列如SEO. No. 4所示。
[0026] 本发明的第四方面在于提供一种制备所述的活疫苗rHVT-HA的方法,所述方法包 括:1)提供火鸡疱疹病毒HVT ;2)克隆所述禽流感病毒的HA基因;3)重组所述禽流感病毒 的HA基因到所述火鸡疱疹病毒HVT基因组中;4)培养增殖所述重组HVT-HA病毒;以及5) 将所述增殖重组病毒与载体混合。
[0027] 任何已知方法可适用于制备本发明中的重组二价疫苗。例如,可以将重组HVT接 种到允许培养细胞(诸如CEF细胞)中,并培养至合适的滴度。然而,通过胰蛋白酶处理从 转瓶中取出的细胞,并通过离心收集。然后将所沉淀的细胞在含有二甲基亚砜的培养基中 混悬,缓慢地冷冻,然后贮存在液氮中。或者,可以通过在含有稳定剂(诸如蔗糖和牛血清 蛋白)的稀释剂中破坏细胞来从感染的细胞中释放重组HVT。这些所释放的HVT成为无细 胞的HVT。可以冻干无细胞的HVT,并于4°C贮存。
[0028] 作为本发明的一种优选实施方式,本发明制备所述的活疫苗rHVT-HA的方法中, 所述禽流感病毒的HA基因序列包括编码SEO. No. 4氨基酸序列的核苷酸序列;重组所述禽 流感病毒的HA基因到所述火鸡疱疹病毒HVT US2基因157-167位氨基酸之间。
[0029] 具体地,本发明制备的重组活载体HVT疫苗是通过下列方式来实现的:
[0030] 1.扩增H9N2禽流感病毒的HA基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA中;
[0031] 2.将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含lacZ和HA基因表达盒克隆入马立 克氏病病毒US2基因中,构建马立克氏病病毒的转移载体;
[0032] 3.通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过 蓝斑筛选获得重组病毒;
[0033] 4. PCR方法鉴定该基因组中是否含有完整的HA基因,并通过免疫酶反应和 Western-blot证实重组病毒能否表达禽流感HA蛋白,并鉴定其是否具有血清活性。
[0034] 本发明的第五方面在于提供所述的疫苗在制备预防和治疗禽流感和马立克氏病 的药物中的应用。
[0035] 该应用可以通过接种马立克氏病疫苗的任何已知方法来给鸡施用二价重组HVT 疫苗。例如,用含有缓冲组分、糖类和染料的稀释剂将本发明的疫苗稀释成每剂10-105个, 或者更有利地,稀释成1〇 2_1〇4个蚀斑形成单位(Pfu),可以将稀释的疫苗在一日龄雏鸡的 颈后进行皮下接种。
[0036] 本发明的第六个方面在于提供所述核苷酸序列SEO. No. 3所示的禽流感HA基因在 制备预防和治疗禽流感相关药物中的应用。
[0037] 本发明的禽流感HA基因可以应用于表达载体、活载体、核酸疫苗、诊断试剂开发。
[0038] 本发明将禽流感H9N2的保护性抗原HA基因插入到细胞结合型的HVT病毒的非必 需区US2中,这样,随着重组病毒在CEF细胞上的繁殖与复制,HA蛋白也将得到不断表达。 用该发明毒株制备的疫苗能有效抵抗MDV强毒的攻击,也能诱导机体产生抵抗H9亚型禽流 感攻击的体液免疫和细胞免疫反应。且MDV为严格的细胞结合型病毒,可以突破母源抗体 的干扰,适合早期免疫,通过鸡胚免疫,操作更方便。
[0039] 本发明上述的优选实施方式中,将重组所述禽流感病毒的HA基因到所述火鸡疱 疹病毒HVT US2基因157-167位氨基酸之间,使用的HVTUS2基因157-167位氨基酸的插入 位点是新的插入位点,且本发明制备的活疫苗能功能表达HA蛋白,进行有效地免疫。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明rHVT-HA活疫苗和H9灭活苗免疫在鸡体内产生的HI抗体结果。
[0041] 序列表中:
[0042] 序列1为禽流感病毒HL株HA基因的核苷酸序列;
[0043] 序列2为禽流感病毒HL株HA蛋白的氨基酸序列;
[0044] 序列3为禽流感病毒A155-1-2014株HA基因的核苷酸序列;
[0045] 序列4为禽流感病毒A155-1-2014株HA蛋白的氨基酸序列;
[0046] 序列5为HVT病毒FC126株US2基因的核苷酸序列;
[0047] 序列6为HVT病毒FC126株US2蛋白的氨基酸序列。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0049] 实施例1转移载体的构建
[0050] 1、H9亚型禽流感病毒基因组RNA的提取:将H9亚型AIV A155-1-2014株接种10 日龄SPF鸡胚,收集24~72小时内死亡鸡胚的尿囊液,用Trizol试剂进行尿囊液总RNA 的提取。具体操作按试剂说明书进行。
[0051] 2、RT-PCR :设计引物一对,其序列为:上游引物:5 '-GAAGCGGCCGCAAAATGGAGACAAT ATCACTAATAAC-3 ',下游引物:5 ' -GGTGGGCCCTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3 '。并分别在上游 引物和下游引物5 '端引入Not I和Apa I,预期扩增片段长度为1700bp,再克隆到T载体 中,通过酶切分析和PCR鉴定出含HA基因的阳性重组质粒。
[0052] 3、含HA基因的真核表达载体的构建:将HA基因通过Not I和Apa I位点克隆到 pcDNA载体中,并命名为pcDNA-HA。
[0053] 4、pUS2载体的构建:根据GenBank上发表的HVT Fcl26株全长基因组序列 (accession No. AF291866)设计引物,并在上、下游因为的5'端引入Sal I和Hind III酶 切位点,以HVT基因组DNA为模板,扩增HVT的US2区域及其两端的同源序列。再将扩增的 目的片段克隆到PUC18载体中,并命名为pUS2。
[0054] 5、含HA基因的HVT转移载体的构建:pcDNA-HA用内切酶Bgl II和Ava II酶切 后,获得6.8kb含CMV启动子、LacZ基因、HA基因及SV40polyA尾的表达盒片段,并将该片段 亚克隆到PUS2中,获得转移质粒载体,并命名为pUS2-HA。插入具体位点是US2基因157~ 167位氨基酸之间。
[0055] 结果:将1. 7kb的HA基因克隆到pcDNA载体中,获得了 pcDNA-HA,然后将pcDNA-HA 用内切酶酶切后,获得的片段亚克隆到PUS2中,获得转移质粒载体,即为pUS2-HA。该转移 重组质粒含有lacZ报告基因及用于体内同源重组的同源臂,上下游同源臂的大小分别为 3. 5 和 0· 85kb。
[0056] 实施例2重组马立克氏病毒的构建、筛选和鉴定
[0057] 按常规方法制备鸡胚成纤维细胞(CEF),待其长成80 %单层后,接种HVT,剂量为 24孔板中每孔50PFU,37°C作用4h后,按照Lipofectamine?2000说明书,将转移载体质粒 转染细胞,作用2h后,倒掉转染液,加入含5%胎牛血清的MEM培养液于37°C 0)2培养箱中 培养4~5天后,待出现典型的细胞病变,加入含有X-Gal (200ug/ml)营养液,观察蓝色蚀 斑,将24孔中感染的CEF细胞用0. 25%胰酶消化,接种到有新鲜CEF细胞单层的96孔培养 板上。观察蓝斑,将有蓝色孔的细胞消化并接到新的细胞上,如此重复多个循环直至确信所 有的蚀斑都是蓝色,通过蓝斑筛选获得纯化的重组病毒。
[0058] 结果:将转移质粒PUS2-HA用脂质体包裹转HVT感染的CEF细胞,转染后3~4天, 开始加底物X-Gal,观察到有蓝斑的出现,通过传6代试验证明该重组病毒是稳定的。
[0059] 重组病毒的鉴定:用常规方法提取重组病毒的总DNA,根据前面设计的HA基因引 物进行HA基因片段的扩增。
[0060] 结果:提取纯化获得的稳定的重组病毒DNA,用禽流感HA基因的特异性引物扩增 出大小约1. 7kb的PCR产物。
[0061] 实施例3重组病毒表达HA蛋白的鉴定
[0062] 1、间接免疫酶反应将重组病毒(rHVT-HA)感染96孔中的CEF细胞,4~5d后。倒 掉培养液并用预冷的95%的乙醇和丙酮(4:6)混合液固定细胞;用SPF鸡抗H9N2血清和 HRP标记兔抗鸡IgY进行免疫酶反应。
[0063] 结果:含重组病毒的CEF细胞经X-Gal染色后,空斑呈蓝色。免疫酶反应结果表 明,重组病毒形成的蓝斑能与H9N2血清发生特异性反应。
[0064] 2、Western-blot检测将重组病毒(rHVT-HA)感染CEF细胞,4~5d后,收集的细 胞,裂解,取上清,进行12% SDS-PAGE电泳,再转移到膜上,用SPF鸡抗H9N2血清和HRP标 记兔抗鸡IgY进行Western-blot分析。
[0065] 结果:含有重组病毒的细胞裂解物的Western-blot分析表明,在分子量大约70KD 处有特异的反应条带,进一步说明HA蛋白在重组病毒中表达。
[0066] 实施例4重组病毒血凝活性鉴定
[0067] 将重组病毒(rHVT-HA)感染CEF细胞,4~5天后,收集24孔细胞,溶于0. 2ml的 生理盐水中超声波破碎后,经微量离心机8000r/min,2min,收集上清液,用生理盐水作倍比 稀释后,加入等体积0. 5%的鸡红细胞,室温作用30min,观察结果,同时以HVT感染的CEF 细胞作为阴性对照。
[0068] 结果:重组病毒表达的HA具有凝集红细胞活性,血凝效价为1:64,而对照的HVT 感染的CEF细胞的裂解液没有凝集红细胞活性。
[0069] 实施例5重组病毒生长曲线的测定
[0070] 将rHVT-HA和HVT分别接种到24孔板培养的长满单层的CEF (3PFU/孔)。分别在 接种后l、2、3、4、5、6、7d收集病毒液,并接到新鲜的细胞单层上,每天收集的病毒液分别做 4个重复;6d后,计算各孔的噬斑数,并计算出各天的噬斑数。
[0071 ] 结果:根据CEF上的rHVT-HA和HVT的空斑数,rHVT-HA与亲本病毒有相似的生长 曲线,说明HA基因的插入没有影响HVT的正常生长和增殖过程,重组病毒结构稳定。
[0072] 实施例6H9亚型禽流感灭活疫苗的制备
[0073] 1.病毒液制备
[0074] 取H9亚型禽流感病毒A155-1-2014株毒种,用无菌生理盐水稀释至103(取病毒 液0. lml加入到0. 9ml无菌生理盐水中,震荡混匀后依此再稀释2次),经尿囊腔接种10日 龄易感鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化),每 胚0. lml (含105EID5。)。接种后密封针孔,置36~37°C继续孵育,不必翻蛋。至96小时, 取出,气室向上直立,置于2~8°C冷却12~24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。所收 获病毒液取样,按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录中方法,测定病毒含量为 10 8-5EID5〇/0. lml 〇
[0075] 2.疫苗制备
[0076] 将上述制备的病毒液经甲醛溶液进行灭活后,与注射用白油混合,以2800r/min 乳化40分钟即。疫苗具体配比见表1。
[0077] 表1H9亚型禽流感A155-1-2014株灭活疫苗组分配比
[0078]
[0079] 实施例7rHVT-HA对H9亚型禽流感的免疫保护实验
[0080] 将40只1日龄SPF鸡随机分为2组,每组20只,第一组以5000PFU剂量免疫重组 病毒rHVT-HA ;第二组以0. 3ml剂量免疫实施例6制备的H9亚型禽流感灭活苗(疫苗1); 均以颈部皮下注射方式免疫雏鸡。免疫后每周翅静脉采血并分离血清测定HI抗体,免疫后 2周通过静脉注射方式以l(f°EID 5。剂量的H9N2亚型禽流感病毒A155-1-2014株感染两个 免疫组各10只鸡,免疫后3周以同样剂量攻毒两个免疫组中各10只鸡。攻毒后持续观察 两周,并在攻毒后第5天采集所有组鸡只的喉头和泄殖腔棉拭子,处理后接种10日龄SPF 鸡胚,进行病毒分离。
[0081] 血清HI抗体检测结果见图1,rHVT-HA免疫组HI抗体比H9灭活苗免疫组抗体产 生早1周,在免后2周即可达到81og 2;攻毒保护结果如表2、表3所示,重组病毒rHVT-HA免 疫组鸡只在免后2周即可得到100%保护,攻毒后所有鸡均未分离到病毒;H9亚型禽流灭活 苗免疫鸡在免后2周6/10排毒。上述结果表明,重组病毒rHVT-HA免疫鸡只后,HI抗体产 生更快,在免后2周能够提供针对H9N2亚型禽流感的完全保护。
[0082] 表2免疫后2周攻毒保护试验结果
[0083]
[0084] 表3免疫后3周攻毒保护试验结果
[0085]
[0086] 实施例8rHVT-HA对H9亚型禽流感的交叉免疫保护试验
[0087] 为了研究rHVT-HA对其他毒株的交叉保护性,按照实施例6中疫苗的制备方法,制 备了禽流感(H9亚型)灭活疫苗(HL株,见文献:禽流感病毒(H9N2亚型,HL株)与国内部 分省禽流感病毒(H9亚型)流行株抗原相关性及交互免疫的研究,2007年畜牧兽医学会年 会论文集,2007, 35-38,
【申请人】持有此毒株,并愿意按专利法相关规定自申请日起20年内 向公众发放),具体疫苗配比见表4。
[0088] 表4H9亚型禽流感HL株灭活疫苗组分配比
[0089]
[0090] 选用本发明重组病毒rHVT-HA、实施例6制备的疫苗1及本实施例制备的疫苗2, 分别免疫SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司),免后3周选用HL株及 A155-1-2014株分别攻击,并进行病毒分尚。结果显不,HL株灭活疫苗免疫组的排毒率分 别为0/10、4/10, A155-1-2014株灭活疫苗免疫组的排毒率分别为0/10、0/10,重组病毒 rHVT-HA免疫组的排毒率分别为0/10、0/10,而攻毒对照组的排毒率分别为5/5、5/5。具体 结果见表5。
[0091] 表5rHVT-HA对H9亚型禽流感的交叉免疫保护试验免疫后3周结果
[0092]
[0093] 说明A155-1-2014株灭活疫苗及重组病毒rHVT-HA对两株病毒的攻击均产生了有 效保护,交叉免疫原性良好。
[0094] 然而,对上述试验进行了免后两周攻毒试验,并进行病毒分离。结果显示,HL株灭 活疫苗免疫组的排毒率分别为6/10、10/10, A155-1-2014株灭活疫苗免疫组的排毒率分别 为6/10、6/10,重组病毒rHVT-HA免疫组的排毒率分别为0/10、0/10,而攻毒对照组的排毒 率分别为5/5、5/5。具体结果见表6。
[0095] 表6rHVT-HA对H9亚型禽流感的交叉免疫保护试验免疫后2周结果
[0096]
[0097] 进一步说明重组病毒rHVT-HA对两株病毒的攻击均产生了有效保护,交叉免疫原 性良好,而且,其抗体产生更快,在免疫后两周能够提供针对H9N2亚型禽流感的完全保护。
[0098] 实施例9rHVT-HA疫苗MDV免疫攻毒保护试验
[0099] 20只1日龄SPF白来航鸡随机分成2组,第一组10只免疫rHVT-HA疫苗,每只颈 部皮下注射〇. 2ml (含3000PFU),第二组不免疫作为对照。两组鸡分别在隔离器中饲养,喂 给消毒的饲料和饮水。
[0100] 免疫后21d,每组10只鸡攻击MDV京-1株强毒,腹腔接种病毒,攻毒剂量1000PFU/ 只。每天观察、记录发病和死亡情况,对死亡鸡逐只解剖,观察肉眼病变。攻毒后60天,扑 杀所有活鸡,进行解剖,观察病变特征,计算保护指数。
[0101] 保护指数=(攻毒对照组MD阳性率一免疫组MD阳性率)X 100% /攻毒对照组 MD阳性率
[0102] 结果表明,rHVT-HA疫苗免疫组能有效抵抗MD强毒的攻击,与攻毒对照组比较,差 异极显著(P < 0. 01),保护指数为100%,具体结果见表7。
[0103] 表7rHVT-HA疫苗免疫攻毒结果
[0104]
[0105] 实施例10不同毒株禽流感病毒HA基因重组活载体效力试验
[0106] 按照实施例1-5的方法,将禽流感HL株HA基因(序列1)插入到HVT预期位点, 得到重组病毒rHVT-HA-HL。
[0107] 将60只1日龄SPF鸡随机分为6组,每组10只,第一组、第二组以5000PFU剂量 免疫重组病毒rHVT-HA ;第三组、第四组以5000PFU剂量免疫重组病毒rHVT-HA-HL ;均以颈 部皮下注射方式免疫雏鸡;第五组、第六组为不免疫对照。免疫后每周翅静脉采血并分离 血清测定HI抗体,免疫后2周通过静脉注射方式以l(f°EID 5。剂量的H9N2亚型禽流感病毒 A155-1-2014株感染第一组、第三组、第五组10只鸡,以107·°ΕΙ05。剂量的H9N2亚型禽流感 病毒HL株感染第二组、第四组、第六组10只鸡。攻毒后持续观察两周,并在攻毒后第5天 采集所有组鸡只的喉头和泄殖腔棉拭子,处理后接种10日龄SPF鸡胚,进行病毒分离。
[0108] 血清HI抗体检测结果显示,rHVT-HA免疫组HI抗体与rHVT-HA-HL免疫组抗体产 生均较早,在免后2周即可达到61og 2, rHVT-HA免疫组更高达81og2;攻毒保护结果如表8 所示,重组病毒rHVT-HA免疫组鸡只在免后2周即可得到100%保护,对两种病毒株攻毒后 所有鸡均未分离到病毒;重组病毒rHVT-HA-HL免疫鸡在免后2周对HL株攻毒后100 %保 护,而对A155-1-2014株攻毒后4/10排毒。
[0109] 上述结果表明,重组病毒rHVT-HA及rHVT-HA-HL免疫鸡只后,HI抗体都能很快产 生,在免后2周能够提供针对H9N2亚型禽流感自身毒株攻击的完全保护,尤其以重组病毒 rHVT-HA更能提供对最新流行毒株的完全保护。两组对照全部发病。
[0110] 表8免疫后2周攻毒保护试验结果
[0111]
[0112] 实施例11禽流感HL株HA基因重组活载体抗体产生比较
[0113] 将60只1日龄SPF鸡随机分为6组,每组10只,第一组、第二组以5000PFU剂量 免疫实施例10制备的重组病毒rHVT-HA-HL ;第三组、第四组免疫实施例8制备的疫苗2 ;均 以颈部皮下注射方式免疫雏鸡;第五组、第六组为不免疫对照。免疫后每周翅静脉采血并分 离血清测定HI抗体,免疫后2周通过静脉注射方式以l(f°EID 5。剂量的H9N2亚型禽流感病 毒HL株感染第一组、第三组、第五组10只鸡,免疫后3周以107·°Ε%。剂量的H9N2亚型禽 流感病毒HL株感染第二组、第四组、第六组10只鸡。攻毒后持续观察两周,并在攻毒后第 5天采集所有组鸡只的喉头和泄殖腔棉拭子,处理后接种10日龄SPF鸡胚,进行病毒分离。
[0114] 血清HI抗体检测结果rHVT-HA-HL免疫组抗体产生较早,在免后2周即可达 到61og 2,疫苗2免疫组免疫后3周才达到61og2;攻毒保护结果如表9所示,重组病毒 rHVT-HA-HL免疫组鸡只在免后2周即可得到100%保护,攻毒后所有鸡均未分离到病毒;HL 株免疫组免疫鸡在免后3周对HL株攻毒后100%保护,攻毒后所有鸡均未分离到病毒。
[0115] 表9禽流感HL株HA基因重组活载体抗体产生比较结果
[0116]
[0117] 上述结果表明,重组病毒rHVT-HA-HL免疫鸡只后,HI抗体都能很快产生,在免后2 周能够提供针对H9N2亚型禽流感自身毒株攻击的完全保护,而灭活疫苗需要到免疫后3周 才能提供完全保护。两组对照全部发病。本发明活载体疫苗的抗体上升速度远高于灭活疫
苗。
[0118] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽 然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人 员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种预防和治疗禽流感和马立克氏病的活疫苗rHVT-HA,其中,所述HVT重组有禽流 感病毒的HA基因,所述HA基因能表达HA蛋白,所述禽流感病毒的HA基因重组到HVT基因 组中非必需区US2基因157-167位氨基酸之间。2. 根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA,其中,所述HVT为FC126株、PB-THV1株、H-2 株、YT-7 株、WTHV-1 株和 HPRS-26 株。3. 根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA,其中,所述HA基因包括禽流感病毒H9亚型 的HA基因。4. 根据权利要求3所述的活疫苗rHVT-HA,其中,所述HA基因包括H9亚型禽流感病毒 HL株、SZ株及A155-1-2014株的HA基因;最优选地,所述HA基因序列包括编码SEO. No. 4 氨基酸序列的核苷酸序列。5. 根据权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA,其中,所述二联活疫苗rHVT-HA还包括载 体,佐剂。6. -种禽流感HA基因,其核苷酸序列如SEO. No. 3所示。7. -种禽流感HA蛋白,其氨基酸序列如SEO. No. 4所示。8. -种制备权利要求1所述的活疫苗rHVT-HA的方法,所述方法包括: 1) 提供火鸡疱疹病毒HVT ; 2) 克隆所述禽流感病毒的HA基因; 3) 重组所述禽流感病毒的HA基因到所述火鸡疱疹病毒HVT基因组中; 4) 培养增殖所述重组HVT-HA病毒;以及 5) 将所述增殖重组病毒与载体混合。9. 根据权利要求8所述的制备方法,其中,所述禽流感病毒的HA基因序列包括编码 SEO. No. 4氨基酸序列的核苷酸序列;重组所述禽流感病毒的HA基因到所述火鸡疱疹病毒 HVTUS2基因157-167位氨基酸之间。10. 根据权利要求1~5任一项所述的疫苗在制备预防和治疗禽流感和马立克氏病的 药物中的应用。
【文档编号】A61P31/22GK106031793SQ201510111082
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月13日
【发明人】张许科, 孙进忠, 郭丽霞, 田克恭
【申请人】普莱柯生物工程股份有限公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1