天然本草提取物的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种天然本草提取物，其中樟子松多酚的质量百分比为10％?80％。本发明还提供了一种天然本草提取物的制备方法以及在化妆品中的应用。本发明提供的天然本草提取物为粉末状，可以直接向化妆品和/或护肤品中添加，而不需要研磨等其他预处理。且提取工艺产生的废渣用于合成木板，溶媒经过处理后返回至溶媒槽，可以继续使用，整个提取工艺无废液、废渣产生，绿色无污染。本发明提供的天然本草提取物具有优异的抗衰老、保湿和美白功效，可以作为复合型化妆品和/或护肤品添加剂。
【专利说明】
天然本草提取物的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及一种提取物及其制备方法和包含该提取物的化妆 品，尤其涉及一种樟子松树皮提取物及其制备方法和在化妆品中的应用。
【背景技术】
[0002] 棒子松(Pinus sylvestris L.var.mongolica Litvin)是松科松属裸子植物，又 名海拉尔松。常绿乔木，高达25m，胸径达80cm，树干下部灰褐色或黑褐色。主要分布于大兴 安岭北部海拔400-1000m的山地。
[0003 ]樟子松花纹美观、纹理较直，且具有耐寒、抗旱、耐贫瘠及抗风等特性，目前在家具 及三北地区防护林和固沙造林方面应用较多。顾剑、张宇(樟子松树皮有效成分的初步研 究，黑龙江医药科学，2009年6月第32卷第3期第4页)采用水提和醇提的方法对樟子松树皮 的有效成分进行提取、检测，发现樟子松树皮中含有多糖、苷类、黄酮、有机酸、鞣质等有效 成分，具有药用开发价值。
[0004] 研究表明，樟子松树皮用乙醇提取的醇溶性物质中含有的黄酮类物质，为具有多 种保健功效的天然提取物，但是由于樟子松中的油脂含量仅为树皮干重的1%_3%，因此， 樟子松树皮的应用价值并未引起人们的重视。申请号201410820123.X，发明创造名称为:一 种从樟子松树皮中提取醇溶性物质的方法的中国专利，公开了一种分段提取樟子松树皮活 性物质的方法，但是其并未公开樟子松树皮在化妆品领域的应用与介绍，目前也未见到将 樟子松树皮用于化妆品领域的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种樟子松树皮提取物及其制备方法，并研究了该提取物在化妆品领 域中的应用。
[0006] 本发明的第一个方面在于提供一种樟子松树皮提取物，所述樟子松树皮包括樟子 松多酚、多糖及苷类化合物中的任意一种或几种组合物。
[0007] 作为本发明的一个优选实施例，所述樟子松树皮提取物中所述樟子松多酚的质量 百分比为10%-80%，如15%、70%等，优选为20%-50%，如25%、35%等。
[0008] 作为本发明的一个优选实施例，所述樟子松多酚中包括黄酮类化合物和原花青素 中的任意一种或几种组合。
[0009] 作为本发明的一个优选实施例，所述黄酮类化合物包括黄杉素、橙皮素、异鼠李 素、落叶松内酯(Larixinol)中的任意一种或几种组合。
[0010] 作为本发明的一个优选实施例，所述黄酮类化合物的质量含量为6-15%，优选为 8-10% 〇
[0011] 作为本发明的一个优选实施例，所述原花青素的质量含量为10%_40%，优选为 20%-30%。
[0012] 作为本发明的一个优选实施例，所述多糖和/苷类的质量含量为5-20 %，如6 %、 18%等，优选为8%-15%，如10%、12%等。
[0013] 作为本发明的一个优选实施例，所述樟子松树皮提取物还包括芥子酸、开环异落 叶松脂醇、9'_对羟基(反式)桂皮酸、7-羟基-开环异落叶松脂醇酯中的任意一种或几种组 合。
[0014] 作为本发明的一个优选实施例，所述樟子松树皮提取物为粉末状固体，可以全部 通过80目筛孔。
[0015] 本发明的第二个方面在于提供一种樟子松树皮提取物的制备方法，所述方法包括 如下步骤：
[0016] 步骤1、向樟子松树皮中加入10-20倍体积倍率的溶媒，提取2-10次，每次1.5-3h， 得到提取液；
[0017]步骤2、混合每次提取的提取液，得混合提取液，所述混合提取液经减压浓缩、干燥 后得到所述樟子松树皮提取物。
[0018] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述樟子松树皮为粉碎后过60目筛，得到 的通过筛网的樟子松树皮粉末。
[0019] 作为本发明的一个优选实施例，步骤1中所述溶媒为去离子水、甲醇水溶液、乙醇 水溶液中的任意一种或几种组合。
[0020] 作为本发明的一个优选实施例，所述甲醇水溶液的体积浓度为30-80%，如40%、 75%，优选为50-70 %，优选为55 %、65 %。
[0021] 作为本发明的一个优选实施例，减压浓缩过程中，溶媒中的轻质组分自上部离开 提取罐，所述轻质组分经回收塔回收后，返回溶媒储槽，作为溶媒原料重复利用。
[0022] 作为本发明的一个优选实施例，步骤2中所述干燥为热空气干燥、喷雾干燥、旋蒸 干燥、分子筛吸附干燥等中的任意一种或几种组合。
[0023] 作为本发明的一个优选实施例，所述喷雾干燥的条件为:80_120MPa压力下，将浸 膏制成60-300μπι的微粒，将微粒通过50-90°C的热空气干燥5-60s。
[0024] 作为本发明的一个优选实施例，步骤2中干燥后还包括消毒、杀菌步骤，所述杀菌 过程采用热空气灭菌、水蒸气灭菌、辐射灭菌、5 %石炭酸、70 %乙醇溶液、50 %甲醇水溶液 中的任意一种或几种组合。
[0025] 作为本发明的一个优选实施例，所述辐射灭菌的条件为钴60-γ射线，所述浸膏的 吸收剂量为10_30kGy，如15kGy、20kGy、25kGy等，辐射灭菌后所述橄榄叶提取物的Sal值小 于等于10- 5,优选为小于等于10-6,如2X 10」、5X10-7。
[0026] 作为本发明的一个优选实施例，步骤2中提取后的樟子松树皮的渣滓可以作为制 作木板的原料。
[0027] 作为本发明的一个优选实施例，所述樟子松树皮提取物可以是水提物、醇提物、油 提物、超临界C〇2提取物中的任意一种或几种的组合。
[0028]作为本发明的一个优选实施例，所述醇提物优选为乙醇提取物、甲醇提取物、乙醚 提取物和丙酮提取物中的任意一种或几种组合。
[0029] 本发明的第三个方面在于提供上述任意一种樟子松树皮提取物的应用。
[0030] 所述樟子松树皮提取物优选为施用于皮肤外表面，更优选为应用于制备涂覆于皮 肤外表面的制品。
[0031] 其中，本发明所述樟子松树皮提取物应用于制备日化用品，优选为应用于制备化 妆品和/或护肤品。
[0032] 本发明的第四个方面在于提供一种包含上述任意一种樟子松树皮提取物的日化 用品，优选为包含上述任意一种樟子松树皮提取物的化妆品和/或护肤品，更优选为所述化 妆品和/或护肤品中，优选为化妆品和/或护肤品中，还可以包括营养性添加剂。
[0033]作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中，所述樟子松树皮提取 物的含量为0.001%-50%，如1%、40%，优选为5%-30%，如10%、20%等。
[0034]本发明的第四个方面在于提供一种日化用品，所述护肤用品优选为化妆品和/或 护肤品。
[0035]作为本发明的一个优选实施例，所述化妆品和/或护肤品中包括樟子松树皮提取 物。
[0036] 其中，所述樟子松树皮提取物的含量为0.001 % -50 %，如1 %、40 %，优选为5 % -30%，如 10%、20% 等。
[0037] 本发明提供的樟子松树皮提取物为粉末状，可以直接向化妆品和/或护肤品中添 加，而不需要研磨等其他预处理。且提取工艺产生的废渣用于合成木板，溶媒经过处理后返 回至溶媒槽，可以继续使用，整个提取工艺无废液、废渣产生，绿色无污染。本发明提供的樟 子松树皮提取物具有优异的抗衰老、保湿和美白功效，可以作为复合型化妆品和/或护肤品 添加剂。
【附图说明】
[0038] 图1为过氧化氢对细胞存活率的影响；
[0039] 图2为樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响；
[0040] 图3为樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞MMP-1分泌的影响；
[0041 ]图4为樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HAS3含量的影响；
[0042]图5为樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞HA含量的影响；
[0043] 图6为樟子松树皮提取物对酪氨酸酶的抑制作用。
【具体实施方式】
[0044] 樟子松树皮提取物的制备
[0045] 实施例一
[0046] 位于乙醇储罐中的浓乙醇和去离子水在乙醇配制罐中配制成60 %的乙醇水溶液， 作为溶媒备用。
[0047] 取樟子松树皮10kg，去离子水洗涤2次，粉碎机粉碎至60目以下，得到樟子松树皮 粉末，按樟子松树皮粉末:60 %乙醇水溶液(体积比）=1:10向其中加入60 %乙醇水溶液，并 使用稀盐酸调节pH值至5,在常压、70°C水浴条件下于多功能提取罐中提取5次，每次2h，混 合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取结束后剩余的樟子松树皮残渣用于制备木板。 混合提取液在35°C、5kPa压力下浓缩至3kg，浓缩后的提取液经喷雾干燥得到樟子松树皮提 取物 0.86kg。
[0048] 其中，该喷雾干燥的条件为：100MPa压力下，将浸膏制成150nm的微粒，将微粒通过 70°C的热空气干燥15s。
[0049] 该樟子松树皮提取物为浅黄色，能够全部通过80目筛网。采用紫外-可见光吸收光 谱法、红外吸收光谱法、高效液相色谱法和液质联用法检测该樟子松树皮提取物中黄酮类 化合物的质量含量为8%，原花青素的质量含量为25%，其他多酚类物质的质量含量为 40%，多糖的质量含量为5%，苷类的质量含量为6%。
[0050] 真空浓缩过程得到的稀乙醇水溶液经稀乙醇水溶液储罐进入乙醇回收塔，在乙醇 回收塔中浓缩，提浓后的乙醇自乙醇回收塔的顶部进入乙醇储罐，再次使用。
[0051 ] 实施例二
[0052] 位于乙醇储罐中的浓乙醇和去离子水在乙醇配制罐中配制成30 %的乙醇水溶液， 作为溶媒备用。
[0053]取樟子松树皮10kg，去离子水洗涤2次，粉碎机粉碎至80目以下，得到樟子松树皮 粉末，按樟子松树皮粉末:30 %乙醇水溶液:50%甲醇(体积比）=1:10:4向其中加入30 %乙 醇水溶液和50%甲醇水溶液，并使用稀盐酸调节pH值至3,在常压、80°C水浴条件下于多功 能提取罐中提取3次，每次2h，混合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取结束后剩余的 樟子松树皮残渣用于合成木板。混合提取液在35°C、5kPa压力下浓缩至3kg，浓缩后的提取 液经喷雾干燥得到樟子松树皮提取物1.01kg。
[0054] 其中，该喷雾干燥的条件为:80MPa压力下，将浸膏制成300nm的微粒，将微粒通过 70°C的热空气干燥30s。
[0055] 该樟子松树皮提取物为浅黄色，能够全部通过80目筛网。采用紫外-可见光吸收光 谱法、红外吸收光谱法、高效液相色谱法和液质联用法检测该樟子松树皮提取物中黄酮类 化合物的质量含量为15%，原花青素的质量含量为10%，其他多酚类物质的质量含量为 20%，多糖的质量含量为8%，苷类的质量含量为10%。
[0056]真空浓缩过程得到的稀乙醇水溶液经稀乙醇水溶液储罐进入乙醇回收塔，在乙醇 回收塔中浓缩，提浓后的乙醇自乙醇回收塔的顶部进入乙醇储罐，再次使用。
[0057] 实施例三
[0058] 位于甲醇储罐中的浓甲醇和去离子水在甲醇配制罐中配制成70 %的甲醇水溶液， 作为溶媒备用。
[0059]取干燥樟子松树皮10kg，去离子水洗涤2次，粉碎机粉碎至60目以下，得到樟子松 树皮粉末，按樟子松树皮粉末:70%甲醇水溶液(体积比）= 1:15向其中加入70%甲醇水溶 液，并使用稀盐酸调节pH值至4,在1.2MPa、60°C水浴条件下于多功能提取罐中提取3次，每 次2.5h，混合每次提取的提取液，得到混合提取液，提取结束后剩余的樟子松树皮残渣经干 燥后用于合成木板。混合提取液在35°C、8kpa压力下浓缩至3kg，浓缩后的提取液经喷雾干 燥得到樟子松树皮提取物1.20kg。
[0060]其中，该喷雾干燥的条件为：120MPa压力下，将浸膏制成100nm的微粒，将微粒通过 70°C的热空气干燥50s。
[0061 ]该樟子松树皮提取物为浅黄色，能够全部通过100目筛网。采用紫外-可见光吸收 光谱法、红外吸收光谱法、高效液相色谱法和液质联用法检测该樟子松树皮提取物中黄酮 类化合物的质量含量为10%，原花青素的质量含量为35%，其他多酚类物质的质量含量为 30%，多糖的质量含量为5%，苷类的质量含量为15%。
[0062]真空浓缩过程得到的稀甲醇水溶液经稀甲醇水溶液储罐进入甲醇回收塔，在甲醇 回收塔中浓缩，提浓后的甲醇自甲醇回收塔的顶部进入甲醇储罐，再次使用。
[0063] 对比实施例
[0064]取干燥樟子松树皮10kg，在粉碎机中粉碎成粉末，过40目筛，得到樟子松树皮粉备 用。
[0065] 按体积比1:20加入60 %乙醇溶液，在50 °C温度下提取2h，提取结束后进行抽滤，得 滤液，将滤液的上清液旋转蒸发，得到浓缩液3kg，将浓缩液经80°C热空气干燥2h，得到樟子 松树皮提取物〇.73kg，该樟子松树皮提取物为浅黄色，为小块状。采用紫外-可见光吸收光 谱法、红外吸收光谱法、高效液相色谱法和液质联用法检测该樟子松树皮提取物中黄酮类 化合物的质量含量为5%，原花青素的质量含量为25%，其他多酚类物质的质量含量为 35%，多糖的质量含量为8%、苷类的质量含量为10%。
[0066] 樟子松树皮提取物对HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0067]取对数生长期、浓度为105个/mL的人HDF细胞，将细胞接种于96孔细胞培养板中， 每孔细胞液l〇〇yL。最终所铺的细胞孔数取决于样品数，每个样品设3个复孔。
[0068]将96孔板置于37 °C的细胞培养箱中贴壁培养6h。
[0069] 将终浓度为lmg/mL、0. lmg/mL和0.01mg/mL的樟子松树皮提取物加入到96孔细胞 培养板中，向对照组加入等体积的细胞培养液。于37 °C、包含5 % C02的细胞培养箱中孵育 48h〇
[0070] 然后向每孔中加入0.5mg/mL的MTTlOOyL，于37°C、包含5%⑶2的细胞培养箱中黑 暗条件下孵育4h。去除上清液，加入150yL DMS0，震荡以570nm为实验波长，630nm为参照波 长，检测吸光度。
[0071] 计算细胞存活率，结果如表1所示：
[0072] 表1，樟子松树皮提取物对人HDF细胞和Hacat细胞存活率的影响
[0073]
[0074]^以细胞存活率高于80%为对人HDF细胞和Hacat细胞无毒的标准，由表1可知，本发 明提供的樟子松树皮提取物对人HDF细胞无毒的最高浓度为0.01mg/mL，对人Hacat细胞无 毒的最高浓度为〇. 〇lmg/mL，因此，确定樟子松树皮提取物的浓度0.01 mg/mL为后续的试验 浓度。
[0075] 樟子松树皮提取物的抗衰老性能
[0076]自然状态下樟子松树皮提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响
[0077]为了考察本发明提供的樟子松树皮提取物对HDF胶原蛋白分泌的影响，本实施例 分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。
[0078]取对数生长期、浓度为105个/mL细胞，每孔100yL，于37°C、含有C02的细胞培养箱中 培养24h，之后取出上清液，以3000rpm的速度离心10min，取上清液。
[0079]向标准组中加入50yL标准液，向实验组中加入10yL上清液和40yL本发明提供的樟 子松树皮提取物的稀释液，向对照实验组中加入l〇yL上清液和40yL采用对比实施例所述方 法制备的樟子松树皮提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次， 每组样品设3个复孔。
[0080]向四组样品中分别加入生物素标记的抗-lgG抗体50yL，于37°C温育30min，洗涤5 次。
[0081 ]向四组样品中分别加入50μL的链霉素和素-HRP，轻轻震荡混匀，于3 7 °C温育 30min，洗涤5次。
[0082] 向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，轻轻震荡混匀，于37°C避光孵 育30min，向四组样品中加入终止液50yL。
[0083] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光度，结果如表 2所示。
[0084] 表2，樟子松树皮提取物对HDF细胞I型胶原蛋白分泌的影响
[0085]
L〇〇86」胶原蛋白主要包括I型胶原和III型胶原，外界诱导促使真皮细胞中氧化水平提高 是细胞损伤的主要因素，氧化水平提高的直接结果是降低了 I型胶原蛋白的表达及I型胶原 蛋白被基质金属蛋白酶MPP-1降解，两种情况造成的结果均为I型胶原蛋白在皮肤中的含量 减少，而I型胶原蛋白含量减少是皮肤形成皱纹的主要原因。
[0087]由表2可知，向HDF细胞中添加本发明提供的浓度为0.01mg/mL樟子松树皮提取物 后，皮肤中的I型胶原蛋白含量相对于不加樟子松树皮提取物时提高了6.6 %。向HDF细胞中 添加本发明提供的浓度为〇.〇lmg/mL樟子松树皮提取物后，皮肤中的I型胶原蛋白含量相对 于不加樟子松树皮提取物时提高了 2.2%。说明樟子松树皮提取物能够促进I型胶原蛋白的 表达，并进而起到抗老化的效果，且本发明提供的樟子松树皮提取物比现有技术更能促进I 型胶原蛋白的表达，可以作为潜在的抗老化添加剂添加到化妆品中。
[0088] 过氧化氢对HDF细胞存活率的影响
[0089] 选取不同浓度的过氧化氢，如 50μΜ、100μΜ、200μΜ、400μΜ、600μΜ、800μ]\^Ρ1000μΜ， 与HDF细胞共同孵育不同时间，如3h、6h和9h等，采用ΜΤΤ法检测不同浓度的过氧化氢对HDF 细胞存活率的影响。
[0090] 取培养至浓度为1〇5个/mL的HDF细胞，接种于96孔细胞培养板，每孔100yL。于37 °C、含有C〇2的培养箱中贴壁培养6h，每孔做复孔3个。
[0091]使用不同浓度的过氧化氢分别孵育造模3h、6h和9h;向每个样品孔中加入浓度为 0.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、含有C02的培养箱中，黑暗条件下孵育4h。
[0092] 去除上清液，向样品中加入150yL DMS0,震荡，以570nm为实验波长，630nm为参照 波长，检测每个样品的吸光度，计算细胞存活率。
[0093] 测试结果如图1所示，人HDF细胞于浓度为50-800μΜ的过氧化氢共孵育3-9h后，人 HDF细胞的存活率明显下降，当孵育浓度超过400μΜ时，细胞存活率低于50%，200μΜ过氧化 氢作用6h后，细胞存活率降到70 %。
[0094] 樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞存活率的影响 [0095] 取培养至密度为105个/mL的HDF细胞接种于96孔板，每孔100yL。于37°C，含有C02的 培养箱中贴壁培养6h，加入本发明提供的樟子松树皮提取物，利用过氧化氢损伤建模，并向 每孔加入〇.5mg/mL的MTT 100yL，于37°C、5%⑶2的黑暗条件下孵育4h。去除上清液，加入 DMS0 150yL，震荡检测吸光度，计算细胞存活率。
[0096] 如图2所示，经过200μΜ过氧化氢作用6h后，HDF细胞的存活率降低至70 %以下，而 向经过过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入本发明提供的樟子松树皮提取物后，人HDF细胞的 存活率达到82.44%，向经过氧化氢损伤过的HDF细胞中加入现有技术制备的樟子松树皮提 取物后，人HDF细胞的存活率为72%，即本发明提供的樟子松树皮提取物相对于现有技术制 备的樟子松树皮提取物更利于过氧化氢损伤细胞的修复。
[0097] 樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤的HDF细胞基质金属蛋白酶的影响 [0098] 材料与试剂
[0099]细胞培养液 24孔细胞培养板
[0100]细胞培养箱 过氧化氢
[0101] 离心机 ELISA试剂盒
[0102] 测试步骤
[0103 ] 本测试分为标准组、空白组、实验组和对照实验组。
[0104]取对数生长期的浓度为1〇5个/mL的HDF细胞接种于24孔培养板中，每孔lmL，于37 °C，含有C02的细胞培养箱中培养6h。
[0105] 向实验组加入本发明提供的樟子松树皮提取物，向实验对照组加入采用对比实施 例所述方法制备的樟子松树皮提取物，向标准组加入标准液，空白组不添加样品。
[0106] 诱导建立过氧化氢损伤模型。小心吸取上清液培养基，离心，按照试剂盒说明书， 取10yL细胞悬液进行实验。以空白孔调零，在反应终止后15min内，用450nm波长测量各孔的 吸光度。根据标准品对应的基质金属蛋白酶(MMP-1)的浓度及对应的吸光度值，计算出标准 曲线的直线回归方程，再根据样本的吸光度值，在回归方程上计算出实验组中MMP-1的浓度 结果如表3和图3所示。
[0107] 表3，樟子松树皮提取物对过氧化氢损伤HDF细胞MMP-1浓度的影响
[0108]
由表3和图3所示，经过过氧化氢刺激后，人HDF细胞中的MMP-1水平显著上升，由100升 高至167.21，如表3中阴性对照组所示；向经过过氧化氢刺激的人HDF细胞中加入本发明提 供的樟子松树皮提取物后，MMP-1的含量降低至151.48，MMP-1的浓度降低了近12%，而加入 采用现有技术制备的樟子松树皮提取物后，MMP-1的含量为160。这说明，本发明提供的樟子 松树皮提取物与现有技术制备的樟子松树皮提取物相比，具有更优异的抑制MMP-1表达的 性能。
[0109] 樟子松树皮提取物的保湿性能
[0110] 皮肤内水分的含量的多少，直接影响皮肤的弹性、光泽度等，皮肤的表皮、真皮、皮 下组织均对皮肤维持水分起着不同的作用。在皮肤保湿过程中，主要有两种机制影响皮肤 对水的维持作用：
[0111] 1)皮肤作为天然屏障，避免水分流失；
[0112] 皮肤表皮是人的天然屏障，其中透明层、颗粒层和角质层对皮肤锁水能力起到重 要作用。透明层含有磷脂类物质和角质蛋白，能够防止水分及电解质等透过皮肤。颗粒层的 细胞排列致密，对贮存水分、防止水分渗透具有重要的作用。角质层是由角质形成细的坚 韧、有弹性的板层结构，细胞内充满了角蛋白。
[0113] 2)皮肤中存在许多保湿因子，吸收和锁住水分。
[0114] 樟子松树皮提取物对HDF细胞透明质酸合成酶(HAS3)表达量的影响
[0115] 正常皮肤中，HA主要由HAs合成，HAs主要包括三种，分别为说31、说82、说33，其中 HAS3的催化活性最大，且催化生成小分子量的HA(200-300ku)，而HA是已知的保湿能力最强 的物质，因此，皮肤中HAS3的含量提高能够间接促进皮肤的保湿能力。
[0116] 本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。
[0117] 取对数生长期、浓度为105个/mL的HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每孔 细胞液lmL，于37°C、含有C0 2的细胞培养箱中培养6h。
[0118] 向实验组细胞液中加入一定量本发明提供的樟子松树皮提取物，向对照实验组细 胞液中加入等量采用对比实施例所述方法制备的樟子松树皮提取物，空白组不加样品，置 于37 °C、含有5 % C02及饱和湿度的细胞培养箱中分别培养24h;
[0119] 弃除上清液，用预冷ros冲洗细胞两次，在培养孔中加入100yL裂解液，冰上裂解细 胞lOmin，收集细胞裂解液，以13000rpm离心10min，取上清液备用。
[0120] 按照ELISA试剂盒说明书，取细胞裂解液进行试验；
[0121]利用BCA试剂盒检测不同组别蛋白质含量，各组HAS3表达量采用蛋白量矫正，结果 如表4和图4所示。
[0122] 表4，樟子松树皮提取物对HAs3表达的影响
[0123]
[0124]
[0125] 由表4和图4可知，相对于未加入樟子松树皮提取物，向人HDF细胞中添加本发明提 供的樟子松树皮提取物后，HAS3含量提高了 33%。相对于采用现有技术制备的樟子松树皮 提取物，向人HDF细胞中添加本发明提供的樟子松树皮提取物后，HAS3含量提高了近15 %， 说明本发明提供的樟子松提取物保湿性能显著。
[0126] 樟子松树皮提取物对透明质酸分泌的影响
[0127] 在皮肤真皮层中，透明质酸(HA)是含量较多的氨基多糖，HA粘稠度极高且能高比 例地结合水分子，HA的含量直接影响皮肤中水分的含量。作为皮肤内重要的保湿成分，它对 皮肤细胞的增殖、分化有显著作用，对维持皮肤细胞的正常新陈代谢至关重要。
[0128] 本测试分为空白组、实验组、对照实验组和标准组。
[0129] 取对数生长期的浓度为105个/mL的人HDF细胞，将培养的细胞接种于24孔板中，每 孔细胞液lmL，于37 °C、含有C02的细胞培养箱中培养6h，置于37 °C、含有5 %C02及饱和湿度的 细胞培养箱中分别培养24h;小心收集上清培养基，离心后得到上清液，备用。
[0130] 向标准组中加入50yL标准液，向实验组中加入10yL上清液和40yL本发明提供的樟 子松树皮提取物的稀释液，向对照实验组中加入l〇yL上清液和40yL采用对比实施例所述方 法制备的樟子松树皮提取物的稀释液，空白组中不加样品，分别于37°C孵育lh，并洗板5次。
[0131] 向四组样品中分别加入显色剂A和显色剂B各50yL，于37°C避光孵育30min，向四组 样品中加入终止液50yL。
[0132] 以空白组调零，在终止反应后15min内，在450nm波长测量各组的吸光光度值，并根 据吸光度值计算细胞液中HA的含量，结果如表5所示。
[0133] 表5，樟子松树皮提取物对HA分泌的影响
[0134]
[0135] 由表5和图5可知，添加本发明提供的樟子松树皮提取物后，人HDF细胞中HA含量比 未加入樟子松树皮提取物时，提高了 17% ;比添加现有技术制备的樟子松树皮提取物，提高 了 10.2%，说明本发明提供的樟子松树皮提取物比现有技术制备的樟子松树皮提取物更能 够促进HDF细胞分泌HA，有效保持细胞中水分，并进而起到保湿的作用。
[0136] 樟子松树皮提取物的美白作用
[0137] 酪氨酸酶是黑素合成的主要限速酶，通过抑制酪氨酸酶的活性，可以减少黑素的 生成，酪氨酸酶活性检测方法有:放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，以生化酶学法 较为简单成熟。生化酶学法测定酪氨酸酶活性抑制的原理是:酪氨酸或多巴酸在酪氨酸酶 的作用下转化为多巴醌，通过比色法测定判断酪氨酸酶活性的抑制率，该方法通过体外测 定酪氨酸酶的活性，简单快捷。
[0138] 材料与试剂 蘑菇酪氨酸酶 PH值=6.8的磷酸盐缓冲液 左旋多巴（L-DOPA) 200μΙ_吸头
[0139] 96孔板 8通道加样枪 酶标仪
[0140] 操作步骤
[0141] 测定本发明提供的樟子松树皮提取物的酪氨酸酶抑制作用
[0142] 本测试分为空白组、空白参照组、实验组和实验参照组。
[0143] 配制质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，配制pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0144] 向实验组中加入5yL浓度为0. lmg/mL的本发明提供的樟子松树皮提取物，向实验 参照组中加入5以1^浓度为0. lmg/mL的本发明提供的樟子松树皮提取物和45yL pH值=6.8的 磷酸盐缓冲溶液，向空白参照组加入5yL蘑菇酪氨酸酶的磷酸盐溶液，和45yL pH值=6.8的 磷酸盐缓冲溶液，向空白组加入50yL pH值=6.8的磷酸盐缓冲溶液。
[0145] 置于37 °C空气浴中20min，向每孔加入50yL、质量浓度为0.1 %的L-D0PA水溶液，于 37°C空气浴中静置20min，于475nm下测定每组的吸光度值，并计算本发明提供的樟子松树 皮提取物对蘑菇酪氨酸酶的活性抑制率。
[0146]
[0147] 采用相同的测试方法计算采用对比实施例(现有技术)制备的樟子松树皮提取物 以及阳性对照组曲酸对酪氨酸酶的抑制率。
[0148] 结果如图6所示，本发明提供的樟子松树皮提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率分别 为49.4%，采用现有技术制备的樟子松树皮提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制率为36.5%，说 明本发明提供的樟子松树皮提取物具有显著抑制黑素的作用，能够作为美白添加剂添加到 化妆品中。
[0149] 综上所述，本发明提供的樟子松树皮提取物在人体细胞可耐受的范围内，除了具 有优良的保湿作用外，还能够起到抗老化、美白及去除自由基的作用，可以作为化妆品添加 剂，同样的，也可以制作成口服试剂或膏剂，而起到相应的作用。
[0150] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述化妆品和/或护肤品包括樟子松树皮提 取物，所述樟子松树皮提取物的含量为0.001-50%。2. 根据权利要求1所述的化妆品和/或护肤品，其特征在于，所述樟子松树皮包括樟子 松多酚、原花青素、多糖和苷类化合物中的任意一种或几种组合物。3. -种樟子松树皮提取物，其特征在于，所述樟子松树皮包括樟子松多酚、多糖及苷类 化合物中的任意一种或几种组合物。4. 根据权利要求3所述的樟子松树皮提取物，其特征在于，所述樟子松多酚的质量含量 为 10%-80%〇5. 根据权利要求3所述的樟子松树皮提取物，其特征在于，所述所述樟子松多酚包括黄 酮类化合物和原花青素中的任意一种或几种组合。6. -种如权利要求3-5任一项所述樟子松树皮提取物的制备方法，其特征在于，所述方 法包括如下步骤： 步骤1、向樟子松树皮中加入10-20倍体积倍率的溶媒，提取2-10次，每次1.5-3h，得到 提取液； 步骤2、混合每次提取的提取液，得混合提取液，所述混合提取液经减压浓缩得到浓缩 液，所述浓缩液即为所述樟子松树皮提取物。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2中减压浓缩后还包括纯化、干 燥、消毒、杀菌等中的任意一种或几种，所述杀菌过程采用热空气灭菌、水蒸气灭菌、辐射灭 菌、5%石炭酸、70%乙醇溶液、50%甲醇水溶液中的任意一种或几种组合。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述干燥步骤为喷雾干燥，所述喷雾 干燥的条件为高压栗在80_120MPa压力下将所述浓缩液通过雾化器形成100-200nm的颗粒， 所述颗粒与60_100°C的热空气接触5-50s。9. 一种如权利要求3-5所述樟子松树皮提取物的应用，其特征在于，将所述樟子松树皮 提取物制备成施用于皮肤外表面的制品。10. 根据权利要求9所述的樟子松树皮提取物应用，其特征在于，所述制品中所述樟子 松树皮提取物的质量含量为0.001-50%。
【文档编号】A61Q19/00GK106038406SQ201610520518
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】洪民华, 刘丹, 张营, 洪奇, 吕智, 卢艳花, 何浩, 朱理
【申请人】上海相宜本草化妆品股份有限公司, 华东理工大学