Artalbic acid的衍生物的组合物用于制备抗肝纤维化药物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基与O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物的组合物在抗肝纤维化药物中的应用，本发明涉及有机合成和药物化学领域。本发明公开并提供了一种由Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基与O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物按照质量比为30：70组成的组合物以及将上述化合物按照30：70的质量比进行混合从而制备本发明组合物的方法。药理学实验表明，本发明提供的这种组合物在20ug/ml时能够显著抑制NIH/3T3增殖以及转化生长因子?β1诱导的成纤维细胞增殖，具有抗肝纤维化的作用，因此本发明还提供了Artalbic acid的O?(二氯乙胺基)乙基与O?(二(2?甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物按照质量比为30：70组成的组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途。
【专利说明】
Arta I b i c ac i d的衍生物的组合物用于制备抗肝纤维化药物
技术领域
[0001] 本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是慢性肝损伤向肝硬化发展的动态过程，表现为细胞外基质(ECM)大量 合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫沉积。其起始于肝细胞(HC)坏死， 随之是炎症反应、纤维生成介质释放，肝星状细胞(FSC)激活，最终以肝脏结缔组织成分的 合成与降解明显失去平衡。肝纤维化是多种慢性肝病共同的病理过程，是影响预后的重要 因素。
[0003] 过去的20年间，肝纤维化的研究取得了长足进展，证实肝纤维化与一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年来陆续出现了一些抗肝纤维化治疗方法，包括化学药、生物制剂、中 药与基因疗法等，但是理想的临床治疗手段仍然缺乏(刘平.加强抗肝纤维化作用机制的研 究.中华肝病杂志，2005，8(13): 561)。目前防治肝纤维的关键是针对与肝星状细胞激活相 关的环节，主要是:减轻肝损伤;抑制星状细胞激活，减少细胞外基质产生;调节细胞因子紊 乱，促进活化肝星状细胞凋亡；抑制肝脏成纤维细胞的增殖以及星状细胞激活大量分泌诱 导肝脏成纤维细胞的增殖。
[0004] 从天然产物中寻找化合物或先导化合物并进行结构修饰获得其衍生物，从而得到 高效低毒的潜在药物最有重要价值。
[0005] 本发明涉及的化合物I是一个2011年发表（Antonella Maggio et al .， 2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily·Tetrahedron Letters，52(2011 )4543-4545)的化合物，我 们对化合物I进行了结构修饰，获得了两个新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合 物III和化合物IV制备了组合物并对该组合物抗肝纤维化活性进行了评价，其具有抗肝纤 维化活性。
[0006] 由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是 TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞 上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
【发明内容】
[0007] 本发明公开了一个新的组合物，该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物 中化合物III和化合物IV的质量百分数分别为30%和70%。
[0008]
[0009] 本发明公开的组合物可以制成药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
[0010] 药效学实验表明，本发明的组合物具有较好的抗肝纤维化作用。本发明的药学上 可接受的盐具有同样的药效。
[0011] 进一步的，组合物的体外实验表明，组合物具有很强的抗成纤维细胞增殖的活性， 因此本发明的组合物有望被用于制备新型抗肝纤维化药物。
[0012] 进一步的，组合物的体外实验表明，组合物具有很强的抗生长因子诱导的成纤维 细胞增殖的活性，组合物是一个极具开发潜力的化合物，它可直接用于相应疾病的治疗以 及相关药物的制备。
[0013] 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1化合物Artalbic acid的制备
[0015] 化合物Artalbic acid(I)的制备方法参照Antonella Maggio等人发表的文献 (Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily. Tetrahedron Letters ,52 (2011)4543-4545)的方法。
[0016]
[0017] 实施例2 Artalbic acid的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0018] 将化合物1(26611^，1.00111111〇1)溶于1011^苯，向溶液中加入四丁基溴化铵〇8八8) (0.088)，1，2-二溴乙烧(3.76(^，20.00_〇1)和61]1]^的50%氢氧化钠溶液。混合物在40摄氏 度搅拌lehieh之后将反应液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取两次，合并有机相溶液。然 后对有机相溶液依次用水和饱和食盐水洗涤5次，再用无水硫酸钠干燥，最后减压浓缩去除 溶剂得到产物粗品。产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为:石油醚/丙酮= 100:1.0，v/V)， 收集棕色集中洗脱带并挥去溶剂即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73% )。
[0019] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.41(s,lH),6.06(s,lH),5.76(s,lH),4.99(s,lH), 4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H), 2.10(s,lH),1.64(s,3H),1.54(s,lH),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
[0020] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05 (s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s), 33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
[0021] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci7H26Br〇4：373.1014；found 373.1017.
[0022]
[0023] 实施例3 Artalbic acid的0_(二氯乙胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0024] l、Artalbic acid的0_(二轻乙胺基）乙基衍生物的合成
[0025] 将化合物II(187mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾(690mg， 5.0mmol)，碘化钾（252mg，1.5mmol)和二乙醇胺（1051mg，lOmmol)，混合物加热回流lh。反应 结束后将反应液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有机相。依次用水和饱和 食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除溶剂得到产物粗品。 产物粗品用硅胶柱层析纯化(流动相为:石油醚/丙酮=100: l.〇，v/v)，收集黄色集中洗脱 带并挥去溶剂即得到化合物Artalbic acid的0_(二轻乙胺基）乙基衍生物的淡黄色固体 (146.9mg,74%)〇
[0026] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl8.72(s，lH)j6.11(s，lH)，5.80(s，lH)，5.14(s，lH)， 4.73(s,lH),4.63(s,lH),3.57(s,2H),3.45(s,4H),2.70(d,J=15.6Hz,3H),2.60(s,4H), 2.50(s,2H),2.46(s,2H),2.33(s,lH),1.88(s,2H),1.68(s,3H),1.62(d,J=19.9Hz,3H), 1.02(s,3H).
[0027] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5202.01(s),176.11(s),149.21(s),148.55(s),117.15 (s),109.60(s),81.93(s),67.25(s),59.28(s),57.88(s),56.83(s),53.74(s),41.36(s), 39.24(s),38.93(s),35.88(s),30.82(s),20.61(s),18.49(s).
[0028] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2iH36Ni〇6:398.2543;found:398.2547〇
[0029]
[0030] Artalbic acid的0_(二轻乙胺基）乙基衍生物
[0031] 2、Artalbic acid的0_(二氯乙胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0032] 合成足够多的Artalbic acid的0_(二轻乙胺基）乙基衍生物，将Artalbic acid的 〇-(二轻乙胺基）乙基衍生物(0. l〇〇g，〇. 5mmol)溶于4mL氯仿，逐滴加入氯化亚砜(0.238g， 2mmol)，反应物加热回流2h。将反应物冷却至室温，滴加甲醇分解过量的氯化亚砜，减压浓 缩除去溶剂。产物经硅胶柱层析纯化(石油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得到化合物III的淡黄色 固体（145.4mg，67%)。
[0033] 4 NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl3.05(s，lH)，S6.05(s，lH)，5.75(s，lH)，4.67(s，2H)， 4.58(d,J = 7.5Hz,lH) ,3.68(s,4H) ,3.50(s,2H) ,2.86(s,2H) ,2.74(s,2H) ,2.62(d,J = 0.9Hz,3H),2.44(s,2H),2.38(s,2H),2.22(s,lH),1.61(s,3H),1.49(s,lH),1.42(s,2H), 0.95(s,3H).
[0034] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.68(s),175.56(s),148.88(s),147.80(s),116.82 (s),109.05(s),81.60(s),66.70(s),57.44(s),55.79(s),53.30(s),41.03(s),39.21(s), 38.80(s),38.49(s),35.44(s),30.38(s),20.17(s),18.05(s).
[0035] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C2iH34Cl2N〇4+:434.1865;found:434.1861。
[0036]
[0037] 实施例4 Artalbic acid的0_(二（2-甲硫基乙基）胺基）乙基衍生物（III)的合成
[0038] 制备足够多的化合物III，将化合物III(0.217g，0.5mmol)溶于10mL乙醇，室温下 加入甲硫醇钠(〇.21g，3mmol)，反应物加热回流2h。减压浓缩除去溶剂，所得产物用硅胶柱 层析进行纯化(石油醚/丙酮1 〇〇: 〇. 3，v/v)，得到黄色固体物，即化合物IV(0.158g，69%)。
[0039] 4 MMR(500MHz，Chloroform-dl)Sl8.86(s，lH)，6·14(s，lH)，5.82(s，lH),5.33 (s，lH)，4.75(s，lH)，4.62(s，lH)，3.54(s，2H)，2.86(s，lH)，2.72(dd，J=18.2,6·8Ηζ, 11H),2.50(s,2H),2.39(s,2H),2.12(s,6H),1.71(s,3H),1.56(s,2H),1.41(s,lH),1.06 (s,3H).
[0040] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.96(s),175.97(s),149.17(s),148.22(s),117.11 (s),109.47(s),81.85(s),67.07(s),57.69(s),53.56(s),52.49(s),41.29(s),39.00(s), 38.79(s),35.63(s),32.15(s),30.74(s),20.43(s),18.43(s),14.87(s).
[0041] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C23H4〇N〇4S2+:434.1865；found:434.1863〇
[0042]
[0043] 实施例5组合物抗肝纤维化活性
[0044]由于肝脏星状细胞的激活，从而引起了多种生长因子的大量分泌，这些生长因子 会诱导肝脏成纤维细胞的快速增殖，从而加速纤维化，其中最重要的生长因子之一就是 TGF。因此，筛选抗肝纤维化药物的一个重要思路就是筛选能够抑制肝脏成纤维细胞增殖的 药物或者筛选能够抑制TGF等生长因子诱导的成纤维细胞的增殖，筛选常常在成纤维细胞 上进行，NIH/3T3细胞是最常用的细胞株。
[0045] 组合物的制备：将研磨之后过200目网的30mg化合物III的粉末和研磨之后过200 目网的70mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混合即得到100mg组合物， 使用时用水溶解这l〇〇mg的组合物即得到组合物的溶液。
[0046]实验例1:组合物对成纤维细胞NIH/3T3增殖的抑制作用 [0047] 一、实验方法：
[0048] NIH/3T3细胞株购自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海细胞所细胞库。
[0049] 将对数生长期的亚融合的NIH/3T3细胞用0.25%胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM 培养液(含l〇%FCS)制成lX104cell/ml的细胞悬液，台盼蓝染色鉴定存活率大于95%，按 每孔100ul加入96孔板中，在37°C、5%⑶ 2培养24h同步处理后，弃上清，加入含有药物的 DMEM培养液（含10%FCS)200ul，培养48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。弃去培养液，加入 150ulDMS0，振荡10分钟，使结晶溶解，酶标仪490nm处读取0D值，结果以0D49Q表示。
[0050] 二、实验结果：
[0051 ] 1、形态学观察
[0052] NIH/3T3在用药前伸展良好，折光性较弱，有方向性，呈放射状，细胞增殖的速度 快;而加组合物24h后，成纤维细胞数目减少，形状变得不规则，突起变短，细胞排列混乱，细 胞内代谢产物增多。化合物III和化合物IV无此作用。
[0053] MTT法检测组合物对NIH/3T3细胞增殖的抑制作用。
[0054] 表1 :MTT法检测组合物对NIH/3T3增殖的抑制作用 [0055]
[0057] 注:*，与细胞阴性对照P〈0.05
[0058] 结果:组合物在20ug/ml对成纤维细胞NIH/3T3的细胞增殖有显著的抑制作用。表 明组合物体外对成纤维细胞的增殖有显著抑制作用。化合物III和化合物IV无此作用。
[0059] 实验例2:组合物对转化生长因子-iMTGF-fo)诱导的成纤维细胞增殖的抑制作用
[0060] TGF-&是促进细胞增殖和胶原生成的强活性因子，在细胞中加入TGF-β dOng/ml 刺激细胞增殖，再检测药物对TGF-β 1诱导的细胞增殖的抑制作用，以分析判断组合物的作 用机理。
[0061 ] 表2 :MTT法检测组合物对TGF诱导NIH/3T3增殖的抑制作用
[0062]
[0063] 注:*，与细胞+TGF 对照Ρ〈0·05
[0064] 结果：组合物在20ug/ml对成纤维细胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF-fo的诱导下的细胞增殖有显 著的抑制作用，化合物III和化合物IV无此作用。表明组合物体外对纤维细胞增殖的抑制作 用可能是通过干预TGF信号通路实现的。
[0065] 结论:组合物对成纤维细胞NIH/3T3在10 %小牛血清的刺激下的细胞增殖有显著 的抑制作用；组合物对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-fo的诱导下的细胞增殖有显著的抑制作 用。组合物可以用来制备抗肝纤维化药物。化合物III和化合物IV对成纤维细胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的细胞增殖无显著的抑制作用，对成纤维细胞NIH/3T3在TGF-比的 诱导下的细胞增殖无显著的抑制作用，不可以用来制备抗肝纤维化药物。
[0066] 实施例6本发明所涉及组合物片剂的制备
[0067] 取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
[0068] 实施例7本发明所涉及组合物胶囊的制备
[0069] 取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100粒。
【主权项】
1. 一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物 III和化合物IV的质量百分数分别为30%和70%，2. 如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为:将化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照质量百分数分别为30%和70%充分混合。3. -种如权利要求1所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述组合物抑 制成纤维细胞增殖。5. 如权利要求3所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述组合物抑 制生长因子诱导的成纤维细胞增殖。6. 如权利要求5所述的组合物在治疗肝纤维化药物中的应用，其特征为所述生长因子 为TGF-01。
【文档编号】C07C323/25GK106038527SQ201610474940
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】丁秋菊
【申请人】南京海澳斯生物医药科技有限公司