睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及睡莲花提取物技术领域，是一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用；本发明睡莲花总黄酮提取物所含黄酮含量的重量百分比在50%至80%，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%至3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%至16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%至8.0%。本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔树脂和聚酰胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易于工业化生产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低毒，可应用于肝损伤的防治。
【专利说明】
睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及睡莲花提取物技术领域，是一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和 应用。
【背景技术】
[0002] 由病毒、酒精、药物等多种因素引起的肝损伤是临床上的常见疾病，严重或持续的 肝损伤可导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌等疾病，防治肝损伤是临床肝病治疗的重要任 务，近几十年来从中药民族药以及天然药物中寻找具有防治肝损伤的活性部位活性成分已 成为肝病治疗药物研发的热点领域。睡莲花为睡莲属植物雪白睡莲Nymphaea Candida Presl的干燥花蕾，具有清热解毒、镇静安神之功效，用于感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽 痛等疾病的治疗，收载于《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册》，是维吾尔医治疗炎症 性和病毒性疾病的首选药物之一。睡莲花提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化和神经保护等多种 药理作用。黄酮类化合物是睡莲花所含的主要特征性成分，也是睡莲花发挥药效的主要物 质基础。金晓红等报道了睡莲花总黄酮的超声提取工艺，但对其分离纯化工艺却至今未见 有文献报道。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种睡莲花总黄酮提取物及其制备方法和在制备防治肝损伤药物 中的应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决睡莲花分离纯化工艺空白的问题。
[0004] 本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物，所 含黄酮含量的重量百分比在50%至80%，isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%至 3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%至16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%至 8.0%〇
[0005] 下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：
[0006] 上述睡莲花总黄酮提取物按下述方法得到:第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花 加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏;第二 步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次 用去离子水、体积百分比为30%的乙醇和体积百分比为50%至70%的乙醇洗脱，收集体积 百分比为50 %至70 %乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加 去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗 脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后， 得到睡莲花总黄酮提取物。
[0007] 上述第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍； 或/和，每次提取时间为〇.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30%至80% 的乙醇水溶液。
[0008] 上述睡莲花为雪白睡莲Nymphaea Candida Pres 1的干燥花蕾。
[0009] 上述第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相对密度为 1.1至1.2后，得到一次浸膏。
[0010] 上述第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释 液;或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为 30%的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50%至70% 的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍;或/和，体积百分比为30%的乙醇 水溶液和体积百分比为50 %至70 %的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时 至3个大孔树脂柱柱体积/小时;或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25°C 下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
[0011]上述第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释 液;或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液 为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的 5倍至8倍;或/和，体积百分比为50 %至70%的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱 体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时;或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为 25 °C下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40 °C至50 °C。
[0012] 上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰 胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
[0013]本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物的制 备方法，按下述步骤进行:第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回 流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏;第二步，将一次浸膏加去离子 水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比 为30 %的乙醇和体积百分比为50 %至70 %的乙醇洗脱，收集体积百分比为50 %至70 %乙醇 洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏;第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释 液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇 水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。 [0014]下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
[0015]上述第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍； 或/和，每次提取时间为〇.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30%至80% 的乙醇水溶液。
[0016] 上述睡莲花为雪白睡莲Nymphaea Candida Pres 1的干燥花蕾。
[0017] 上述第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相对密度为 1.1至1.2后，得到一次浸膏。
[0018] 上述第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释 液;或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为 30%的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50%至70% 的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍;或/和，体积百分比为30%的乙醇 水溶液和体积百分比为50 %至70 %的乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时 至3个大孔树脂柱柱体积/小时;或/和，在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25°C 下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
[0019] 上述第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释 液;或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液 为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的 5倍至8倍;或/和，体积百分比为50 %至70%的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱 体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时;或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为 25 °C下的相对密度为1.10至1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40 °C至50 °C。
[0020] 上述大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和，聚酰 胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
[0021] 本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种睡莲花总黄酮提取物在制 备防治肝损伤药物中的应用。
[0022] 本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔树脂和聚酰 胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易于工业化生 产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低毒，可应用 于肝损伤的防治。
【具体实施方式】
[0023]本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。
[0024]实施例1，该睡莲花总黄酮提取物，所含黄酮含量的重量百分比在50 %至80%， isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%至3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%至 16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%至8.0%。
[0025]实施例2,该睡莲花总黄酮提取物，所含黄酮含量的重量百分比在50 %或80%， isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%或3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%或 16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%或8.0%。
[0026]实施例3，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，选取睡莲花为原 料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一 次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸 附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30%的乙醇和体积百分比为50%至70%的乙醇 洗脱，收集体积百分比为50%至70%乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三 步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用 去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱 液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。
[0027]实施例4,作为上述实施例的优化，第一步中，每次回流提取时乙醇水溶液的加入 量为睡莲花质量的6倍至20倍;或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回流提取时乙醇水溶 液为体积百分比为30 %至80 %的乙醇水溶液。
[0028] 实施例5,作为上述实施例的优化，睡莲花为雪白睡莲Nymphaea Candida Presl的 干燥花蕾。
[0029] 实施例6,作为上述实施例的优化，第一步中，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在 温度为25°C下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。
[0030] 实施例7,作为上述实施例的优化，第二步中，一次浸膏和去离子水按质量比为1:2 至1:10稀释后得到第一稀释液;或/和，第二步中，去离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积 的5倍至10倍，体积百分比为30%的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10 倍，体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液的上样量为大孔树脂柱柱体积的5倍至8倍;或/ 和，体积百分比为30 %的乙醇水溶液和体积百分比为50 %至70 %的乙醇水溶液的流速为 〇. 5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时;或/和，在第二步中，乙醇洗 脱液浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.10至1.20后，得到二次浸膏。
[0031] 实施例8,作为上述实施例的优化，第三步中，二次浸膏和去离子水按质量比为1:2 至1:10稀释后得到第二稀释液;或/和，第三步中，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体 积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱 量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍;或/和，体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液的流 速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱体积/小时;或/和，第三步中， 乙醇洗脱液浓缩至在温度为25 °C下的相对密度为1.10至1.20,干燥时间为12h至16h，干燥 温度为40°C至50°C。
[0032] 实施例9,大孔树脂为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂；或/和， 聚酰胺树脂为14目至30目聚酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。
[0033] 实施例10,该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花 10.〇kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时 乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的8倍，每次提取时间为lh，每次回流提取时乙醇水溶液 为体积百分比为70%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的 相对密度为1.10后，得到一次浸膏;第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得 到第一稀释液，第一稀释液对D101型大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子进行洗脱，去离 子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30%的乙醇水 溶液进行洗脱，再用体积百分比为70%的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30%的乙醇 水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，体积百分比为70%的乙醇水溶液的洗脱量为 大孔树脂柱柱体积的5倍并收集体积百分比为70%乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25°C下的 相对密度为1.10后，得到二次浸膏;第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后 得到第二稀释液，第二稀释液对30目至60目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进 行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为 70%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积 的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.10,然后在温度为40°C下干燥 12h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉 末，得率为2.52 % ;以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为 74.61 %。高效液相色谱法测定标识性成分isostrict ini in、烟花苷和紫云英苷的含量，分 别为2.39%、15.47%和含量为5.06%。高效液相色谱条件为:AgilentEclipseXDB-C18色 谱柱(250\4.6謹，5以111) ;流动相为乙腈和0.1%磷酸梯度洗脱，0-501^11，乙腈：13%-19%; 流速：1.0ml/min;柱温:30°C ;检测波长:266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄 酮含量为74.61%，isostrictiniin含量为2.39%，烟花苷含量为15.47%，紫云英苷含量为 5.06%〇
[0034] 实施例11，该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花 〇.5kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙 醇水溶液的加入量为睡莲花质量的10倍，每次提取时间为lh，每次回流提取时乙醇水溶液 为体积百分比为50%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的 相对密度为1.15后，得到一次浸膏;第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得 到第一稀释液，第一稀释液对AB-8大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离 子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30%的乙醇水 溶液进行洗脱，再用体积百分比为50%的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30%的乙醇 水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍，体积百分比为50 %的乙醇水溶液的洗脱量为 大孔树脂柱柱体积的5倍并收集体积百分比为50%乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25°C下的 相对密度为1.15后，得到二次浸膏;第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后 得到第二稀释液，第二稀释液对14目至30目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进 行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为 70%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积 的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.15,然后在温度为45°C下干燥 14h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉 末，得率为2.59 % ;以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为 63.62%。高效液相色谱法测定标识性成分isostrict ini in、烟花苷和紫云英苷的含量，分 别为1.53 %、11.02 %和7.35 %。高效液相色谱条件为:Agi lent Eel ipse XDB-C18色谱柱 (250 X 4.6mm，5μπι);流动相为乙腈和0.1 %磷酸梯度洗脱，0-50min，乙腈流速： 1.0ml/min;柱温:30°C ;检测波长:266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄酮含量 为63.62%，丨8〇8奸丨(^丨11^11含量为1.53%，烟花苷含量为11.02%，紫云英苷含量为 7.35%。
[0035] 实施例12,该睡莲花总黄酮提取物按下述制备方法得到：第一步，称取睡莲花 〇.5kg，置于提取罐中，在睡莲花中加入乙醇水溶液煮沸后回流提取3次，每次回流提取时乙 醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍，每次提取时间为lh，每次回流提取时乙醇水溶液为 体积百分比为70%的乙醇水溶液，提取后合并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相 对密度为1.18后，得到一次浸膏;第二步，一次浸膏和去离子水按质量比为1:5稀释后得到 第一稀释液，第一稀释液对roH-ioo大孔树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去 离子水的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比为30%的乙醇 水溶液进行洗脱，再用体积百分比为50 %的乙醇水溶液进行洗脱，体积百分比为30%的乙 醇水溶液的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的8倍，体积百分比为50 %的乙醇水溶液的洗脱量 为大孔树脂柱柱体积的8倍并收集体积百分比为50%乙醇洗脱液，浓缩至在温度为25°C下 的相对密度为1.18后，得到二次浸膏;第三步，将二次浸膏和去离子水按质量比为1: 5稀释 后得到第二稀释液，第二稀释液对30目至60目聚酰胺树脂柱进行吸附，吸附后用去离子水 进行洗脱，去离子水的洗脱量为聚酰胺树脂柱体积的10倍，去离子水洗脱后用体积百分比 为70%的乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱体 积的5倍，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.18,然后在温度为50°C下干燥 16h，干燥后得到睡莲花总黄酮提取物。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物为棕黄色粉 末，得率为2.36 % ;以烟花苷为对照品，在波长为349nm下，紫外分光光度法测定黄酮含量为 57.25%。高效液相色谱法测定标识性成分isostrictini in、烟花苷和紫云英苷的含量，分 别为1.29 %、12.11 %和5.42 %。高效液相色谱条件为:Agi lent Eel ipse XDB-C18色谱柱 (250 X 4.6mm，5μπι);流动相为乙腈和0.1 %磷酸梯度洗脱，0-50min，乙腈流速： 1.0ml/min;柱温:30°C ;检测波长:266nm。本实施例得到的睡莲花总黄酮提取物中黄酮含量 为57.25%，丨8〇8奸丨(^丨11^11含量为1.29%，烟花苷含量为12.11%，紫云英苷含量为 5.42%〇
[0036] 实施例13,该睡莲花总黄酮提取物在制备防治肝损伤药物中的应用。
[0037] 上述实施例得到的本发明睡莲花总黄酮提取物在制备治疗肝损伤药物中的应用 体内药效学试验如下：
[0038] 1试验材料与动物
[0039] 联苯双酯滴丸:北京协和药厂生产，批号:0505010r7，每滴丸含联苯双酯7.5mg;总 蛋白定量(BCA法）、1?^、300、63!1、^)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为 2〇151219、2〇1512〇7、2〇15〇61〇、2〇151112、2〇15〇6〇5 ;11^-10、比-6、了陬-<1、1卩1丫试剂盒均 购自武汉博士德生物有限公司；迈瑞全自动生化分析仪;UV1200紫外可见分光光度计，上海 美谱达仪器有限公司；全波长酶标仪，BIO-RAD，BenchMarkPLUS。
[0040]昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，SPF级，购自新疆医科大学实验动物研究中心，合 格证号为SYXK (新)2011 -0004，使用许可证号为SYXK (新)2011 -0001。
[0041 ] 2睡莲花总黄酮对D-半乳糖胺致化学性肝损伤的防治作用
[0042] 2.1方法
[0043] 2.1.1动物分组与给药
[0044] 昆明种小鼠60只，18~22g，随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、 阳性对照联苯双酯（1501^.1^-1)、睡莲花总黄酮高、中、低(200、100、5011^1^-1)剂量组。 联苯双酯组和总黄酮高、中、低剂量组按l〇ml · kg-Ι体重每日灌胃给药1次，正常组和模型 组每日灌胃等体积的蒸馏水1次，连续灌胃7d。末次给药后，正常组小鼠腹腔注射生理盐水 0.2ml/10g体重，其他各组腹腔注射D-半乳糖胺(80〇11^/1^，0.21111/1(^体重)造模，禁食811 后，摘眼球取血离心，留取血清待检。
[0045] 2.1.2指标测定
[0046] 采用全自动生化仪检测血清ALT和AST活性。采用ELISA法测定血清IL-1KIL-6、 TNF-α和IFN- γ水平。按试剂盒说明书测定肝匀浆中MDA、S0D、GSH和NO含量。
[0047] 2.1.3统计学分析
[0048]应用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据结果以x±s表示，计量资料采用方差 分析，等级资料采用Ridit分析，检验水准a = 〇. 05。
[0049] 2.2 结果
[0050] 2.2.1睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响如表1所示
[0051 ] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性显著增加(P〈0.05)。 与模型组比较，中、高剂量的睡莲花总黄酮（100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清ALT、AST 水平(P〈0.01)，其活性接近于阳性对照联苯双酯，结果说明本发明睡莲花总黄酮具有显著 的保肝降酶作用。
[0052] 2.2.2睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、S0D、GSH和NO的影响如表2所示
[0053] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠肝匀衆MDA、N0水平显著增加(P〈0.01)， SOD和GSH水平显著减少(？〈0.01)。与模型组比较，中、高剂量的睡莲花总黄酮（100、20011^/ kg)均能显著降低小鼠血清MDA水平(？〈0.05，？〈0.01)，其活性优于阳性对照联苯双酯。不同 剂量的睡莲花总黄酮均能显著降低N0水平(P〈0.01)。此外，不同剂量的睡莲花总黄酮能显 著提高GSH水平(？〈0.05，？〈0.01)，中、高剂量的睡莲花总黄酮（100、20011^/1^)均能显著提 高小鼠血清S0D水平(P〈0.05，P〈0.01)。结果显示睡莲花总黄酮在降低MDA和N0水平、改善 S0D和GSH水平上优于联苯双酯。说明本发明睡莲花总黄酮具有较好的抗氧化能力，可通过 抗氧化作用发挥肝保护的作用。
[0054] 2.2.3睡莲花总黄酮对肝损伤小鼠血清11^-1|^即-€[、几-6、正1丫的影响如表3所 示
[0055] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清中的IL-1 β、TNF-α、IL-6和IFN- γ 水平显著提高(Ρ〈〇.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组的睡莲花总黄酮均能显著降低IL-1β水平(P〈0.05)，且呈剂量依赖关系，其降低效果接近于阳性对照联苯双酯组。高剂量组的 睡莲花总黄酮还能显著降低TNF-a、IL-6和IFN- γ水平(P〈0.05)。
[0056] 3睡莲花总黄酮对刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝损伤的保护作用
[0057] 3.1方法
[0058] 3.1.1小鼠急性免疫性肝损伤模型的建立及给药方法
[0059]昆明种小鼠60只，按体重随机分为正常组、模型组、联苯双酯（150mg · kg-Ι)组、睡 莲花总黄酮高、中、低剂量组(200、100、5011^*1^-1)，每组10只。每日灌胃给药1次，正常组 和模型组每日灌胃等体积的蒸馏水1次，连续灌胃l〇d。末次给药后，正常组小鼠尾静脉注射 PBS溶液0.3ml，其他各组按刀豆蛋白A20mg/kg以PBS溶液稀释为0.3ml尾静脉注射造模。禁 食8h后，摘眼球取血，离心15min(3000r · min-1)，分离血清，留取血清待检。
[0060] 3.1.2指标测定
[00611 采用全自动生化仪检测血清ALT和AST活性。采用ELISA法测定血清IL-1KIL-6、 TNF-a和IFN- γ水平。按试剂盒说明书测定肝匀浆中MDA、S0D、GSH和NO含量。
[0062] 3.1.3统计学分析
[0063]应用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据结果以x±s表示，计量资料采用方差 分析，等级资料采用Ridit分析，检验水准a = 〇. 05。
[0064] 3.2结果
[0065] 3.2.1对免疫性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的影响如表4所示
[0066] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清ALT、AST活性显著增加(P〈0.05)。 与模型组比较，低、中、高剂量的睡莲花总黄酮(50、100、200mg/kg)均能显著降低小鼠血清 ALT、AST水平(P〈0.05 )，并呈剂量依赖关系，其活性优于阳性对照联苯双酯。
[0067] 3.3.2对免疫性肝损伤小鼠肝组织中MDA、S0D、GSH和N0的影响如表5所示
[0068] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠肝匀衆MDA、N0水平显著增加(P〈0.01)， SOD和GSH水平显著减少（P〈0.01)。与模型组比较，不同剂量的睡莲花总黄酮（50、100、 200mg/kg)均能显著降低小鼠血清MDA水平(P〈0.05，P〈0.01)，其活性接近于阳性对照联苯 双酯；中、高剂量的睡莲花总黄酮均能显著降低N0水平(P〈0.01)。此外，与模型组相比，不同 剂量的睡莲花总黄酮能显著提高SOD水平(P〈0.05，P〈0.01)，且呈剂量依赖关系；中、高剂量 的睡莲花总黄酮(50、100mg/kg)均能显著提高小鼠血清GSH水平(P〈0.05，P〈0.01)。
[0069] 3.3.3对免疫性肝损伤小鼠血清11^-10、11^-6、了~?-€[和正1丫的影响如表6所示
[0070] 实验结果说明，与空白组比较，模型组小鼠血清中的IL-lf3、TNF_a和IFN- γ水平显 著升高(Ρ〈0.05)。与模型组比较，中、高剂量组的NCTF均能显著降低IL-Ιβ和TNF-a水平(Ρ〈 0.05)。高剂量组的睡莲花总黄酮也能明显降低IL-6和IFN- γ水平(Ρ〈0.05)。
[0071] 结论:药效学研究表明，本发明睡莲花总黄酮提取物对D-半乳糖胺诱导的小鼠化 学性肝损伤和刀豆蛋白Α诱导的小鼠免疫性肝损伤均有较好的防治作用，其作用机制与清 除自由基、抑制脂质过氧化、下调TNF-a、IL-Ιβ、IL-6和IFN- γ水平密切相关，本发明睡莲花 总黄酮提取物可用于肝损伤相关疾病的治疗。
[0072] 综上所述，本发明提供了对睡莲花总黄酮提取物进行分离纯化的方法，采用大孔 树脂和聚酰胺树脂联用的方法从睡莲花中提取黄酮类成分，本发明具有成本低、无污染、易 于工业化生产的优点，同时本发明睡莲花总黄酮提取物具有较好的抗肝炎作用，且高效、低 毒，可应用于肝损伤的防治。
[0073] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据 实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
[0074]
[0075]
【主权项】
1. 一种睡莲花总黄酮提取物，其特征在于所含黄酮含量的重量百分比在50%至80%， isostrictiniin含量的重量百分比在1.2%至3.0%，烟花苷含量的重量百分比在9.0%至 16.0%，紫云英苷含量的重量百分比在4.5%至8.0%。2. 根据权利要求1所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于按下述方法得到：第一步， 选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后回流提取1次至3次，提取后合并提取 液并浓缩，得到一次浸膏；第二步，将一次浸膏加去离子水稀释得第一稀释液，第一稀释液 用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分比为30%的乙醇水溶液和体积百分比 为50%至70%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50%至70%乙醇水溶液洗脱液，乙醇洗脱 液浓缩后得到二次浸膏;第三步，将二次浸膏加去离子水稀释得第二稀释液，第二稀释液用 聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗脱后用乙醇水溶液进行洗脱 并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总黄酮提取物。3. 根据权利要求2所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第一步中，每次回流提取时 乙醇水溶液的加入量为睡莲花质量的6倍至20倍;或/和，每次提取时间为0.5h至3h，每次回 流提取时乙醇水溶液为体积百分比为30%至80%的乙醇水溶液。4. 根据权利要求2或3所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于睡莲花为雪白睡莲 Nymphaea Candida Presl^^FMiS^o5. 根据权利要求2或3或4所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第一步中，提取后合 并提取液并浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.1至1.2后，得到一次浸膏。6. 根据权利要求2或3或4或5所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第二步中，一次 浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第一稀释液;或/和，第二步中，去离子水 的洗脱量为大孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为30%的乙醇水溶液的洗脱量为大 孔树脂柱柱体积的5倍至10倍，体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液的洗脱量为大孔树脂 柱柱体积的5倍至8倍;或/和，体积百分比为30%的乙醇水溶液和体积百分比为50%至70%的 乙醇水溶液的流速为0.5个大孔树脂柱柱体积/小时至3个大孔树脂柱柱体积/小时;或/和， 在第二步中，乙醇洗脱液浓缩，浓缩至在温度为25°C下的相对密度为1.10至1.20后，得到二 次浸膏。7. 根据权利要求2或3或4或5或6所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于第三步中，二 次浸膏和去离子水按质量比为1:2至1:10稀释后得到第二稀释液;或/和，第三步中，去离子 水的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至10倍，乙醇水溶液为体积百分比为50%至70%的 乙醇水溶液，乙醇水溶液的洗脱量为聚酰胺树脂柱柱体积的5倍至8倍;或/和，体积百分比 为50%至70%的乙醇水溶液的流速为0.5个聚酰胺树脂柱柱体积/小时至3个聚酰胺树脂柱柱 体积/小时；或/和，第三步中，乙醇洗脱液浓缩至在温度为25 °C下的相对密度为1.10至 1.20，干燥时间为12h至16h，干燥温度为40 °C至50 °C。8. 根据权利要求2或3或4或5或6或7所述的睡莲花总黄酮提取物，其特征在于大孔树脂 为D101大孔树脂或AB-8大孔树脂或HPD-100大孔树脂;或/和，聚酰胺树脂为14目至30目聚 酰胺树脂或30目至60目聚酰胺树脂。9. 一种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述睡莲花总黄酮提取物的制备方法， 其特征在于按下述步骤进行:第一步，选取睡莲花为原料，将睡莲花加入乙醇水溶液煮沸后 回流提取1次至3次，提取后合并提取液并浓缩，得到一次浸膏;第二步，将一次浸膏加去离 子水稀释得第一稀释液，第一稀释液用大孔树脂柱吸附，吸附后依次用去离子水、体积百分 比为30%的乙醇水溶液和体积百分比为50%至70%的乙醇水溶液洗脱，收集体积百分比为50% 至70%乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩后得到二次浸膏；第三步，将二次浸膏加去离子水稀释 得第二稀释液，第二稀释液用聚酰胺树脂柱吸附，吸附后用去离子水进行洗脱，去离子水洗 脱后用乙醇水溶液进行洗脱并收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩并干燥后，得到睡莲花总 黄酮提取物。10.-种根据权利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的睡莲花总黄酮提取物在制备防 治肝损伤药物中的应用。
【文档编号】A61P1/16GK106038713SQ201610625219
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月2日
【发明人】赵军, 徐芳, 吉腾飞, 李晨阳, 陈燕, 詹羽姣
【申请人】新疆维吾尔自治区药物研究所