一种抗结核分枝杆菌感染的蛋白trim27的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗结核分枝杆菌感染的蛋白TRIM27，属于细胞生物学领域。本发明提供的抗结核分枝杆菌感染的蛋白TRIM27，可以用于开发治疗肺结核的药物，或者JNK/p38信号通路激活剂，或者NF?κB信号通路抑制剂，为新型抗结核药物的研究提供新的思路和分子靶标，尤其在抗结核等多种药物的开发方面将有着广阔的前景。
【专利说明】
一种抗结核分枝杆菌感染的蛋白TRIM27
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种抗结核分枝杆菌感染的蛋白TRIM27，属于细胞生物学领域。
【背景技术】
[0002] 20世纪90年代，由于耐多药结核病(mul-tidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和广泛耐药结核病（Extensively Drug-Resistant Tuberculosis，XDR TB)的出现和全 球性播散，使全球结核病疫情出现回升势头。目前MDR-TB的诊断和治愈率低，同时相当一部 分MDR-TB患者具有很强的传染性，因此全球的MDR-TB防控工作正面临严峻挑战。结核病原 菌结核分枝杆菌(M. tuberculosis，Mtb)是一种典型的胞内菌，它进化出了高效复杂的逃避 或干扰宿主免疫信号通路的方法，只有深入探究结核分枝杆菌胞内存活的分子机制才能为 抗结核药物的研发提供新的作用靶点。
[0003] TRIM27蛋白是TRIM家族中的一员，它拥有RING finger、B-box和coiled-coil三个 保守结构域。该蛋白在细胞质和细胞核中都有定位，其中定位于细胞核的TRIM27蛋白常作 为转录抑制因子抑制目的基因转录。TR頂27蛋白也可在细胞质中起作用，比如作为E3连接 酶介导底物泛素化，进而抑制其下游信号通路等。TRM27蛋白在分枝杆菌感染宿主过程中 发挥怎样的作用，目前尚不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明首先提供了一种抗结核分枝杆菌感染药物，其有效成分是以下(a)或(b)或 (c)：
[0005] (a)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
[0006] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有 抗病原菌胞内存活活性的由(a)衍生的多肽或其类似物；
[0007] (C)与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似 物。
[0008] 本发明通过实验证明：（1)TR頂27能够抑制病原菌结核分枝杆菌的胞内存活。CFU 结果显示，当敲除巨噬细胞U937中TRIM27的编码基因后，结核分枝杆菌在巨噬细胞U937胞 内的存活能力增强；而且，正常的巨噬细胞U937中TRM27的蛋白水平变化趋势与胞内结核 分枝杆菌菌数一致，即当病原菌感染宿主细胞后，胞内TR頂27蛋白水平显著增强，随着菌体 被宿主清除，胞内的TRIM27的蛋白水平也逐渐下降。可见：当病原菌感染宿主细胞后， TRIM27蛋白作为宿主限制因子发挥抗感染作用。（2)通过双荧光素酶报告系统及Western Blotting实验发现在分枝杆菌感染巨噬细胞过程中，TRM27能够显著促进炎性细胞因子的 分泌，同时促进细胞凋亡，进而达到抗病原菌感染的目的。（3)进一步，研究结核分枝杆菌能 够潜伏存活的分子机制，发现结核分枝杆菌中的效应蛋白PtpA会以TRIM27为靶点，抑制其 发挥抗感染作用，抑制TRIM27介导的天然免疫信号通路的活化及细胞凋亡，促进病原菌的 胞内存活，从而实现免疫逃逸。
[0009]本发明成果可以用于开发治疗肺结核的药物，或者JNK/P38信号通路激活剂，或者 NF-kB信号通路抑制剂，为新型抗结核药物的研究提供新的思路和分子靶标，尤其在抗结核 等多种药物的开发方面将有着广阔的前景。此外，本发明成果还对寻找新的抗菌药物靶点 和新药筛选具有重要的理论意义。
【附图说明】
[0010] 图1:TR頂27抑制分枝杆菌胞内存活
[0011] 图2: TRIM27促进宿主炎性细胞因子的分泌
[0012] 图3: TR頂27促进细胞凋亡
[0013] 图4: TRIM27与结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA相互作用
[0014]图5:PtpA抑制TRIM27介导的JNK信号通路的活化及细胞凋亡。
【具体实施方式】
[0015]实施例1TR頂27蛋白抗分枝杆菌感染
[0016] (A)实验方法：用耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)和卡介苗(BCG)分别感染野生型和 敲除TRIM27的巨噬细胞U937，通过对比不同时间点两种巨噬细胞内分枝杆菌CFU变化来证 明TR頂27在抗病原菌感染过程中发挥作用。
[0017] (B)结果:耻垢分枝杆菌M. smegmatis感染巨噬细胞U937细胞2小时后CFU数最高， 随着感染时间延长，分枝杆菌被逐渐清除（图lBhBCG感染U937后CFU数在8小时内逐渐下 降，24小时后CFU数开始上升，原因是BCG中含有很多与结核分枝杆菌相同的效应蛋白开始 发挥干扰宿主天然免疫反应的作用，促进BCG的胞内存活（图1A)。对比野生型和TRIM27敲除 型U937细胞中的CFU差异，结果表明TR頂27正常表达的U937细胞中分枝杆菌清除速度更快， 而TRM27敲除的U937细胞中分枝杆菌存活能力增强，即不同感染时间点的CFU数均显著高 于野生型细胞。
[0018] 实施例2TR頂27促进炎症细胞因子的分泌
[0019] (A)实验方法：用M.smegmatis (图2C，D)和BCG(图2A，B)分别感染野生型和敲除 TR頂27的巨噬细胞U937,通过荧光实时定量PCR检测感染不同时间点细胞因子il8和illb的 基因转录水平变化。
[0020] (B)结果:对比野生型和TRIM27敲除型U937细胞中il8和illb的基因转录水平在不 同感染时间点的变化，结果表明在M. smegmatis和BCG感染过程中，TR頂27干扰的U937细胞 中il8和illb的基因转录水平都明显降低。因此，在分枝杆菌感染巨噬细胞过程中，TRM27 在促进炎性细胞因子的分泌抵抗病原菌感染方面发挥重要作用。
[0021] 实施例3TR頂27促进病原菌感染细胞的细胞凋亡过程
[0022] (A)实验方法：用M.smegmatis分别感染野生型和TRIM27敲除的巨噬细胞，通过 Western blotting检测感染不同时间点凋亡标志蛋白Caspase 3剪切活化程度(Cleaved-caspase 3)变化。
[0023] (B)结果：对比不同感染时间点野生型U937和TRIM27敲除的U937两种细胞中 Cleaved-caspase 3蛋白水平，结果表明TRIM27敲除的U937细胞中Cleaved-caspase 3水平 更低，即TR頂27对细胞凋亡有促进作用（图3)。
[0024] 实施例4Mtb PtpA抑制TRIM27介导的JNK信号通路活化及细胞凋亡
[0025] (A)实验方法：用野生型M. smegmatis和过表达PtpA的M. smegmatis分别感染野生 型U937细胞和TRIM27敲除的U937细胞，分析不同感染时间点JNK、p38的磷酸化水平变化以 及Cleaved-caspase 3水平变化。
[0026] (B)结果：首先通过酵母双杂交实验证实结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA与宿主 TRIM27蛋白相互作用（图4)。进一步对比不同感染时间点细胞中JNK的磷酸化水平以及 Cleaved-caspase 3水平，结果表明PtpA对JNK的磷酸化激活和细胞凋亡都有抑制作用（图 5A)，而当TR頂27敲除后，对JNK的磷酸化和细胞凋亡的抑制作用都变弱了，该结果说明PtpA 通过与TR頂27相互作用抑制其介导的JNK信号通路活化及细胞凋亡过程(图5B)。
[0027]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种抗结核分枝杆菌感染药物，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有抗病 原菌胞内存活活性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (c) 与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。2. -种治疗肺结核的药物，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有抗病 原菌胞内存活活性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (c) 与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。3. -种JNK/p38信号通路激活剂，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有抗病 原菌胞内存活活性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (c) 与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。4. 一种NF-κΒ信号通路抑制剂，其特征在于，其有效成分是以下(a)或(b)或(c): (a) SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列； (b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有抗病 原菌胞内存活活性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (c) 与(a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类似物。 5. TR頂27蛋白在筛选和开发治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
【文档编号】A61P31/06GK106039286SQ201610381995
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】刘翠华, 汪静
【申请人】中国科学院微生物研究所